一组抗原表位多肽及其应用的制作方法

专利名称：：一组抗原表位多肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗原表位多肽，尤其涉及乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，本发明还涉及该抗原表位多肽在防治和诊断乙型脑炎病毒中的应用，属于分子免疫学领域。
背景技术：
：流行性乙型脑炎乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(JapaneseEncephalitisvirus,JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。该病毒首先于1953年在日本从患者脑组织中分离获得，因此称日本脑炎病毒，所致疾病在日本称日本乙型脑炎。在我国最早于1940年分离此病毒，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎,简称乙脑。在世界范围内每年有30,000-50,000例乙脑病例，约25%-30%死亡，50%导致永久性中枢神经系统后遗症。我国近年每年的乙脑病例大于5000例，死亡200例以上。对于流行性乙型脑炎病毒多种动物易感，但除人、马和猪外通常不呈现临床症状。对人主要引起中枢神经系统的急性感染，人感染临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。母猪感染可引起流产、产死胎或木乃伊胎，公猪感染导致睾丸肿大影响繁殖性能为特征，少数猪只感染可能呈现发热和神经症状，而其他猪则大多数不呈显症状。给养猪业造成巨大的经济损失。马属动物易感染，少数引起脑炎与神经症状，马是终末宿主。蚊是JEV的主要传播媒介，猪是该病毒在自然界中最重要的贮存与增殖宿主。乙型脑炎病毒主要在亚洲流行，而最近发现在南半球也有报道，这说明流行性乙型脑炎可能在世界范围内威胁着人类健康。乙型脑炎病毒属黄病毒科，黄病毒属，为单链正链RNA病毒。基因组约llkb，包含一个大的开放阅读框架(ORF),两端是5'端和3'端非编码区(UTR)。基因组5，端有帽子结构，但在3'端没有poly(A)尾。ORF编码含3432个氨基酸的前体蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为10个成熟蛋白，包含3个结构蛋白(C,prM,E),7个非结构蛋白(NS1，NS2A,NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。病毒粒子呈球形，直径约30nm，有嚢膜。JEV只有一个血清型，在抗原性上与西罗病毒、墨罗河谷脑炎病毒、圣路易脑炎病毒等属同一血清群，存在抗原交叉反应。病毒嚢膜糖蛋白具有血凝特性，能凝集鹅、鴒、雏鸡等动物红细胞。病毒对热抵抗力弱，56°C30分钟或100°C2分钟即可灭活，但对低温和干燥的抵抗力很强。乙醚、1:1000去氧胆酸钠以及常用消毒剂均可灭活病毒。在酸性条件下不稳定，适宜pH8.5-9.0。釆用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施。对乙型脑炎病毒抗原表位的研究是开发有效基因工程疫苗以及研究基于抗原表位的诊断检测试剂的理论基础。E蛋白是乙脑病毒粒子表面的一种重要的结构蛋白，是重要的免疫保护性抗原。在保护性抗原中具有中和作用的B细胞抗原表位在刺激机体产生中和性抗体中起重要作用。正确而详细地鉴定抗原表位对疾病的诊断、设计无毒副作用的人工疫苗以及免疫治疗剂等有重要的意义。以前对于乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位的研究有所净艮道，Kolaskar等(KOLASKARAS,KULKARNI-KALEU.PredictionofThree-DimensionalStructureandMappingofConformationalEpitopes'ofEnvelopeGlycoproteinofJapaneseEncephalitisVirus.P7ra/ogy,1999,261(1):31~42)通过对E蛋白抗原表位的三维结构预测，认为E蛋白的三维结构主要由3个结构域组成，结构域I带有血清学及生物活性的抗原表位；结构域n，具有中和活性和血凝活性抗原表位；其中结构域III独立地在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样结构，由于这种构象，许多抗原中和表位都集中于此结构域；Kolaskar和Uraiila(KolaskarAS,UrmilaKK.PredictionofThree-DimensionalstructureandmappingofconformationalepitopesofenvelopeglycoproteinofJapaneseencephalitisvirus.Virology,1999，261:31~42.)用单克隆抗体对JEVE蛋白进行抗原位点分析表明E蛋白至少存在6个抗原决定簇黄病毒科特异性抗原决定族，能诱导产生HI抗体，不产生中和抗体(NA);亚組特异性抗原决定簇，只有NA,无HI产生；亚组特异性抗原决定簇，同时有HI和NA;亚组特异性抗原决定簇，无HI和NA，但能和JEV、西尼罗河脑炎病毒等发生反应；种特异性抗原决定簇，只有NA,只能和JEV发生反应。但限于当时的研究水平，这些研究都没有具体的抗原表位序列信息的研究。其它关于乙型脑炎抗原表位的研究多集中于构象型表位的单克隆抗体进行的分析，如Kimura-Kmoda等(Kimura-KurodaJ,YasuiK.TopographicalanalysisofantigenicdeterminantsonenvelopeglycoproteinV3(E)5ofJapaneseencephalitisvims,usingmonoclonalantibodies.JVirol.1983Jan;45(l):124-32.)应用10抹单抗对JEVE蛋白抗原决定簇进行分析，结果表明在E蛋白上至少存在5组不同的抗原决定簇，即第1组，黄病毒属病毒HI(血凝抑制试验，hemagglutinationinhibition)交叉反应，无中和抗体；第2组，亚组HI特异反应，无中和抗体；第3组，低HI,有中和抗体；第4组和5组无HI,有中和抗体。其中第1组的位点与其他组差异明显，第2和3组的位点接近。该结果还表明HI位点与中和位点是分开的；而且存在2个不同的HI位点，一个是黄病毒交叉反应的，另一个是亚组特异的。这些研究虽然用单抗竟争性结合试验证实JEV和其它黄病毒E蛋白上存在构象抗原表位，但未能确定其氨基酸组成。由于构象表位是由蛋白质中不连续的氨基酸残基经一定折叠所形成的在空间构象上具有生物学功能的结构，目前对构象表位的结构研究非常困难，很难研究某个构象表位是由蛋白质一级序列中的哪几个氨基酸残基构成。运用肽库筛选技术可以对构象表位的模拟表位进行筛选，Lin等(LinCW,WuSC.IdentificationofmimotopesoftheJapaneseencephalitisvimsenvelopeproteinusingphage-displayedcombinatorialpeptidelibrary.JMolMicrobiolBiotechnol,2004,8(1):3442.)应用噬菌体展示肽库鉴定了JEV嚢膜蛋白的模拟表位，同单抗2H2结合的模拟表位拥有一个保守的基序X(l)(D/E)(Y/T/S)X(2)，该基序位于E蛋白区域III的外侧表面，但所得的模拟表位只能在功能上与真实表位接近，而不能分析出抗原中构象表位的真实结构信息。抗原表位中的线性表位是由蛋白抗原中连续的氨基酸残基组成，这种表位在变性蛋白中仍能被抗体识别。由于线性表位的特点，分析鉴定线性抗原表位的具体序列结构信息较为容易。同时线性抗原表位也是较容易被直接用于诊断、基因工程疫苗、合成肽疫苗等相关应用研究。