专利名称：一种曲霉半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备及其产品的制作方法
一种曲霉半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备及其产品所属领域生物医药范畴，更确切说是一种曲霉半乳甘露聚糖的单克隆抗体制备的方法及相关应用于临床诊断曲霉感染的产品。
背景技术：
经初步检索，未查到以烟曲霉中的半乳甘露聚糖蛋白等天然抗原来免疫小鼠，制备单克隆抗体专利。
发明内容
本发明是以烟曲霉为出发菌株，将发酵液经过乙醇沉淀、透析、离子交换柱层析和分子筛层析相结合的复合纯化技术，分离得到层析春的半乳甘露聚糖蛋白。接着以该蛋白为免疫原，免疫Balb/c雌性小鼠，通过有限稀释法获得亚克隆细胞株。然后，将这2株细胞株培养后，注入小鼠腹腔内(提前一周注射降植烷)。10-15天，取小鼠腹水，通过离子交换柱层析和分子筛层析结合的复合纯化技术来纯化单克隆抗体。其中，所有阳性细胞株的筛选都是选用直接酶联免疫方法。得到的单克隆抗体可以用来诊断临床的曲霉感染。先参照说明书附图将本发明内叙述如下一、曲霉菌株的来源烟曲霉购买自中国医学科学院皮肤病研究所，二、曲霉菌的培养2. 1曲霉培养基配方沙氏培养基蛋白胨IOg葡萄糖40g琼脂(固体，液体不加) 15g氯霉素0. Ig调节pH 6. 0 左右，115°C灭菌 15min。2.2曲霉培养条件37°C，100rpm，培养 9 天三、半乳甘露聚糖抗原的提纯半乳甘露聚糖蛋白抗原的纯化主要包括以下几个步骤，见说明书附图1 1、乙醇沉淀收集烟曲霉发酵液，使用旋转蒸发仪进行初步浓缩。接着向浓缩液中按照1 1 的比例加入无水乙醇，4°C静置过夜。离心分离后，收集沉淀物。2、透析将沉淀物置于透析袋(截留分子量5 000-8000KD)内，对水透析，过夜。3、离子交换柱层析对上述透析液进行DEAE-Saphedex柱层析，紫外检测器，检测波长260nm，进行洗脱，即(1)第一次洗脱使用无离子水，直至无紫外吸收峰出现；(2)第二次洗脱使用0. IM NaCl溶液洗脱至没有紫外峰为止。4、分子筛层析收集0. IM NaCl溶液的洗脱峰，浓缩后，进行TSK G2000柱层析，采用示差折光检测器，洗脱液为PBS (0. 1M，Ph7. 0)收集49min左右)出的峰，进行冷冻干燥。5、SDS-PAGE将纯化的半乳甘露聚糖抗原进行10% SDS-PAGE，结果显示该抗原分子量大小约为45KD(见说明书附图2)。四、单克隆抗体的制备与纯化1、使用动物为Bablc小鼠6周大小，雌性，驯化一周后开始免疫。2、免疫浓度为100 μ g蛋白/只老鼠，注射体积为1ml，混合等量的弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂/生理盐水，并充分乳化。3、初次免疫混合等量的弗氏佐剂，二次和三次免疫混合等量的不完全弗氏佐剂， 末次免疫混合等量的生理盐水。4、阳性克隆筛选采用直接酶联免疫反应法检测，酶标抗体选用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG。5、末次免疫后，引颈杀死小鼠，取其脾脏细胞；另取阴性对照健康小鼠，同样取脾脏细胞，制备成饲养细胞，杂交瘤细胞选用sp2/0骨髓瘤细胞。6、在无菌条件下，将脾脏细胞骨髓瘤细胞=5 1比例混合于不完全培养基中， 使用PEG1450作为融合剂，按照一般细胞融合细胞制备方法进行细胞融合。7、融合后，转移至预先加有完全培养基和饲养细胞的96孔板中。8、采用HAT培养基法初步筛选融合细胞。接着使用直接酶联免疫反应法来筛选阳性融合细胞，分别使用抗原、对照抗原(酵母来源的乳糖、大肠杆菌来源的脂多糖)进行排除筛选。9、单克隆细胞的制备采用有限稀释法，每次稀释后，进行阳性细胞的筛选。10、将经过三次稀释后的单克隆细胞，进行亚型鉴定，结果显示两株细胞皆为IgM 型的，分别命名为YRl和TO2。