专利名称：高通量筛选三氮唑类单胺氧化酶抑制剂的方法及化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用“点击化学”构建三氮唑化合物并高通量筛选单胺氧化酶抑 制剂的方法，以及筛选到的三氮唑类化合物。
背景技术：
点击化学(Click chemistry)，又译为“链接化学”、“动态组合化学”(Dynamic Combinatorial Chemistry)、“速配接合组合式化学”，是由化学家巴里·夏普莱斯在2001 年引入的一个合成概念，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化 学合成。它尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法，并借助 这些反应(点击反应)来简单高效地获得分子多样性。点击化学的概念对化学合成领域有 很大的贡献，在药物开发和分子生物学的诸多领域中，它已经成为目前最为有用和吸引人 的合成理念之一。
发明内容
本发明目的是提供一种利用“点击化学”构建三氮唑化合物并高通量筛选单胺氧 化酶抑制剂的方法，以及筛选到的新的具有单胺氧化酶抑制活性的三氮唑类化合物。本发明采用的技术方案是一种高通量筛选三氮唑类单胺氧化酶抑制剂的方法，所述方法包括(1)利用“点击化学”方法，构建三氮唑类化合物库，所述三氮唑类化合物构建方法 如下以等摩尔量的式(II)所示的叠氮类化合物和和式(III)所示的炔类化合物为反应底 物，在CU+/CU2+存在下，于叔丁醇的水溶液中，38 32°C摇床反应24h以上，反应结束后，进 行质谱分析，如果炔和叠氮类化合物的峰消失，出现新的符合相应的三氮唑的峰，则认为反 应完全，生成了式(I)所示三氮唑类化合物，进行下一步操作； 式⑴ (III)中:R和R1为取代或未被取代的苯环类、杂环类或链烃类取代基；上述取代基R和R1 并不是本发明要求保护的内容，本发明只是提供一个利用点击化学构建三氮唑类化合物并 以此筛选单胺氧化酶抑制剂的途径，具体选择何种取代基，本领域普通技术人员可在筛选 过程根据实际情况进行取舍筛选。目前有多种方法检测单胺氧化酶的活性分光光度法、放射性法、高效液相法以及 荧光探针法等。分光光度法、放射性法、高效液相法等都不适合高通量的筛选而荧光探针 具有很高的灵敏度和专一性，并且样品不需要复杂的提纯，因此荧光探针法被广泛应用于 生物医学和生物学。
本发明点击化学法构建三氮唑类化合物的方法有以下几个优点①在室温条件下 就可反应，反应条件温和；②反应溶剂为叔丁醇和水不影响单胺氧化酶的酶活；③反应完 全，没有副产物，同时硫酸铜和抗坏血酸对单胺氧化酶的酶活几乎没有影响。有了这些优点 再结合荧光探针的特点就可以不经提纯直接检测酶活，粗筛出活性结构。(2)采用荧光探针法检测三氮唑类化合物的单胺氧化酶活性取步骤(1)含三氮 唑类化合物的反应液，以水稀释至浓度为50 100 μ Μ,吸取稀释液加入96孔板的反应孔 中，再加入ΡΗ8. 4硼酸缓冲液和BSA，加入适量MAO-A或ΜΑ0-Β，混合物在38°C反应3h，然后 加入荧光探针，再在38°C反应2h，用全功能荧光分光光度计Uex/Xem = 365/460nm)进行 检测；根据荧光值的高低判断三氮唑类化合物对单胺氧化酶抑制活性的高低荧光强度越 强，则抑制活性越弱；反之其抑制活性就越强。所述荧光探针为下列之一 (1)4-甲基-7-(3_氨基丙基)_香豆素、(2)苯丙胺、 (3)4-甲基-7-(l-甲基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-氧基)_香豆素。