专利名称：一种基因工程囊素样肽及其表达基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程囊素样肽及其表达基因与应用，属于基因工程技术领 域。
背景技术：
囊素三肽(BSTP或BS)是Audhya T等1986年首次从鸡法氏囊中提纯的一种序列 为Lys-His-Gly-NH2的三肽，功能是诱导禽类和哺乳类的B细胞前体分化为B细胞，选择性 分化激素，对体液免疫起着重要的调节作用。目前对囊素三肽的制备方法主要有两种一种是化学合成法，另一种是生物合成 法。化学方法由于其固有弊端，如工艺繁琐，副产物多且去除困难等。如公开号为 CN1696151的中国专利，公开了一种法氏囊素三肽合成方法，它包括氨基酸保护、保护组 氨酸_甘氨酸甲酯二肽合成、保护组氨酸_甘氨酸二肽的脱氨基保护、保护赖氨酸_组氨 酸_甘氨酸的合成、保护赖氨酸_组氨酸_甘氨酸的脱氨基保护、法氏囊素三肽粗品的合 成、法氏囊素三肽粗品的纯化。生物方法合成主要方向为利用囊素三肽的表达基因导入大肠杆菌然后进行大规 模生产。但目前为止，因为表达量低，尚未有能够达到工业化应用的报道。生物方法合成产量最高的报道为张焕玲等在江苏农业学报第2003-19-2期中名 称为法氏囊提取物中囊素三肽含量的测定的论文中提到在大肠杆菌中成功的进行了囊素 三肽表达，它利用大肠杆菌所惯用的密码子，将5个BSTP基因串联与克隆载体pDuc57相 连，在大肠杆菌中表达，光密度扫描表明BS含量仅占菌体总蛋白的13.4%。李萍等在中国 兽医杂志第2006-42-4期中名称为囊素三肽的基因克隆和表达的论文中提到利用了大肠 杆菌所惯用的密码子，以合成的BS1、BS2为引物扩增囊素三肽串联片段(BS8)，克隆pBAD/ Thio-TOPO载体，用pBAD/TOPO-Thio大肠杆菌表达系统进行表达，含BS8融合蛋白的分子量 大小约为19kDa，BS8融合蛋白主要以可溶形式存在，后提取需要进行细胞破碎，镍柱进行 纯化等。但是依然存在囊素三肽表达量不高，后提取工艺需要细胞破碎、纯化等步骤，成本 比较高且繁琐，无法进行大规模生产的弊端。因此研制出高表达量，后提取工艺成本低，步骤简单，适合规模化生产，高活性的 三肽囊素制备方法是解决目前囊素三肽应用瓶颈的主要途径之一。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种基因工程囊素样肽及其表达基因与应用。发明概述经研究发现，目前对于BSTP基因进行扩增表达报道的还比较少，BSTP无法大规模 生产，主要原因是因为BSTP的长度较小，仅为三个氨基酸，这样在设计引物PCR时的引物长 度较小，退火温度较低，克隆出的基因片段准确性较低而且重复性较差，这也就为后来进行BSTP基因克隆和表达留下了很大的困难。本发明根据按照大肠杆菌惯用密码子设计一种 BS样肽基因片段，构建pET-32a (+)表达载体，转化大肠杆菌BL21，在摇瓶中高效表达，采用 非常规后提取工艺制备囊素样肽制品。发明详述本发明涉及[1] 一种基因工程囊素样肽，具有如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。本发明还涉及[2] 一种编码[1]中基因工程囊素样肽的基因片段，具有如SEQID NO. 2所示核苷 酸序列。进一步的，本发明还涉及[3]含有SEQID NO. 2所示核苷酸序列的表达载体。此外，本发明还涉及[4]根据[2]记载的基因工程囊素样肽的基因片段在制备囊素三肽中的应用。[5]根据[4]记载的应用，步骤如下(1)将基因工程囊素样肽的基因片段插入表达质粒，得到重组质粒；(2)将步骤(1)制得的重组质粒转化宿主菌，构建宿主菌表达体系；(3)利用步骤(2)构建的宿主菌表达体系诱导表达囊素样肽，并经过后处理工艺
制得囊素三肽。[6]根据[5]记载的应用，步骤⑴中所述将基因工程囊素样肽的基因片段插入表 达质粒，是指用核酸限制性内切酶EcoR I及Sail、Xho I或HindIII之一双酶切基因工程 囊素样肽的基因片段，连接到相同酶切的表达质粒上，然后进行测序验证。上述核酸限制性内切酶EcoR I及SalI、Xho I或HindIII，均为现有技术产品，可 通过市场购得。[7]根据[6]记载的应用，所述表达质粒为pET-32a、pET_32b或pET_32c。所用 表达质粒均为市售产品，本领域技术人员可根据产品说明书进行操作，将基因工程囊素样 肽的基因片段插入表达质粒。[8]根据[5]记载的应用，步骤(2)中所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。