11、接着按照常规方法进行腹水制备。12、收集腹水，按照常规IgM抗体纯化方法纯化单克隆抗体。五、单克隆抗体的性能使用10 μ g的抗原包被微孔，将单克隆抗体按照二倍梯度稀释法来测定。结果如附图3所示。YRl和YR2对半乳甘露聚糖的活度常数分别为1 X IOltlUX 109，而对酵母来源的乳糖(Lac)、大肠杆菌来源的脂多糖(LPS)的活度常数分别为2X108和1X108、3X108和 5X107。具有良好的特异性。六、酶联免疫反应法试剂盒的组成1、YR2作为辣根过氧化物酶标记的酶标抗体，YRl作为捕获抗体，采用四甲基联苯胺(TMB)作为底物；2、质控方法阈值法，即每个试剂盒中装有阳性对照、阴性对照和阈值对照品，每个对照品均应控制在一定范围内(参见曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒标准)。
图1是曲霉半乳甘露聚糖提取流程图；图2是纯化的半乳甘露聚糖抗原的10% SDS-PAGE；
图3是单克隆抗体YR1、YR2对曲霉(半乳甘露聚糖)、酿酒酵母(乳糖)、大肠杆菌(脂多糖)的活度常数图。
权利要求
1.一种半乳甘露聚糖单克隆抗体制备，其是首先利用乙醇沉淀、离子交换层析、分子筛层析等方法从烟曲霉的发酵物中提取半乳甘露聚糖抗原，接着免疫小鼠，制备单克隆抗体YRl和YR2，为IgM免疫球蛋白，活度常数分别为1X101(I、1X109。使用YR2为酶标抗体， YRl为捕获抗体，可以制备成试剂盒，用来检测血清中的侵袭性曲霉，作为临床诊断的参考之一。
2.如权利要求1所述的烟曲霉来源为中国医学科学院皮肤病研究所。
3.如权利要求1所述的半乳甘露聚糖纯化的步骤为为乙醇沉淀，透析，离子交换层析， 分子筛层析。
4.如权利要求3所述的所用无水乙醇浓度为50%，4°C静置过夜。
5.如权利要求3所述的半乳甘露聚糖纯化的第二步为离子交换层析，采用DEAE-52凝胶，缓冲溶液为双蒸水，洗脱液为0. IM NaCl溶液，洗脱时间为30分钟左右。
6.如权利要求3所述的半乳甘露聚糖的第三步为分子筛层析，采用TSKG2000蛋白柱， 示差折光检测器，PBS缓冲溶液，收集49min左右出的峰。
7.如权利要求1所述的制备的半乳甘露聚糖单克隆抗体YRl和YR2，对酵母来源的乳糖，大肠杆菌的脂多糖均不发生特异性反应，而对半乳甘露聚糖抗原具有良好的特异性，其活度常数分别为1 XlOltlU X 109。
8.如权利要求1所述的使用YRl和YR2来制备曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，应用于临床诊断领域，并采用阈值质控法。
全文摘要
一种曲霉半乳甘露聚糖单克隆抗体的制备及其产品，本发明以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)为出发菌株，采用乙醇分级沉淀、离子交换柱层析和分子筛层析相结合的复合分离纯化技术，分离出曲霉半乳甘露聚糖蛋白。用半乳甘露聚糖蛋白免疫小鼠，末次免疫10天后，取小鼠脾脏细胞，阴性对照小鼠脾脏，制备饲养细胞。按照1∶5比例，和Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG的作用下细胞融合。试验获得2株阳性亚克隆YR1、YR2，且血清型检测均为IgM型，对曲霉半乳甘露聚糖活度常数为1×1010、1×109，对酵母来源乳糖的活度常数为2×108、1×108，对大肠杆菌来源脂多糖活度常数为3×108、5×107。用一株为捕获抗体，另一株为酶标抗体，用夹心酶联免疫原理，制备曲霉半乳甘露聚糖检测试剂盒，灵敏度达到0.1ng/ml。
文档编号C07K16/18GK102304183SQ201010552980
公开日2012年1月4日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者何永胜, 苑庆华 申请人:天津市一瑞生物工程有限公司