上述荧光探针反应机理以4-甲基-7-(3-氨基丙基)_香豆素为例该化合物其本 身并无荧光，但经与单胺氧化酶作用，3-氨基丙基转化为醛，接着发生消除反应后，生成了 具有强烈荧光性能的4-甲基-7-羟基香豆素。因此通过检测荧光的变化就可检测MAO的 活性。优选的，所述步骤(1)中叔丁醇与水体积用量之比为1 1。所述链烃类取代基包括甲基、甲氧基、乙氧基、羟基、卤素、吡啶基、苯甲氧基、硼酸 基、二甲氨基、羟乙基甲氨基、硝基、羧基、苯乙烯基、二苯氨基、嘧啶基，醚、乙酰基、乙酰氧 基等。这些链烃长度为2 5个碳，可以是直链也可以含有支链，支链数目为1 5个。所述苯环或链烃上的取代基包括(1)烷烃类取代基包括甲基、乙基；(2)烯烃类 取代基包括苯乙烯基，其中苯乙烯基的苯环上可以含有甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、羟基、 卤素、羧基、硝基、乙酰氧基等基团，这些基团位于取代基的苯环的2 5号位，数目为0 5 个，取代基可以是相同的也可以是不同的；(3)卤素类取代基包括氟、氯、溴、碘；醚类取代 基包括甲氧基、乙氧基、苯甲氧基，其中苯甲氧基的苯环上可以含有甲基、乙基、甲氧基、乙 氧基、羟基、卤素、羧基、硝基、乙酰氧基等基团，这些基团位于取代基的苯环的2 5号位， 数目为0 5个，取代基可以是相同的也可以是不同的；(4)芳烃类取代基包括苯基、带有 取代基的苯基，其中苯基的取代基可以是甲基、甲氧基、乙氧基、羟基、卤素、吡啶基、苯甲氧 基、硼酸基、带有取代基的苯基、二甲氨基、羟乙基甲氨基、硝基、羧基、苯乙烯基、二苯氨基、 嘧啶基，醚、乙酰基、乙酰氧基等。这些取代基团位于苯环的2 5号位，取代基的数目0 5个，这些取代基可以是相同的也可以是不同的；(5)有机含氮类取代基包括硝基、二甲氨 基、二苯氨基、羟乙基甲氨基；(6)杂环类取代基包括吡啶、嘧啶等。所述杂环类取代基包括呋喃、吡唑、蒽环、吲哚、喹啉、苯并吡喃-4-酮等。杂环上 的取代基包括甲基、甲氧基、羟基、硝基、卤素、羧基等。取代基的数目0 5个，可以是相 同的也可以是不同的。优选的，所述步骤(1)中所述三氮唑类化合物构建方法如下将所述炔类和叠氮 类化合物分别溶解在叔丁醇中，制成浓度IOmM的溶液1和溶液2 (也可将炔类和叠氮类化 合物同时溶解在叔丁醇中)；硫酸铜和抗坏血酸分别溶解在水中，制成硫酸铜浓度0. ImM的 溶液3、抗坏血酸浓度ImM的溶液4，取等体积的溶液1、2、3和4混合，38 32°C摇床反应24h以上，反应结束后，进行质谱分析。本发明还涉及一种上述方法筛选获得的三氮唑类化合物，结构如式(I-I)所示 本发明还涉及一类按上述方法筛选获得的三氮唑类化合物，结构如下式所示 优选的，所述三氮唑类化合物为下列之-本发明的有益效果主要体现在(1)所构建的筛选单胺氧化酶抑制剂的方法，方 法新颖，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所得到的单胺氧化酶抑制剂性 质很稳定，纯度也很高(99%以上)；(2)与以前所研究的单胺氧化酶抑制剂的方法相比，快 速高效，节约成本和时间，所筛得的新型三氮唑类单胺氧化酶抑制剂，结构简单，其抑制活 性、对MAO-A和MAO-B选择性都有很大的提高，具有高通量筛选的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于
此 实施例1 方法
