专利名称：一种固相制备布舍瑞林的方法
一种固相制备布舍瑞林的方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽的合成方法，尤其涉及布舍瑞林固相合成的方法。背景技术：
过去10年来，多肽类药品已成为国际药学界研究的热门课题，并已成为许多厂商 竞相开发的目标。据一家著名国际医药技术咨询公司透露目前全球多肽类药物的原料药 总产值估计为4亿美元左右。据统计，国际市场上现有多肽类药物约35种，其中畅销产品 包括布舍瑞林、亮丙瑞林、戈瑞林、促黄体激素拮抗剂以及罗氏多肽类新药Fuzeon等。还 有几种抗SARS病毒、HIV病毒的活性肽类新药即将被美国FDA批准上市。不仅美国公司在 开发多肽类新药，一些传统欧洲制药强国如瑞士、瑞典、荷兰、法国、德国和英国均在大力开 发活性肽类新药。其中布舍瑞林(Buserelin)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、戈舍瑞林(Goserelin)、 曲普瑞林(Triptorelin)、阿拉瑞林(Alarelin)、戈那瑞林(Gonadorelin)、舍莫瑞林 (Sermorelin)、那法瑞林(Nafarelin)和组胺瑞林(Histrelin)属于促黄体生成素释放激 素(LHRH)类似物，该类研究较为成熟。LHRH是由下丘脑分泌的十肽激素，能促进垂体合成并释放黄体生成素(LH)和卵 泡刺激素(FSH)，激发青春期发育和调节生殖、生育及性激素产生。当外源性LHRH或其类似 物以生理脉冲频率(每90分钟一次)短期、小剂量给药时，对垂体性腺系统起促进作用，用 于治疗性功能低下、不排卵、青春期延缓；而以非生理脉冲频率长期、大剂量给药时，可抑制 垂体分泌LH和FSH，导致性腺分泌激素能力下降，性器官萎缩，用于治疗一些激素依赖性疾 病，如前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位症及青春期性早熟。所以说布舍瑞林(Buserelin)及其类似物具有很高的药用价值和广阔的市场前 景，但现有的制备方法主要是液相合成工艺，操作复杂，不利于工业生产、应用价值不高，于 是要求有更优异的生产工艺。
发明内容本发明的目的是提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实 现产业化的布舍瑞林固相合成方法。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种制备布舍瑞林的方法，包括以下 步骤1)用固相合成方法由Fmoc-Pro-OH和取代度为0. 2mmol/g至0. 9mmol/g的 HMPB-MBHA 树脂出发，得到取代度为 0. 15mmol/g 至 0. 80mmol/g 的 Fmoc-Pro-HMPB-MBHA 树 脂；2)将Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸得到布舍瑞 林-HMPB-MBHA 树脂；3)将布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂进行裂解，得到全保护肽；
4)得到的全保护肽经过经过乙胺化、脱保护、纯化，得到布舍瑞林。进一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工艺，其中，步骤1)优选生成取代度为 0. 60mmol/g的Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂。固相合成方法特指多肽的固相合成法。发明人意外的发现，采用HMPB-MBHA树脂可以在弱酸条件就能把肽切割下来，可 以使全保护肽不被破坏，能满足做全保护肽的需要。发明人经过多次反复实验，发现当树脂取代度大于0.9mmol/g时，难以偶联完 全；当树脂取代度小于0. 2mmol/g时，会造成树脂浪费，并发现取代度为0. 60mmol/g时，产 品收率最高，纯度最好。故本发明采用的HMPB-MBHA树脂取代度为0. 2mmol/g至0. 9mmol/ g，优选取代度为0. 60mmol/go更进一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工艺，其中，步骤2)中氨基酸的偶联剂 体系为 DIC+A 或 B+A 或 B+A+C 或 C，其中 A 为 HOBt 或 HOAt，B 为 HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP， C为DIPEA或TMP。实验发现，采用本发明的多种偶联剂体系，能够显著提高反应效率。本 发明偶联体系能提高反应速度，让反应进行得更彻底，避免了二次偶联。依肽序逐步偶联采用的有机碱包括TMP或DIPEA，采用DIPEA或TMP替代，这样能 防止消旋。“保护氨基酸”是指N端采用Fmoc保护的氨基酸，各种氨基酸分别以Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Arg(HCl)-OH、Fmoc-Leu-OH Fmoc-D-Ser(tBu) _0H、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser (Trt)_0H、 Fmoc-Trp-0H、Fmoc-His (Trt)-OH和pGlu的形式应用。在接氨基酸过程中每一步都经过 Kaiser Test 检测。再进一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工艺，其中，步骤3)裂解试剂是三氟乙 酸的二氯甲烷溶液。布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂进行裂解后，可以用冰乙醚进行沉淀。全保 护肽是指 pGlu-His (Trt) -Trp-Ser (Trt) -Tyr-D-Ser (tBu) -Leu-Arg (HCl) -Pro-OH 粗肽，所 述“粗肽”的HPLC纯度> 90 %。Fmoc保护基通过哌啶处理来除去。步骤3)裂解试剂是三氟乙酸的二氯甲烷溶液。步骤4)所述“纯化”是指全保护肽经过液相甲酯化、氨解、再脱保护，高效液相纯 化。脱保护所使用的裂解试剂是三氟乙酸的二氯甲烷溶液。本发明合成方法总收率达到35%，反应操作简单、后处理容易、原料投入少，低成 本的固相合成工艺，且与原有的纯液相合成工艺比较，具有中间步骤不用纯化、操作简单、 反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的优点。本发明总的工艺流程如下HMPB-MBHA Resin + Fmoc-Pro-OH - Fmoc-Pro-HMPB-MBHA Resin