对于乙型脑炎病毒E蛋白线性抗原表4立也有戶斤净艮道，Seif等(SeifSA,MoritaK,MatsuoS,etal.Finermappingofneutralizingepitope(s)ontheC-terminalofJapaneseencephalitisvirusE-proteinexpressedinrecombinant五sc/zm'ac/n'aco//system.Vaccine,1995,13(16):1515~1521.)通过构建4种分别表达E蛋白各个中和抗原决定簇的重组质粒，检测到了JEV特异性的抗原性和免疫原性，他们进一步证明仅有E蛋白中的一段27个氨基酸残基(373~399)的片段可以诱生中和抗体。该研究对E蛋白线性表位的确定最少长度为27氨基酸残基。Wu等(WuCJ,HuangHW,TaoMH,etal.Inductionofcross-protectionagainsttwowild-typeTaiwaneseisolatesofJapanese6encephalitisvirususingBeijing-1strainDNAvaccine.Vaccine,2003,21(25-26):39383945.)将JEVCH2195LA分离林的E蛋白结构域III(E292402)的基因片段克隆到原核表达载体pET32a,在E.coli中表达重组融合，纯化融合硫氧化还原蛋白(TrxD3)与弗氏佐剂或阳离子脂质体混合免疫小鼠，结果说明TrxD3融合蛋白能够使小鼠产生中和抗体和免疫保护。该研究所分析出有中和活性的E蛋白片段长度为lll氨基酸残基。这些研究所报道的线性表位序列过长，因为真实的线性抗原表位的长度一般为6至12氨基酸残基长，那么lll氨基酸残基的片段中绝大部分序列是与表位无关的序列，或者该片段中根本不是一个线性表位，可能包含2个3个或多个线性抗原表位。即使是27氨基酸残基的片段中也可能包含多个线性抗原表位。随着生物技术及生物信息学的发展，对蛋白质中线性表位进行分析预防成为可能。Kutubuddin等(KutubuddinM，GoreMM,BanerjeeK,etal.Analysisofcomputer-predictedantibodyinducingepitopeonJapaneseencephalitisvims.ActaVirol,1993,37(6):417428.)通过计算机软件预测74-CPTTGEAHNEKRAD-87是一个线性中和表位。Dewasthaly等(DewasthalyS,AyachitVM,SarthiSA,etal.MonoclonalantibodyraisedagainstenvelopeglycoproteinpeptideneutralizesJapaneseencephalitisvirus.ArchVirol,2001,146:1427~1435.)通过生物信息学软件预测Indian林的表位，制备了预测表位的单抗，通过ELISA、间接免疫荧光及动物实验证明149-SENHGNYSAQVGASQ-163为Indian林的线性中和表位。这种先通过生物信息学方法对蛋白抗原表位进行预测，再用实验进行验证的研究方法，无疑对抗原表位的分析研究工作有巨大促进。但是该方法也有其不足之处，通过生物信息学方法虽然可以对某些抗原表位进行预测，但这种预测的表位必须经实验验证，预测的表位有许多不是真实的表位，而且预测表位的方法有较大的随意性，只能在一定程度上对蛋白质抗原表位进行分析，不能全面分析蛋白质抗原情况。本发明采用覆盖E蛋白重叠短肽融合表达技术，对E蛋白进行系统的抗原表位作图(EpitopeMapping)。本发明是首次全面对E蛋白进行线性抗原表位分析。首先确定了乙型脑炎病毒E蛋白中1402氨基酸残基片段是E基因的免疫优势决定区。为了对这一免疫优势区域进行抗原表位作图分析，设计了一套部分重叠的短肽，这些短肽覆盖1402片段全长。每一个短肽合成一对寡核苷酸链，退火后插入表达载体pGEX-6p-l，与GST进行融合表达。表达的可溶解的融合蛋白以谷胱甘肽亲和柱层析纯化。用JEV阳性血清进行Westernblot和ELISA反应性扫描，获得了9个线性抗原表位，将此9个融合蛋白对小鼠进行免疫，获得了9个融合短肽的血清，通过中和试验鉴定出EIO(73~88aa)、E39(305~320aa)为线性中和表位。其中中和表位E10与以前的报道区域74-CPTTGEAHNEKRAD-87重叠(KutubuddinM，GoreMM,BanerjeeK，etal.Analysisofcomputer-predictedantibodyinducingepitopeonJapaneseencephalitisvirus.ActaVirol,1993,37(6):417~428.),另一个中和表位E39为首次确定。初步鉴定出的抗原表位长度为16氨基酸残基长度左右。为了对这些表位的核心序列进行确定，针对第一个抗原表位设计依次从N端和C端进行氨基酸残基缩减的短肽，融合表达后于乙型脑炎抗血清进行结合分析。确定出抗原表位的核心序列，即该抗原表位的基本序列，只能向两侧延伸而两端都不能进一步缩减任何氨基酸残基的序列。乙型脑炎病毒的各个毒林虽然常在毒力和血凝特性等方面有比较明显的差异，但抗原性差异不大，没有不同的血清型。乙型脑炎病毒在抗原上与墨罗山谷脑炎病毒(MurrayVallyEncephalitisVims,MVEV),西尼罗病毒(WestNileVims,WNV),圣路易脑炎病毒(St.LouisEncephalitisVirus)有血清学交叉反应，在黄病毒科中属同一血清群。此外，JEV还与登革病毒(DengueVirus,DV)存在血清交叉反应。这些病毒都是蚊媒性人兽共患传染病，各种病毒也慢慢突破了早期的流行地域范围，不断在世界范围内扩散对人类健康及公共卫生造成威胁。及时准确地检测与诊断对预防控制该类病毒病意义重大，那么要克服它们之间的血清学交叉反应，建立以上各种病毒病的特异的诊断方法是一项重要的工作。本发明还将所鉴定出的抗原表位序列与存在血清学交叉反应的各黄病毒进行了蛋白质序列的同源性分析，对与乙型脑炎病毒抗原表位同源的其它黄病毒短肽也进行了融合表达，表达后进一步与乙型脑炎病毒阳性血清进行反应性分析。确定了部分乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位可以用于乙型脑炎与其它黄病毒之间的鉴别诊断。将鉴定的表位合成多肽，单独或混合包被ELISA板，可以用于乙型脑炎病毒抗体的检测。这些抗原表位可以用于设计基因工程疫苗，或用于乙型脑炎病毒及乙型脑炎病毒抗体的检测。
发明内容本发明的目的之一是提供乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位多肽。本发明的目的之二是将所述的乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位多8肽应用于治疗或预防乙型脑炎病毒，或者将其用于制备成诊断或检测乙型脑炎病毒的试剂。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种抗原表位多肽，其氨基酸序列中含有SEQIDNO:64、SEQIDNO:79、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108、SEQIDNO:124、SEQIDNO:139所示的任意一种氨基酸序列。如上所述的抗原表位多肽所含有的氨基酸序列中，所述的SEQIDNO:64所示的氨基酸序列的第7位氨基酸Glu可替换为Gin;所述的SEQIDNO:95所示的氨基酸序列的第7位氨基酸Ser可替换为Thr;所述的SEQIDNO:108所示的氨基酸序列的第6位氨基酸His可替换为Gin;所述的SEQIDNO:124所示的氨基酸序列的第6位氨基酸Val可替换为Ala。优选的，所述的抗原表位多肽的氨基酸序列即为SEQIDNO:64、SEQIDNO:79、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108、SEQIDNO:124、SEQIDNO:139所示的任意一种。