(1)将所述炔类(III)和叠氮类化合物(II)分别溶解在叔丁醇中，制成炔类化 合物浓度IOmM的溶液1、叠氮类化合物浓度IOmM的溶液2 ；硫酸铜和抗坏血酸分别溶解在 水中，制成硫酸铜浓度0. ImM的溶液3、抗坏血酸浓度ImM的溶液4。Iml的小瓶中分别加 入上述溶液 1(10 μ 1，lequiv)、溶液 2(10 μ 1，lequiv)、溶液 3(10 μ 1，1% equiv)和溶液 4(10μ 1，10% equiv)混勻。将上述小瓶放在30°C的摇床中反应24h。时间结束后，用质 谱分析，如果炔和叠氮化合物的峰消失，出现新物质的峰符合相应的三氮唑，则认为反应完 全，产生了所述三氮唑类化合物(I)；(2)将步骤(1)构建的三氮唑的反应用水冲淡到浓度为100 μ M，吸取4 μ 1加入96 孔板，然后加入 MA0-A(20mg/ml)或 MAO-B (20mg/ml) 4 μ 1，硼酸缓冲液(ρΗ = 8. 4)400 μ 1， 4μ 1 BSA(20mg/ml)，混合物在38°C反应3h，然后加入探针4-甲基_7_ (3-氨基丙基)-香 豆素2μ l(10mmOl/ml)，三氮唑最终浓度在1(Γ2πιπι01/1以下，混合物再在38°C反应2h，用全 功能荧光分光光度计(λ ex/ λ em = 365/460nm)进行检测。按照上述方法，得到的部分活性较好的三氮唑类化合物的结构及其对MAO-A和 MAO-B的抑制活性见表1 表 1 实施例2 :1-(4_吡啶)_基-4-甲胺基-IH-[1，2，3]三氮唑(I-I)的制备合成路线如下 50ml圆底烧瓶中加入4_叠氮吡啶(0. 8ml)，丙炔胺(0. 47ml)和t_Bu0H/H20(共 2ml，1 1，ν/ν)，溶解完全后，加入硫酸铜(0.017g，l%mol)，再加入抗坏血酸(0. 12g,10% mol)，室温搅拌24h，3*20ml 二氯甲烷萃取，NaHCO3饱和溶液洗，无水硫酸镁干燥，过滤，抽干，柱层析纯化，得到黄色固体，产率91%。化合物表征=1H-NMR(D2O) δ 8. 55-8. 54 (m, 2H, CH)，7. 71-7. 70 (m, 2H, CH)，8. 35 (s, 1H, -CH = C),3. 85 (s,2H, CH2). ESI-MSm/z 176. 1(M+1)+.实施例3 :1-苯基-4-甲胺基-IH-[1，2，3]三氮唑(1-2)的制备合成路线如下 具体操作过程参考实施例2。化合物表征=1H-NMR(D2O) δ 8. 02 (s, 1H，-CH = C)， 7. 44-7. 43 (m, 2H, CH)，7. 37-7. 31 (m, 3H, CH)，3. 75 (s, 2H, CH2) · ESI-MSm/z 175. 1 (M+1) +·实施例4 :4-(4-甲胺基_[1，2，3]-三氮唑)基苯甲酸(1-3)的制备合成路线如下 50ml圆底烧瓶中加入4-羧基苯基叠氮(0. 3g)，丙炔胺(0.13ml)和t_BuOH/ H2O(共6ml，1 1，ν/ν)，溶解完全后，加入硫酸铜溶液(0. Iml,0. 045Μ，0· 1% mol)和抗坏 血酸(0. 2ml, 0. 32M，10% mol)，室温搅拌0. 5白色固体析出，继续反应24h，蒸去叔丁醇，加 入水15ml冲淡，盐酸酸化，过滤，正己烷洗，干燥，得到白色固体，产率91 %。化合物表征 1H-NMR(DMSO) δ 8. 95 (s, 1H, -CH = C),8. 18-8. 16(d，2H，J = IOHz，CH)，8. 06-8. 04(d，2H， J= IOHz，CH)，4. 25 (s，2H，CH2). ESI-MSm/z 219. 1 (M+1)+·实施例5 :3-(4-甲胺基-[1，2，3]_三氮唑)基苯甲酸(1-4)的制备合成路线如下 具体过程参考实施例4。化合物表征=1H-NMR(DMSO) δ 8. 87 (s，1H，-CH = C)， 8.33(s，lH，CH)，8· 02-8. 02(d，2H，J = 10Hz, CH)，7· 69 (s，1H，CH)，4· 21 (s，2H，CH2). ESI-MSm/z 219. 1(M+1)+。
