专利名称：基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法
技术领域：
本发明涉及一种化工技术领域的汞盐及其全抗原的制备方法，具体是一种基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法。
背景技术：
重金属离子是有毒的，持久的环境污染物。在自然环境中，特别是水体和土壤中， 残留的重金属离子可以直接或者间接的进入人体，与人体内的蛋白质或功能性酶发生不可逆转的强烈作用，对人类的健康构成严重的威胁。因此，对环境中的重金属的检测和监控是非常必要。现在比较常用的重金属检测方法是仪器分析法，例如原子吸收光谱法(atomic absorption spectroscopy,AAS)，电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)，电感耦合等离子体质谱(ICP-MQ，离子色谱法等。仪器分析方法比较准确，但是也存在耗时长，成本高，前处理复杂，处理通量小等缺点。重金属离子的免疫学检测方法是一种基于具有亲和性和特异性的“抗原-抗体” 反应的分析方法。因分子量小且免疫原性弱，重金属离子不能直接诱导动物产生抗体，因此需要将重金属离子以一定方式与蛋白质连接形成重金属离子全抗原，利用制备出的全抗原诱导动物产生针对重金属离子特异的抗体。免疫学方法具有快速，准确，处理通量大，前处理简单，成本低等特点，国内外已有用免疫学方法检测重金属离子的报道。重金属离子的免疫学方法的核心在于制备出高度特异的单抗隆抗体，而能否制备出特异的抗体的关键又在于重金属离子半抗原的制备。目前，国内外研究机构在制备重金属离子半抗原时使用的螯合剂主要是乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙烯三胺五乙酸(DPTA)，乙二醇二乙醚二胺四乙酸 (EGTA)，或类似的衍生物作为偶联剂，以一定比例与金属离子形成笼形结构的络合物。现有技术中免疫学方法制备抗体的缺点主要有1、免疫系统针对应答的是包含金属键在内的笼形结构，因此金属在抗原-抗体反应中不再起关键作用，起决定作用的是复合物的形状而不是与抗原结合点直接的物理接触。Wylie，D.E.等在《Proc. Natl. Acad. Sci. USA))(美国科学院院刊)1992年第89期4104-4108页发表了题为《Monoclonal antibodies specific for mercuric ions》(针对汞离子特异的单克隆抗体)一文，文中提及针对金属络合物或者含配位金属的蛋白特异的抗体将会与表位具有与诱导抗体产生的抗原相同构型的金属络合物结合，也就是说，这种抗体与其他金属有交叉反应性，所以这种特异性针对特定金属的特异性不强；2、络合物不稳定，汞离子在动物体内会被功能性酶剥夺，降低了免疫原性，造成动物中毒甚至死亡。因此，国内外还没有通过使用螯合剂制备出汞离子单克隆抗体的例子。有研究者使用谷胱甘肽作为偶联剂(D. E. ffylie, L. D. Carson, R. Carlson, F. W. Wagner, S. Μ. Schuster, Anal. Biochem. 194 (1991) 381)，连接汞离子和蛋白质，这种方法改进了螯合剂作为偶联剂的缺点，汞离子与谷胱甘肽的硫醇基通过共价键连接，在动物体内不会解离，但是也有缺点谷胱甘肽作为偶联剂，免疫原性过低，产生的抗体效价很低。因此，本发明要解决的技术问题是克服现有技术中制备的汞离子抗原特异性不