上述宿 主菌均为市售产品，本领域技术人员可根据产品说明书进行操作，将重组质粒转化宿主菌。[9]根据[5]记载的应用，步骤(3)中后处理工艺的步骤如下将表达后的囊素样肽菌液经离心后，收集菌体沉淀，用0 °C冰冷的高渗透溶液悬浮 菌体沉淀，混合均勻，冰浴8 IOmin ；然后，离心收集菌体沉淀，用等体积0°C冰冷的低渗透 溶液悬浮菌体沉淀，混合均勻，冰浴8 IOmin ；然后，离心取上清液，过0. 2 0. 24um混合 纤维素膜，得到囊素三肽。诱导表达囊素样肽步骤可根据宿主菌的产品使用说明书结合本 领域常规方法操作。[10]根据[9]记载的应用，所述高渗透溶液pH = 8. 5，终浓度Tris-HCl 20 30mmol/L、EDTA (乙二胺四乙酸)2 3mmol/L、蔗糖25wt % ；所述的低渗透溶液为pH = 8. 5，终浓度 Tris-HCl 20 30mmol/L、EDTA 2 3mmol/L。 本发明所用的表达质粒pET-32a、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21 (DE3) ,T0P10感受 态细胞、0. 22um混合纤维素膜等均为现有技术产品，可通过市场购得。
本发明所保护的基因工程囊素样肽的基因片段，可以准确、高效的复制表达，该基 因插入表达载体pET-32a转化入大肠杆菌BL21(DE3)后，经高效表达，BS (囊素三肽)含量 含量可占菌体总蛋白的28.6%，完全达到工业化生产的要求。
图1囊素样肽基因SOE-PCR扩增电泳图片；其中泳道M :DL2000 ；泳道1，2，3 =BS 产物；图2囊素样肽表达载体pet32a-BS的示意图；图3目的蛋白的SDS-PAGE电泳图片，其中泳道1 标准分子量Marker ；泳道2_3 未诱导的菌液；泳道4,5,6 诱导后pET-32a(+)-BS ；泳道7,8 纯化后pET_32a⑴-BS。图4采用李萍等在中国兽医杂志第2006-42-4期中提到的用生物方法合成囊素三 肽的电泳图片，其中泳道1 未诱导的菌液；泳道2-8 诱导后pBAD-BS ；泳道9 标准分子 量 Marker。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但不限于此。实施例中的表达质粒pET_32a、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21(DE3)、T0P10感受态 细胞均购自大连宝生物工程有限公司，0. 22um混合纤维素膜购自上海市新亚净化器件厂。实施例11)囊素肽基因的设计与合成及SOE-PCR扩增按照大肠杆菌惯用密码子及BS基因序列设计两条引物F1，F2，通过重叠PCR方法 (SOE-PCR)扩增，得到BS样肽基因片段。该BS样肽基因片段长度为99bp，由10拷贝的BS 基因序列(K-H-G)串联而成，10拷贝的BS基因序列上下游分别带有EcoRI和Sail site位 点。经测序，该BS样肽基因片段序列如SEQ ID N0.2所示。重叠PCR反应条件94°C预变性3min，进入PCR循环94°C，45s，退火温度从58°C， 每循环1. 5min，共35个循环；68°C延伸lOmin，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR 产物电泳后可见三条约IOObp大小的条带(图1)。EcoRIFl :5-CA \GAATT(\ AAACACGGTAAGCACGGCAAACATGGTAAACACGGTAAGCATGGC-3 (SEQ ID NO. 3)SailF2 :5-G \GTCGA(\ TTAACCGTGTTTACCGTGCTTACCGTGTTTGCCATGTTTACCGTGCTTG-3 (SEQ ID NO. 4)2)囊素样肽重组表达载体的构建用核酸限制性内切酶EcoR I和SalI分别对BS样肽基因片段和表达载体pET_32a 进行双酶切，经过酶切的BS样肽基因片段和表达载体pET-32a按1 4的摩尔比4°C过夜 连接，构建囊素样肽重组表达载体PET32a-BS，该重组表达载体PET32a-BS中的BS样肽基因 为10拷贝的BS基因(图2)。