权利要求
一种高通量筛选三氮唑类单胺氧化酶抑制剂的方法，所述方法包括(1)利用“点击化学”方法，构建三氮唑类化合物库，所述三氮唑类化合物构建方法如下以等量的式(II)所示的叠氮类化合物和和式(III)所示的炔类化合物为反应底物，在Cu+/Cu2+存在下，于叔丁醇的水溶液中，38～32℃摇床反应24h以上，反应结束后，进行质谱分析，如果炔和叠氮类化合物的峰消失，出现新的符合相应的三氮唑的峰，则认为反应完全，生成了式(I)所示三氮唑类化合物，进行下一步操作；式(I)～(III)中R和R1为取代或未被取代的苯环类、杂环类或链烃类取代基；(2)采用荧光探针法检测三氮唑类化合物的单胺氧化酶活性取步骤(1)含三氮唑类化合物的反应液，以水稀释至浓度为50～100μM，吸取稀释液加入96孔板的反应孔中，再加入pH8.4硼酸缓冲液和BSA，加入适量MAO-A或MAO-B，混合物在38℃反应3h，然后加入荧光探针，再在38℃反应2h，用全功能荧光分光光度 计(λex/λem＝365/460nm)进行检测，根据荧光值的高低判断三氮唑类化合物对单胺氧化酶抑制活性的高低荧光强度越强，则抑制活性越弱；反之其抑制活性就越强。FDA0000023143590000011.tif
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述荧光探针为下列之一(1)4-甲 基-7_(3-氨基丙基)-香豆素、(2)苯丙胺、(3)4-甲基-7-(l-甲基-1，2，3，6-四氢吡 啶-4-氧基)_香豆素。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中叔丁醇与水体积比为1 1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述三氮唑类化合物构建方 法如下将所述炔类和叠氮类化合物分别溶解在叔丁醇中，制成浓度IOmM的溶液1和溶液 2 ；硫酸铜和抗坏血酸分别溶解在水中，制成硫酸铜浓度0. ImM的溶液3、抗坏血酸浓度ImM 的溶液4，取等体积的溶液1、2、3和4混合，38 32°C摇床反应24h以上，反应结束后，进行 质谱分析。
5.一种按权利要求1方法筛选获得的三氮唑类化合物，结构如式(I-I)所示
6.一种按权利要求1方法筛选获得的三氮唑类化合物，结构如下式所示 R2SH或羧基。
7.如权利要求6所述的三氮唑类化合物，其特征在于所述三氮唑类化合物为下列之
全文摘要
本发明提供了一种利用“点击化学”构建三氮唑化合物并高通量筛选单胺氧化酶抑制剂的方法，以及筛选到的三氮唑类化合物。本发明式(II)所示的叠氮类化合物和和式(III)所示的炔类化合物为反应底物，经点击化学构建得到式(I)所述三氮唑类化合物，再以荧光检测方法检测单胺氧化酶抑制活性，方法新颖，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所得到的单胺氧化酶抑制剂性质很稳定，纯度也很高(99％以上)；与以前所研究的单胺氧化酶抑制剂的方法相比，快速高效，节约成本和时间，所筛得的新型三氮唑类单胺氧化酶抑制剂，结构简单，其抑制活性、对MAO-A和MAO-B选择性都有很大的提高，具有高通量筛选的特点。
文档编号C07D401/04GK101881733SQ20101021947
公开日2010年11月10日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者朱勍, 贾朝 申请人:浙江工业大学