在本发明的一个实施方式中，优选的，所述的SEQIDNO:64所示的氨基酸序列的第7位氨基酸Glu可替换为Gin;所述的SEQIDNO:95所示的氨基酸序列的第7位氨基酸Ser可替换为Thr;所述的SEQIDNO:108所示的氨基酸序列的第6位氨基酸His可替换为Gin;所述的SEQIDNO:124所示的氨基酸序列的第6位氨基酸Val可替换为Ala。在本发明的一个实施方式中，可以对所述的抗原表位多肽的N端或C端进行化学修饰。所述的化学修饰为多肽链N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。本发明中所述的抗原表位多肽可以通过固相多肽合成方法合成得到，也可以通过基因工程技术制备得到，这些都为本领域人员所通晓。本发明抗原表位多肽或其连接物可用于制备免疫原，或将其免疫动物以产生免疫保护。也可将所述的抗原表位多肽或其连接物制备成检测抗乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体的试剂。将本发明所述的表位多肽制备成免疫原或疫苗，至少包括所述的一个或全部抗原表位，这些多肽通过自身连接、相互连接或与载体连接，并辅以T细胞抗原表位，包括Thl和/或Th2表位多肽。这些T细胞抗原表位可以来源于JEV病毒蛋白或其它动物蛋白中具有刺激机体细胞免疫活性的多肽序列。9;险测乙型脑炎病毒JEV可以针对E蛋白抗原表位的单克隆抗体或针对抗原表位多肽的多克隆抗体，检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA、直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术，快速检测试纸条免疫膜层析技术等。检测乙型脑炎病毒JEV抗体，包括野毒感染产生抗体，疫苗免疫产生抗体，母源抗体，抗JEV单克隆抗体等。检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA，快速检测试纸条免疫膜层析技术等。蛋白质抗原B细胞抗原表位鉴定的方法有多种，如基因工程定点突变表达抗原蛋白分析法、噬菌体随机肽库筛选技术、合成多肽检测技术等。本项发明在鉴定抗原表位中主要采用的是基因工程技术多肽融合重叠(overlapping)表达JEVE蛋白，体外免疫反应检测多肽融合蛋白组与JEV抗血清的结合性鉴定抗原表位序列，进一步缩短与突变表达表位融合蛋白，鉴定抗原表位的序列结构；再应用合成多肽技术验证表位的正确性；用表位融合蛋白抗原免疫动物制备表位特异性单因子血清，分析抗原表位功能。本发明的有益效果如下1.由本发明乙抗原表位多肽设计的免疫原或疫苗免疫动物机体后能够产生针对JEV的抗体，利用针对E蛋白抗原表位的单克隆抗体或多克隆抗体可以检测乙型脑炎病毒JEV或乙型脑炎病毒E蛋白。2.本发明的抗原表位多肽与载体连接或自身连接或相互连接，能够免疫动物，在免疫动物后产生的抗多肽抗体或抗乙型脑炎病毒抗体能够在体内外中和乙型脑炎病毒JEV并产生免疫保护。3.本发明的抗原表位多肽或其连接物能够检测乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体。图1为表位多肽SEQIDNO:64、SEQIDNO:79、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108、SEQIDNO:124、SEQIDNO:139与GST融合表达蛋白与抗JEV血清Westernblot检测结果。图中从左至右依次为M,蛋白质分子量标准；1,SEQIDNO:64;2,SEQIDNO:79;3,SEQIDNO:95;4,SEQIDNO:108;5，SEQIDNO:124;6,SEQIDNO:139;7,GST对照。图2为表位多肽SEQIDNO:124抗体体外中和乙型脑炎病毒实验结果。1,阴性血清对照；2,抗表位多肽S叫IDNo124血清。图3为表位多肽序列SEQIDNO:64与不同毒株JEV同源序列的比较结果。图4为表位多肽序列SEQIDNO:64与不同黄病毒的同源序列比较结果。图5为表位多肽序列SEQIDNO:95与不同毒林JEV同源序列的比较结果。图6为表位多肽序列SEQIDNO:95与不同黄病毒的同源序列比较结果。图7为表位多肽序列SEQIDNO:108与不同毒抹JEV同源序列的比较结果。图8为表位多肽序列SEQIDNO:108与不同黄病毒的同源序列比较结果。图9为表位多肽序列SEQIDNO:124与不同毒林JEV同源序列的比较结果。图IO为表位多肽序列SEQIDNO:124与不同黄病毒的同源序列比较结果。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1重叠(overlapping)多肽融合表达系列JEVE蛋白抗原多肽片段并进行间接ELISA筛选JEVE蛋白B细胞抗原表位根据JEV(SA14-14-2抹)E蛋白氨基酸序列，设计一总数为50个的系列多肽，这些多肽相互重叠，且覆盖JEVE蛋白1-402氨基酸残基区域，该区域包含E蛋白结构域I(DomainI)和结构域II(DomainII)。根据每一条多肽氨基酸序列，设计合成一对DNA链，将DNA链插入表达载体pGEX-6p-l与GST进行融合表达。融合表达的系列重组蛋白与抗JEV血清进行间接ELISA分析，分析JEVE蛋白抗原表位，结果见表l所示。其具体流程如下设计多肽序列—合成编码多肽序列的DNA链—多肽融合表达载体构建—诱导表达-表达融合蛋白亲和层析纯化—表达产物与抗JEV血清免疫反应性检测—分析JEVE蛋白抗原表位。表1多肽融合蛋白与抗JEV血清间接ELISA反应结果编号代号位置CAA)GST融合多肽序列OD值SEQIDNO:lEl1~16GST-FNCLGMGNRDFIEGAS0.384SEQIDNO:2E29~24GST-RDFIEGASGATWVDLV0.10211<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注包^皮抗原分别为多肽融合蛋白，GST为对照包被抗原，抗原包被浓度为10pg/ml;抗JEV血清为200倍稀释，TMB底物显色，读取450nm波长OD值。结果分析表明，初步鉴定出的抗原表位序列包括SEQIDNO:l、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:19、SEQIDNO:33、SEQIDNO:39、SEQIDNO:45、SEQIDNO:48及SEQIDNO:49。实施例2抗原表位的核心序列定位根据实施例1中初步鉴定出的抗原表位序列，进一步设计小片段多肽，或设计从C端至N依次缩减一个氨基酸残基的系列多肽以及从N端至C端依次缩减一个氨基酸残基的系列多肽，融合表达后与JEV阳性血清进行Westernblot分析，两端分别缩减至多肽融合蛋白丧失与JEV阳性血清结合的能力时确定该表位的核心序列，反应结果见表2所示。表2多肽融合蛋白与抗JEV血清间接Westernblot反应结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>SEQIDNO:73Ell-3RADSSYVC-SEQIDNO:74Ell-4EKRADSSYVCKQ+++SEQIDNO:75Ell-5EKRADSSYVCK+++SEQIDNO:76Ell-6EKRADSSYVC+++SEQIDNO:77Ell-7EKRADSSYV+++SEQIDNO:78Ell-8EKRADSSY+++SEQIDNO:79Ell-9EKRADSS+++SEQIDNO:80Ell-10EKRADS—SEQIDNO:81Ell-11KRADSSY-SEQIDNO:82Ell-12RADSSY-SEQIDNO:19E19GTTTSE丽GNYSAQVG+++SEQIDNO:83E19-1GTTTSENHGNYSAQV+++SEQIDNO:84E19-2GTTTSENHGNYSAQ+++SEQIDNO:85E19-3GTTTSENHGNYSA+++SEQIDNO:86E19-4GTTTSENHGNYS+++SEQIDNO:87E19-5GTTTSENHGNY-SEQIDNO:88E19-6GTTTSENHGN-SEQIDNO:89E19-7GTTTSENHG-SEQIDNO:90E19-8GTTTSENH-SEQIDNO:91E19-9TTTSENHGNYS+++SEQIDNO:92E19-10TTSENHGNYS+++SEQIDNO:93E19-11TSENHGNYS+++SEQIDNO:94E19-12SENHGNYS+++SEQIDNO:95E19-13ENHGNYS+++SEQIDNO:96E19-14NHGNYS-SEQIDNO:97E19-15HGNYS-SEQIDNO:98E19-16GNYS-SEQIDNO:33E33SQEGGLHHALAGAIVV+++SEQIDNO:99E33-1SQEGGLHHALAGAIV+++SEQIDNO:IOOE33-2SQEGGLHHALAGAI+++15SEQIDNO:101E33-3SQEGGLHHALAGA+++SEQIDNO:102E33-4SQEGGLHHALAG+++SEQIDNO:103E33-5SQEGGLHHALA+++SEQIDNO:104E33-6SQEGGLHHAL+++SEQIDNO:105E33-7SQEGGLHHA+++SEQIDNO:106E33-8SQEGGLHH-SEQIDNO:107E33-9QEGGLHHA+++SEQIDNO:108E33-10EGGLHHA+++SEQIDNO:109E33-11GGLHHA-SEQIDNO:110E33-12GLHHA-SEQIDNO:lllE33-13LHHA-SEQIDNO:39E39TEKFSFAKNPVDTGHG+++SEQIDNO:112E39-1TEKFSFAKNPVDTGH+++SEQIDNO:113E39-2TEKFSFAKNPVDTG+++SEQIDNO:114E39-3TEKFSFAKNPVDT+++SEQIDNO:115E39國4TEKFSFAKNPVD+++SEQIDNO:116E39-5TEKFSFAKNPV-SEQIDNO:117E39-6TEKFSFAKNP-SEQIDNO:118E39-7TEKFSFAKN-SEQIDNO:119E39陽8TEKFSFAK-SEQIDNO:120E39-9EKFSFAKNPVD+++SEQIDNO:121E39-10KFSFAKNPVD+++SEQIDNO:122E39-11FSFAKNPVD+++SEQIDNO:123E39-12SFAKNPVD+++SEQIDNO:124E39-13FAKNPVD+++SEQIDNO:125E39-14AKNPVD-SEQIDNO:126E39-15KNPVD-SEQIDNO:127E39-16NPVD-SEQIDNO:45E45RLVTVNPFVATSSANS+++SEQIDNO:128E45-lVTVNPFVATSSA+++16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注检测抗原分别为表中所示多肽的GST融合蛋白，GST为对照抗原，抗JEV血清为200倍稀释。结果分析表明，确定的抗原表位核心序列为SEQIDNO:64(El-14)、SEQIDNO:79(El1-9)、SEQIDNO:95(E19-13)、SEQIDNO:108(E33-10)、SEQIDNO:124(E39-13)、SEQIDNO:139(E49-5)。实施例3抗原表位核心序列的突变分析实施例2中确定的抗原表位核心序列与不同毒林乙型脑炎E蛋白序列比较以及与墨罗山谷脑炎病毒(MVEV)，西尼罗病毒(WNV),尤苏它病毒(UsutuVims，UV),昆津病毒(Kunjinvirus,KUN)以及登革病毒(DengueVirus,DV)等黄病毒E蛋白进行同源性分析比较。比较根据实施例2中确定的抗原表位核心序列与其它病毒的同源性，先取同源性大于50%的同源序列短肽，为SEQIDNO:64、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108和SEQIDNO:124，将其进行GST融合表达后Westernblot分析与JEV阳性血清的反应性，反应结果见表3所示。表3多肽融合蛋白与抗JEV血清Westernblot反应结果序列编号序列来源GST融合多肽序列Westernblot检测结果SEQIDNO:64JEVstrainSA14-14-2GNRDFIEG+++SEQIDNO:144JEVstrainTCGNRDFIQG+++SEQIDNO:145DV1、DV3、DV4GNRDFVEG-SEQIDNO:146MVEVstrainMRM3929SSRDFLEG-SEQIDNO:147MVEVstrainMVE-1-51SSRDF正G-SEQIDNO:148KUNSNRDFLEG-WNVUVstrainBUDAPESTUVstrainSAAR-1776SEQIDNO:149TBEVstrainK23ENRDFVTG-SEQIDNO:150DV2SNRDFVEG-SEQIDNO:95JEVstrainSA14-14-2ENHGNYS+++SEQIDNO:151JEVstrainJKT6468ENHGNYT+++SEQIDNO:152MVEVstrainMRM3929TNHGDYS-SEQIDNO:153MVEVstrainMVE-1-51TSHGNYS-SEQIDNO:154KUNstrainMRM61CESHGNYF-SEQIDNO:155WNVstrainNY99ESHGNYS-SEQIDNO:156UVDTHGNYS-SEQIDNO:108JEVstrainSA14-14-2EGGLHHA+++SEGIDNO:157JEVconsenserEGGLHQA+++18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注检测抗原分别为表中所示多肽的GST融合蛋白，GST为对照抗原，抗JEV血清为200倍稀释。结果分析表明表位SEQIDNO:64(El-14)、SEQIDNO:95(E19-13)、SEQIDNO:108(E33-10)具有病毒特异性，其它黄病毒的同源序列不能被JEV阳性血清所识别。并且，所述的序列SEQIDNO:64,其第7位氨基酸Glu可替换为Gin,替换后的氨基酸序列为SEQIDNO:144;所述的序列SEQIDNO:95,其第7位氨基酸Ser可替换为Thr,替换后的氨基酸序列为SEQIDNO:151;所述的序列SEQIDNO:108，其第6位氨基酸His可替换为Gin,替换后的氨基酸序列为SEQIDNO:157;所述序列SEQIDNO:124，其第6位氨基酸Val可替换为Ala,替换后的氨基酸序列为SEQIDNO:164。实施例4乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位的合成根据JEVE蛋白B细胞抗原表位的氨基酸序列，应用固相多肽合成技术，采用自动多肽合成仪或人工多肽合成方法。固相树脂釆用Fmoc保护的氨基酸Wang树脂或其它树脂，树脂经DMF溶涨、piperidine胶Fmoc保护后，根据氨基酸序列顺序，加入Fmoc保护的氨基酸，在HBTU存在情况下进行酰化反应。酰化反应完成后经过洗涤，再加入第二位的Fmoc-氨基酸进行酰化反应，并洗涤。如此循环，从多肽序列C末端超起始向N末端，按照顺序合成完整的多肽链。合成完成后，根据组成肽链氨基酸不同选取适当试剂用TFA法裂解肽链与树脂的连接并用冷乙醚沉淀TFA多肽，经脱盐纯化、LC-MS和HPLC分析鉴定后备用。在整个合成过程中，每个氨基酸酰化反应后可以应用Kaiser法或TMBS法测试反应的完成情况。为了便于使表位多肽和载体蛋白连接，在合成多肽时可以在多肽序列的N末端加一个半胱氨酸。按照上述方法，分别合成了SEQIDNO:64、SEQIDNO:79、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108、SEQIDNO:124、SEQIDNO:139所示氨基酸序列的多肽片段。实施例5乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位的化学修饰按照实施例4的方法合成的多肽片段，其N末端为自然氨基修饰，C末端为自然羧基修饰。