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3)转化大肠杆菌DH5a利用CaCl2法制备感受态的大肠杆菌DH5 α，取上述重组表达载体PET32a_BS加入 含有50 μ L感受态的大肠杆菌DH5 α的聚丙烯离心管中，轻轻混勻后冰浴20min。将聚丙烯 离心管从冰中取出后45°C热休克50sec，然后立即冰浴lmin。加入400 μ L 30°C预热的LB 培养基，于30°C振摇lh。取150 μ L菌液均勻涂布含氨苄青霉素(Amp) 50 μ g/ml的琼脂LB 平板，在37°C放置30min后，倒置培养20h。挑取阳性菌株，提取重组质粒。CaCl2法采用本 领域常规方法操作。上述步骤也可参见大肠杆菌DH5 α产品使用说明书。4)囊素样肽诱导表达将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21 (DE3)中，挑取单菌落接种到盛有5ml LB液体 培养基(50μ g/ml氨苄青霉素)试管中，于30°C摇床振荡培养过夜，第二天从中取出菌体加 到另一盛有IOml LB液体培养基中，使菌体浓度达到0D600 0. 1，30°C振摇培养6 8小 时，当菌体浓度0D600 0. 4 0. 6时，加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导表达6 8h， 收集菌液。取样进行SDS-PAGE凝胶电泳(图3)，光密度扫描表明，BS含量占菌体总蛋白的 28. 6%。5)囊素样肽的后处理将表达后的囊素样肽菌液经过4°C，lOOOOrpm/min离心lOmin，收集菌体沉淀， 用0°C冰冷的高渗透溶液悬浮菌体沉淀，混合均勻，冰浴lOmin。然后，4°C，lOOOOrpm/min 离心lOmin，收集菌体沉淀，用等体积0°C冰冷的低渗透溶液轻轻悬浮菌体沉淀，冰浴放置 lOmin，并不时的倒转离心管混勻。4°C，10000rpm/min离心IOmin ；然后，离心取上清液，过 0. 22um混合纤维素膜，得到囊素三肽。所述高渗透溶液pH= 8. 5，终浓度 Tris-HCl 25mmol/L、EDTA 2. 5匪ol/L、蔗糖 25wt% ；所述的低渗透溶液为:pH = 8. 5，终浓度 Tris-HCl 25讓。1/L、EDTA 2. 5mmol/L。所述LB培养基组分如下Tryptone (胰蛋白胨)IOgYeast Extract (酵母提取物)5gNaCl (氯化钠)IOgH20(水):1000ml配置固体培养基，则再加入15g Agar (琼脂)。对照例采用李萍等在中国兽医杂志第2006-42-4期中提到的生物方法合成囊素三肽1)设计并合成囊素三肽基因片段按照大肠杆菌的惯用密码子将囊素的3个氨基酸转化为核甘酸序列设计以下两 条基因片段BSl和BS2，两条基因片段由博亚生物工程公司合成，此外，根据pBAD/TOPO的克 隆位点的下游设计合成一条检测引物P1，与插入片段BSl配对，用于检测插入方向是否正 确。片段序列如下。BSl 5' -atgggtcataaaggtcataaaggtcataaaggtcataaaggtcataaaggtcataaaggtca taaa-3’ (SEQ ID NO. 5)BS2 5' -tactttatgacctttatgacctttatgacctttatgattatgacctttatgacctttatgac c-3，(SEQ ID NO. 6)
Pl 5' -gcaaccaaagtgggtgcactg-3‘ (SEQ ID NO. 7)2)表达载体的构建用PCR方法扩增BS基因，引物为BSl和BS2，以自身为模板。PCR产物为编码8彳 BS三肽的cDNA片段，命名为BS8，其表达产物为BS8。PCR产物的回收与纯化按Omega公司 的胶纯化试剂盒说明书进行。纯化回收得到的PCR产物与pBAD/TOPO载体以T-A尾进行连 接。连接产物转化T0P10感受态细胞，用PCR鉴定阳性克隆菌落并命名为pBAD-BS-TOPIO。3)基因片段在pBAD/TOPO上的诱导表达将阳性菌种pBAD-BS-TOPIO在含Amp的LB培养基中培养至OD6tltl值达0. 5时，加 入终浓度为0. 02%的L-阿拉伯醛糖进行诱导表达。SDS-PAGE凝胶电泳(图4)，光密度扫 描表明，BS最高表达量占菌体总蛋白的23.7%。对照例中的实验步骤可按相关公开文献进 行操作。经检测可以发现，本发明所述的表达基因可以在宿主细胞中高效表达，BS含量可 占菌体总蛋白的28. 6%，表达量远远高于现有技术中最高表达量的23. 7%，使囊素三肽用 生物合成法进行工业化生产成为可能。实施例2本实施例中的BS样肽基因片段为由山东华辰生物科技有限公司按照SEQ ID N0. 2 所示序列人工合成。如实施例1所述，不同之处在于BS样肽基因片段及表达载体pET_32a的连接步骤 如下用EcoR I和Xho I分别对BS样肽基因片段和表达载体pET_32a进行双酶切，酶 切体系组成如下