20%哌啶/DMF偶联__
-H-Pro-HMPB-MBHA Resin+ Fmoc-Arg(HCl)-OH DIC+A or B+A+C~
20%哌啶/DMF 偶联 Fmoc-Arg(HCl)-Pro-HMPB-MBHA Resin -- -^ *
3-9贫基酸
pGIu-HisUr^-Trp-SerCTrO-Tyr-D-SeittBiO-Leu-ArgiHCD-Pro-HMPB-MBHA Resin 麵 ，pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-OH ~ pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-OMe -
pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHC2H5__
CrudeBuserelin 纯化--Buserelin上述流程中3-9氨基酸是指第三到第九个氨基酸。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人 员根据本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中
Fmoc9_芴甲氧羰基HBTU0-苯并三唑-N，N, N, N-四甲基脲鐺六氟磷酸盐HATU0-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N，N, N, N-四甲基脲鐺六氟磷酸盐TBTU0-(苯并三唑-1-氧)-N, N, N, N-四甲基脲鐺六氟硼酸盐PyBOP(苯并三唑-ι-氧)三吡咯烷子基磷鐺六氟磷酸盐DIC二异丙基碳二亚胺HOBt1-羟基苯并三唑
权利要求
一种固相制备布舍瑞林的方法，包括以下步骤1)用固相合成方法由Fmoc Pro OH和取代度为0.2mmol/g至0.9mmol/g的HMPB MBHA树脂出发，得到取代度为0.15mmol/g至0.80mmol/g的Fmoc Pro HMPB MBHA树脂；2)将Fmoc Pro HMPB MBHA树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸得到布舍瑞林 HMPB MBHA树脂；3)将布舍瑞林 HMPB MBHA树脂进行裂解，得到全保护肽；4)得到的全保护肽经过乙胺化、脱保护、纯化，得到布舍瑞林。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤1)的Fmoc-Pro-OH与HMPB-MBHA树脂 在DIPEA的作用下生成Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤1)得到取代度为0.60mmol/g的 Fmoc-Pro-HMPB-MBHA 树脂。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤1)得到取代度为0.60mmol/g的 Fmoc-Pro-HMPB-MBHA 树脂。
5.根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于步骤2)中采用的偶联剂包括 DIC/HOBt、DIC/HOAt、PyB0P/H0Bt、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt 或 HATU/HOAt。
6.根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于步骤2)中偶联采用的有机碱 包括TMP或DIPEA。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于步骤2)中偶联采用的有机碱包括TMP或 DIPEA0
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤3)的裂解采用的是三氟乙醇的二氯甲 烷溶液。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于=Fmoc保护基通过哌啶处理来除去。
全文摘要
本发明提供了一种固相制备布舍瑞林的方法，包括以下步骤1)用固相合成方法由Fmoc-Pro-OH和取代度为0.2mmol/g至0.9mmol/g的HMPB-MBHA树脂出发，得到取代度为0.15mmol/g至0.80mmol/g的Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂；2)将Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸得到布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂；3)将布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂进行裂解，得到全保护肽；4)得到的全保护肽经过乙胺化、脱保护、纯化，得到布舍瑞林。本发明的目的是提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的布舍瑞林固相合成方法。
文档编号C07K1/14GK101935339SQ20101025605
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者李红玲, 袁建成, 陈大来, 马亚平 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司