N末端乙酰化修饰方法:按照以上介绍的多肽合成至最后一个Fmoc保护氨基酸偶联结束，并进行N末端Fmoc保护基团的去除，然后进行以下操作。取150pl乙酸酐和20pLEIPEA溶于4.8mlDMF中，充分混合并在水浴中冷却。然后将以上混合液加入多肽合成反应管中反应5min。再依次用5mlDMF和二氯曱烷(DCM)洗2次，每次5min。氮气吹干后按照常规方法进行側链保护基团的去除、裂解、纯化和鉴定。C末端酰胺化4务饰方法C末端酰胺化的多肽合成时应选用树脂为Rink树20脂。执行合成程序时应对树脂用DMF溶涨20min,然后从C末端第一位氨基酸开始执4亍合成程序，同前过Fmoc-wang树脂合成方法。实施例6乙型脑炎JEVE蛋白B细胞抗原表位与载体蛋白KLH和BSA的偶联载体蛋白KLH或BSA4mg溶于0.5ml含5mMEDTA的PBS(pH7.2)緩冲液中，加入l.Omg连接剂Sulfo-SMCC,充分溶解后在室温孵育60min或37。C孵育30min。应用SephadexG-25柱或透析方法脱盐纯化Sulfo-SMCC处理的载体蛋白，并用BCA法测定蛋白含量后备用。称取合成表位多肽4mg,加入0.5ml重蒸馏水溶解多肽，然后将溶解后的多肽与Sulfo-SMCC处理的载体蛋白混合，4。C孵育2小时或反应过夜，分装备用。实施例7乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位氧化实现自身的连接含半胱氨酸的多肽可以通过巯基的氧化反应形成自身连接。一般情况下应用DMSO介导的氧化反应实现连接，根据多肽的酸碱性，氧化反应可以在微酸或孩L喊性条件下进行。微酸性环境下的氧化反应用适当浓度的醋酸溶解多肽，使多肽的浓度在0.5-1.5mM范围内，醋酸的终浓度不超过5%,用(NH4)2C03调整多肽溶液的pH为6.0左右，加入10-20%的DMSO,25'C反应5-25h，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后，用1。/。TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。微碱性环境下的氧化反应用O.OIM磷酸盐緩冲液，pH7.5，溶解多肽至终浓度l.OmM,加入浓度DMSO至终浓度1%，25'C反应过夜，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后用1%TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。实施例8乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测猪抗JEV抗体用JEVE蛋白B细胞抗原表位SEQIDNO:64、SEQIDNO:79、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108、SEQIDNO:124、SEQIDNO:139合成表位多肽与载体的连接物混合物为包被抗原，包被96孔聚苯乙烯酶标板。用pH9.6,O.IM碳酸盐緩冲液稀释抗原至终浓度为10^g/ml，按10(^1/孔加入酶标板中，4'C包被过21夜。然后用PBST(PBS+0.05%Tween)洗涤酶标板3次；含1%BSA的PBST封闭酶标板，37'C封闭2h,封闭后用洗液PBST洗板3次，立即用于检测或-2(TC存放备用。抗体检测操作程序加入待检测猪血清(定性检测血清100倍稀释，抗体效价^r测血清进行倍比稀释，同时设立阳性血清对照与阴性血清对照以及不加血清的空白对照)，37。C孵育lh,PBST洗液洗涤3次，每次3分钟；加入f束才艮过氧化物酶标记羊抗猪IgG(Goat-anti-pigIgG-HRP),37。C孵育lh，PBST洗液洗涂4次，每次3分钟；加入HRP显色底物(TMB显色剂)，室温孵育5-15分钟观察显色反应；充分显色后，加入2M硫酸终止显色反应；用酶标仪测量450nm波长的吸光值；判定结果。结果见表4所示。表4混合多肽包被间接ELISA检测猪抗JEV抗体<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注包被抗原为抗原表位SEQIDNO:64、SEQIDNO:79、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108、SEQIDNO:124、SEQIDNO:139合成多肽与BSA连接物的混合物，10pg/ml。该阳性血清效价为200。判定结果时空白对照及阴性血清孔吸光值小于或等于0.2，阳性血清对照孔吸光值大于0.4时结果有效；计算P/N值=(检测孔OD值-空白对照孔OD值)/(阴性血清OD值-空白对照孔OD值)，P/N值等于或大于2时为阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。实施例9乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测人抗JEV抗体实施方法同实施例8，待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清为人血清；二抗为l束才艮过氧化物酶标记羊抗人IgG(Goat-antihumanIgG-HRP)。实施例10乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测马抗JEV抗体实施方法同实施例8,待;险血清、阴性对照血清和阳性对照血清为马血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗马IgG(Goat-antihorseIgG-HRP)。实施例11乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测猪抗JEV抗体用JEVE蛋白B细胞抗原表位SEQIDNO:64、SEQIDNO:79、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108、SEQIDNO:124、SEQIDNO:139表位多肽与载体的连接物的混合物为包被抗原，以BSA为对照抗原。在硝酸纤维素膜上定点包被抗原，2pg/点，37。C固定30min,PBST洗涤6次，2%BSA中4。C封闭过夜，PBST洗涤6次后即可用于抗体检测。检测抗体时，将待检测血清样品适当稀释后与抗原包被膜于37。C孵育30min，PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(Goat-anti-pigIgG-HRP),37。C孵育lh,PBST洗液洗涤6次；加入AEC或DAB底物显色，室温避光孵育lOmin观察颜色反应。结果判定时，以包被抗原点呈现棕红色颜色反应，对照抗原点不出现颜色反应者为阳性。实施例12乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测人抗JEV抗体实施方法同实施例11,待检血清为人血清；二抗为l束才艮过氧化物酶标记羊抗人IgG(Goat-antihumanIgG-HRP)。实施例13乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测马抗JEV抗体实施方法同实施例11,待检血清为马血清；二抗为束根过氧化物酶标记羊抗马IgG(Goat画antihorseIgG-HRP)。实施例14乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位免疫原的制备及免疫实验乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位免疫原可以是合成抗原表位多肽，23抗原表位多肽自身连接物，抗原表位多肽与载体连接物，抗原表位融合表位蛋白等。