34. 0 μ L ddH2034. 0 μ L
5. OyL 10ΧΗ Buffer5. 0 μ L
10. 0 μ L 表达载体 pET-32a 10. 0 μ L 0. 5μ L EcoR I0. 5μ L
0· 5 μ L Xho I0· 5 μ L
混勻上述反应体系，并置于37°C水浴作用3h，酶切产物同样经1. 5%琼脂糖凝胶 电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行回收鉴定。经过双酶切的BS样肽基因片段和同样经过双酶切的表达载体pET_32a按1 2.5 的摩尔比4°C过夜连接，构建囊素样肽重组表达载体PET32a-BS。经检测，BS最高表达量占菌体总蛋白的30. 6%。
ddH20
10XH Buffer BS样肽基因片段 EcoR I Xho I
权利要求
一种基因工程囊素样肽，具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述基因工程囊素样肽的基因片段，具有如SEQ ID NO. 2所示 核苷酸序列。
3.一种含有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的表达载体。
4.权利要求2所述的基因工程囊素样肽的基因片段在制备囊素三肽中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下(1)将基因工程囊素样肽的基因片段插入表达质粒，得到重组质粒；(2)将步骤(1)制得的重组质粒转化宿主菌，构建宿主菌表达体系；(3)利用步骤(2)构建的宿主菌表达体系诱导表达囊素样肽，并经过后处理工艺制得 囊素三肽。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤⑴中所述将基因工程囊素样肽的基因 片段插入表达质粒，是指用核酸限制性内切酶EcoR I及Sail、Xho I或HindIII之一双酶 切基因工程囊素样肽的基因片段，连接到相同酶切的表达质粒上，然后进行测序验证。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述表达质粒为pET-32a、pET_32b或 pET_32c。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述宿主菌为大肠杆菌 BL21(DE3)。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)中后处理工艺的步骤如下 将表达后的囊素样肽菌液经离心后，收集菌体沉淀，用0°C冰冷的高渗透溶液悬浮菌体沉淀，混合均勻，冰浴8 IOmin ；然后，离心收集菌体沉淀，用等体积0°C冰冷的低渗透溶液 悬浮菌体沉淀，混合均勻，冰浴8 IOmin ；然后，离心取上清液，过0. 2 0. 24um混合纤维素膜，得到囊素三肽。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述高渗透溶液pH= 8. 5，终浓度 Tris-HC120 30mmol/L、EDTA 2 3mmol/L、蔗糖 25wt% ；所述的低渗透溶液为pH = 8. 5， 终浓度 Tris-HCl 20 30mmol/L、EDTA 2 3mmol/L。
全文摘要
本发明涉及一种基因工程囊素样肽及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。一种基因工程囊素样肽，具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，它由具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的基因片段编码。本发明所保护的基因工程囊素样肽的基因片段，可以准确、高效的复制表达，该基因插入表达载体pET-32a转化入大肠杆菌BL21(DE3)后，经高效表达，BS(囊素三肽)含量含量可占菌体总蛋白的28.6％，完全达到工业化生产的要求。
文档编号C07K1/14GK101880314SQ20101019026
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者刘刚, 姜正军, 崔丽萍, 朱孟豪, 杨航, 王茂超, 田建国, 苏晓明, 陈溥言 申请人:山东华辰生物科技有限公司