本实施例中用抗原表位多肽SEQIDNO:64、SEQIDNO:79、SEQIDNO:95、SEQIDNO:108、SEQIDNO:124、SEQIDNO:139与BSA连接物为免疫原；首次免疫免疫原用弗氏完全佐剂和抗原乳化，小动物免疫抗原量为lOO^g每只；二三免时用弗氏不完全佐剂与抗原乳化，小动物免疫抗原量为50-100fig每只进行免疫。免疫途径可为皮下注射、皮内注射或肌肉注射。各次免疫期间隔两周。加强免疫两次后4全测抗体水平。试验结果分别见表5、表6、表7、表8、表9、表10。表5小鼠抗表位多肽E1抗体间接ELISA效价Mouse血清稀释度Number1/501/1001/2001/4001/800Ml1.5101.4531.1130.7240.502M20.8090.6050.3300.1500.062M31.2571.4201.0631.0800.653M40.9250.6500.5090.4500.230M50.75010.5570.4810.2250.232阴性鼠血清0.1卯0.1840.1500.1200.130注包被抗原为抗原表位多肽SEQNO:64,10ng/ml。表6小鼠抗表位多肽E11抗体间接ELISA效价Mouse血清稀释度Numbsr1/501/1001/2001/楊1/800Ml0.5800.3550.3050.1550.089M20.7320扁0.3450.2500.110M30.6100.5050.3400.2400.120M40.8050.6300.3300.1800.095M5O.譜0.7200.4550.3550.185阴性鼠血清0.1210.0800.0720.0750扁注包#1抗原为抗原表位多肽SEQNO:79,10pg/ml。24表7小鼠抗表位多肽E19抗体间接ELISA效价Mouse血清稀释度Number1/501/1001/2001/4001/800<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>M50.4360.3130.2710.1820.14阴性鼠血清0.1080.10.1040.0950.089注包被抗原为抗原表位多肽SEQNO:124,1Opg/ml。表10小鼠抗表位多肽E49抗体间接ELISA效斩Mouse血清稀释度Number1/501/1001/2001/4001/800Ml0.5330.3690.2340.1870.125M20.4810.2630.2270.1380.086M30.5660.4240.4120.350.108M40.5730.4320.3980.2760.109M50.5450.5020.4540.3790.201阴性鼠血清0.1090.10.110.0970.081注包被抗原为抗原表位多肽SEQNO:139,10貼/ml。以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至、等效，但都将落入本发明的保护范围内。26一组抗原表位多肽序列表SEQUENCELISTING〈110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所<120〉一组抗原表位多肽及其应用<130>KLPI090<歸169<170〉Patentlnversion3.5<400〉1PheAsnCysLeuGlyMetGlyAsnArgAspPhelieGluGlyAlaSer151015〈210>2<211〉16〈212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400〉2ArgAspPhelieGluGlyAlaSerGlyAlaThrTrpValAspLeuVal151015316PRTJapaneseencephalitisvirus<211〉〈212><213><400>3GlyAlaThrTrpValAspLeuValLeuGluGlyAspSerCysLeuThr1'51015<210〉4〈211>16<212>.PRT<213>Japaneseencephalitisvirus〈400>4LeuGluGlyAspSerCysLeuThrlieMetAlaAsnAspLysProThr151015<210〉5<211>16<212>PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>5lieMetAlaAsnAspLysProThrLeuAspValArgMetlieAsnlie151015<210>6<211>16<212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>6LeuAspValArgMetlieAsnlieGluAlaSerGinLeuAlaGluVal15■1015116PRTJapaneseencephalitisvirus>>>>o123222227<210>7〈211>16<212〉PRT、'213>Japaneseencephalitisvirus<400>7GluAlaSerGinLeuAlaGluValArgSerTyrCysTyrHisAlaSer151015<210><211〉<212><213〉〈400>816PRTJapaneseencephalitisvirus8ArgSerTyrCysTyrHisAlaSerValThrAsplieSerThrValAla151015〈210〉<211><212><213><400〉916PRTJapaneseencephalitisvirus9ValThrAsplieSerThrValAlaArgCysProThrThrGlyGluAla151015〈210〉<211〉<212><213><400>1016PRTJapaneseencephalitisvirus10ArgCysProThrThrGlyGluAlaHisAsnGluLysArgAlaAspSer151015<210>11<211>16〈212〉PRT<213>J印3nese<400>11HisAsnGluLys1<210>12<211>16(212>PRT<213>Japanese<400>12SerTyrValCys1<210〉13<211>16<212>PRT<213〉Japanese<400〉1310151015ThrAspArgGlyT卬GlyAsnGlyCysGlyPhePheGlyLysGlySer281015<210〉14<211>16<212〉PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400〉14CysGlyPhePheGlyLysGlySerlieAspThrCysAlaLysPheSer151015<210〉<21D<212><213〉1516PRTJapaneseencephalitisvirus<400>15lieAspThrCysAlaLysPheSerCysThrSerLysAlalieGlyArg151015<210〉16〈211>16<212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>16CysThrSerLysAlalieGlyArgThrlieGinProGluAsnlieLys151015〈210〉〈211><212><213〉1716PRTJapaneseencephalitisvirus<400〉17ThrlieGinProGluAsnlieLysTyrLysValGlyliePheValHis1,51015<210>18<211〉16<212>PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>18TyrLysValGlyliePheValHisGlyThrThrThrSerGluAsnHis151015<210>19<211>16<212>PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus〈400〉19GlyThrThrThrSerGluAsnHisGlyAsnTyrSerAlaGinValGly1510.15〈210〉20<211>16<212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>20GlyAsnTyrSerAlaGinValGlyAlaSerGinAlaAlaLysPheThr101515〈210〉21〈211〉16<212>PRT<213>Japaneseencephalitis〈400>21AlaSerGinAlaAlaLysPheThrValThrProAsnAlaProSerVal151015<210><211><212〉<213><400〉2216PRTJapaneseencephalitisvirus22ValThrProAsnAlaProSerValAlaLeuLysLeuGlyAspTyrGly151015<210〉〈211〉<212〉<213〉2316PRTJapaneseencephalitisvirus<400〉23AlaLeuLysLeuGlyAspTvrGlyGluVa.lThrLeuAspCysGluPro15'1015〈210〉<211>〈212〉<213><400>2416PRTJapaneseencephalitisvirus24GluValThrLeuAspCysGluProArgSerGlyl>euAsnThrGluAla151015<210><211〉<212><213>〈400〉2516PRTJapaneseencephalitisvirus25ArgSerGlyLeuAsnThrGluAlaPheTyrValMetThrValGlySer151015<210><2U><212><213><400>2616PRTJapaneseencephalitisvirus26PheTyrValMetThrValGlySerLysSerPheLeuValHisArgGlu1510.15<210>27<211>16<212>PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>2730LysSerPheLeuValHisArgGluTrpPheHisAspLeuAlaLeuPro151015〈210>28〈211〉16<212〉PRT〈213〉Japaneseencephalitisvirus<400>28TrpPheHisAspLeuAlaLeuProTrpThrSerProSerSerThrAla151015〈210><211〉〈212><213〉2916PRTJapaneseencephalitisvirus<400>29TrpThrSerProSerSerThrAlaTrpArgAsnArgGluLeuLeuMet151015〈210〉30<211〉16<212>TOT〈213>Japaneseencephalitisvirus〈400〉30TrpArgAsnArgGluLeuLeuMetGluPheGluGlyAlaHisAlaThr151015<210>31<211>16<212>PRT〈213>Japaneseencephalitisvirus<400〉31GluPheGluGlyAlaHisAlaThrLysGinSerValValAlaLeuGly151015<210><211><212><213〉3216PRTJapaneseencephalitisvirus<400>32LysGinSerValValAlaLeuGlySerGinGluGlyGlyLeuHisHis151015<210>33<211>16<212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400〉33SerGinGluGlyGlyLeuHisHisAlaLeuAlaGlyAlalieValVal151015<210>34<211>16<212>F>RT<213>Japaneseencephalitisvirus31<400>34AlaLeuAlaGlyAlalieValValGluTyrSerSerSerValMetLeu151015〈210>35<211>16<212>PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>35GluTyrSerSerSerValMetLeuThrSerGlyHisLeuLysCysArg151015<210>36<211>16〈212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400〉36ThrSerGlyHisLeuLysCysArgLeuLysMetAspLysLeuAlaLeu151015<210>37<211>16<212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>37LeuLysMetAspLysLeuAlaLeuLysGlyThrThrTyrGlyMetCys1510■15<210>38<211>16〈212〉PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400〉38LysGlyThrThrTvrGlyMetCysThrGluLysPheSerPheAlaLys151015<210>39<211>16〈212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>39ThrGluLysPheSerPheAlaLysAsnProValAspThrGlyHisGly151015<210>40<211〉16<212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>40AsnProValAspThrGlyHisGlyThrValVallieGluLeuSerTyr151015<210〉41<211>16<212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus〈400〉41ThrValVallie1GluLeuSerTyrSerGlySerAspGlyProCysLys51015〈210〉〈211〉<212><213>4216PRTJapaneseencephalitisvirus<400>42SerGlySerAspGlyProCysLyslieProlieValSerValAlaSer151015<210><211〉<212><213>4316PRTJapaneseencephalitisvirus<400〉43lieProlieValSerValAlaSerUuAsnAspMetThrProValGly151015<210><211〉<212〉〈213〉4416PRTJapaneseencephalitisvirus〈400〉44LeuAsnAspMetThrProValGly■ArgLeuValThrValAsnProPhe151015<210〉<211〉<212〉<213〉4516PRTJapaneseencephalitisvirus<400〉45ArgLeuValThrValAsnProPheValAlaThrSerSerAlaAsnSer151015<210〉46〈211〉16〈212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>46ValAlaThrSerSerAlaAsnSerLysValLeuValGluMetGluPro151015<210>47<211〉16<212>PRT〈213〉Japaneseencephalitisvirus<400>47LysValLeuValGluMetGluProProPheGlyAspSerTyrlieVal151015<210>48<211>16<212>PRT33<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>48ProPheGlyAspSerTyrlieValValGlyArgGlyA印LysGinlie151015<210>49<211>16<212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>49ValGlyArgGlyAspLysGinlieAsnHisHisTrpHisLysAlaGly151015<210>50<211>16<212>PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>50AsnHisHisTrpHisLysAlaGlySerThrLeuGlyLysAlaPheSer151015<210>51<21D15〈212〉PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus〈400〉51PheAsnCysLeuGlyMetGlyAsnArgAspPhelieGluGlyAla1.51015〈210〉52<211>14〈212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>52PheAsnCysLeuGlyMetGlyAsnArgAspPhe'lieGluGly1510.<210>53<211>13<212>PRT〈213〉Japaneseencephalitisvirus<400>53PheAsnCysUuGlyMetGlyAsnArgAspPhelieGlu1—510<210>54<211>12<212〉PRT<213〉J"apan6se<400>54encephalitisvirusPheAsnCysLeuGlyMetGlyAsnArgAspPhelie1510<210〉55<211>1134<212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400〉55PheAsnCysLeuGlyMetGlyAsnArgAspPhe1510<210〉56<211〉10<212〉PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>56PheAsnCysLeuGlyMetGlyAsnArgAsp1510<210>57<211>9〈212〉PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400〉57PheAsnCysLeuGlyMetGlyAsnArg15〈210〉58<211〉8<212〉PRT〈213>Japaneseencephalitisvirus<400>58PheAsnCysLeuGlyMetGlyAsn15<210>59<211〉13<212>PRT<213>Japanes'〈400>59AsnCysLeuGlyMetGlyAsnArgAspPhelieGluGly1510<210〉60<211>12<212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>60CysLeuGlyMetGlyAsnArgAspPhelieGluGly1510<210>61<211>11<212>PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus〈400>61LeuGlyMetGlyAsnArgAspPhelieGluGly1510<210>'6235〈211〉10<212〉PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>62GlyMetGlyAsnArgAspPhelieGluGly1510<210〉63<211>9<212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>63MetGlyAsnArgAspPhelieGluGly15<210〉64〈211>8<212〉PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>64GlyAsnArgAspPhelieGluGly15<210〉65<211>7<212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus〈400>65AsnArgAspPhelieGluGly15〈210〉66<211>6<212〉PRT■'<213〉Japaneseencephalitisvirus<400>66ArgAspPhelieGluGly15<210〉67〈211〉8<212>PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<67ArgCysProThrThrGlyGluAla15<210>68<211>8<212〉PRT<213〉Japaneseencephalitisvirus<400〉68HisAsnGluLysArgAlaAspSer15〈210〉69<211〉12<212>PRT<213>Japanese〈400〉69ProThrThrGly1<210〉70〈211〉8<212〉PRT<213>J即anese<400〉7010ThrGlyGluAlaHisAsnGluLys15<210〉<211><212〉<213><400〉718PRTJapaneseencephalitisvirus71SerTyrValCysLysGinGlyPhe15<210><212><213〉<400>7212PRTJapaneseencephalitisvirus72GluLysArgAlaAspSerSerTyrValCysLysGin1510<210><211〉〈212>〈213〉<400>738PRTJapaneseencephalitisvirus73ArgAlaAspSerSerTyrValCys15<210〉<211〉<212><213><400〉7412PRTJapaneseencephalitisvirus74GluLysArgAlaAspSerSerTyrValCysLysGin1510〈210〉<211><212><213><400>7511PRTJapaneseencephalitisvirus75GluLysArgAlaAspSerSerTyrValCysLys151037<210〉76<211〉10<212〉PRT<213〉Japanese<400〉76encephalitisvirusGluLysArgAlaAspSerSerTyrValCys1510<210〉<211><212>〈213〉<'400>779PRTJapaneseencephalitisvirus77GluLysArgAlaAspSerSerTyrVal15<210><211〉<212><213><400〉788PRTJapaneseencephalitisvirus78GluLysArgAlaAspSerSerTyr15<210〉<211〉<212><213>797PRTJapaneseencephalitisvirus<400>79GluLysArgAlaAspSerSer15<210〉<211〉<212〉<213〉806PRTJ叩3neseencephalitis<400>80GluLysArgAlaAspSer15<210><211><212><213>817PRTJapaneseencephalitis<400>81LysArgAlaAspSerSerTyr15<210><211><212〉<213〉<400〉826PRTJapaneseencephalitisvirus82ArgAlaAspSerSerTyr1538<210〉83<211>15<212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus<400>83GlyThrThrThrSerGluAsnHisGlyAsnTyrSerAlaGinVal151015<210>84〈211>14〈212〉PRT<213>Japaneseencephalitisvirus〈400〉84GlyThrThrThr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