3强，抗原安全性差以及免疫原性过低的缺点，提供一种新的抗原及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法。本发明的制备方法反应体系简单，制备过程简单；制备得到青霉烯酸硫醇汞盐性质稳定，可作为汞离子的半抗原。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及一种青霉烯酸硫醇汞盐，具体结构如下其中，队为C6H5-CH2-, R2 为 Na、K 或 H。本发明还涉及所述青霉烯酸硫醇汞盐的制备方法，包括如下步骤步骤一，在咪唑的存在下，将青霉素G钠盐或青霉素G钾盐与氯化汞反应；步骤二，纯化反应产物，制备得到青霉烯酸硫醇汞盐。步骤一中，所述反应的pH为6.0 9.0。步骤一中，所述反应在60°C下进行。步骤一中，所述反应的时间为2小时。步骤二中，所述纯化为10000rpm离心纯化反应产物。步骤二中，所述纯化为IOOOOrpm离心5min纯化反应产物。本发明涉及一种青霉烯酸硫醇汞盐的应用，将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗原。本发明涉及基于上述青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法，以EDC -HCl作为水溶性催化剂，将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗原经过与蛋白质牛血清白蛋白偶联后，形成一种新的汞离子全抗原，具体步骤为通过将纯化后的50mg半抗原转移至烧杯中，滴加 10ml4% NaHCO3，加入200mg EDC · HC1，搅拌lOmin，使得半抗原上的羧基充分活化。加入 50mg BSA (或OVA)，搅拌12个小时；反应完毕后，离心两次，过滤一次去除未反应的固体杂质，上清液转移至透析袋(截留分子量为10000)中透析2天，更换4次透析液，每次透析时间大于5小时，透析液为IOmM pH 7. 4PBS。透析完毕后，将全抗原溶液定容，取出一定量的溶液进行紫外和ICP-AES检测，其余的全抗原溶液分装并冻成干粉，-20°C保存。与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明的制备方法反应体系简单，制备过程简单；制备得到青霉烯酸硫醇汞盐性质稳定，可作为汞离子的半抗原；汞离子在半抗原中通过共价键的形式连接，在体内不会解离，不会引起动物的中毒；半抗原分子中有相邻的汞离子、恶唑酮环和苯环三个抗原决定簇，免疫原性强；金属原子完全暴露在外，在免疫反应中可以与抗体进行直接的物理接触。
图1为青霉烯酸硫醇汞盐与青霉素G钠盐或钾盐的紫外可见吸收光谱。图2为青霉烯酸硫醇汞盐的红外图谱。图3为青霉素G钠盐或钾盐的红外图谱。图4为抗原青霉烯酸硫醇汞盐-牛血清白蛋白和蛋白质BSA的紫外可见吸收光
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具体实施例方式以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例步骤一，青霉烯酸硫醇汞盐的制备取青霉素G钠盐或钾盐50mg溶解在IOml超纯水中，加入Ig咪唑，搅拌使其完全溶解，逐滴加入IM HCl调pH至6. 8 ；加入与青霉素G钠盐或钾盐等物质的量的HgCl2,即7ml 的8mg/ml的HgCl2溶液，60°C水浴中加热2个小时，取出，室温中冷却，反应产生有苦杏仁气味的黄色粉末状沉淀；步骤二，青霉烯酸硫醇汞盐的纯化青霉烯酸硫醇汞盐分子因为含有金属，所以有无机物的性质，其在偏酸性的溶液中不溶，因此可以通过酸式沉淀法来分离纯化青霉烯酸硫醇汞盐。在步骤一所得的溶液中加入过量的1MHC1，边滴边轻轻震荡，溶液中产生大量黄色絮状沉淀，将溶液分装在細1 EP 管中，lOOOOr/m离心5分钟，弃去上清液；在EP管中加入超纯水洗涤沉淀，EP管置于振荡器上振荡2min，然后置于离心机中10000r/m离心5分钟，重复洗涤2次。洗涤离心并弃去上清液后，得到黄色沉淀；步骤三，检测产物青霉烯酸硫醇汞盐是青霉素在咪唑和汞离子作用下定量生成的降解产物，产物因含有一个恶唑酮环，所以在320nm 345nm之间有特征紫外吸收，该方法为定量检测青霉素 V钾片中青霉素含量的方法(中国药典，第二部分，1995，334页)。因此可以通过紫外扫描判定青霉烯酸硫醇汞盐是否合成成功。对步骤二得到的产物进行检验，从图1中可以看出， 在325nm处有特征吸收，证明青霉烯酸硫醇汞盐合成成功。由于青霉烯酸硫醇汞盐在水和有机溶剂中溶解度很低，因此可用红外光谱法来检测所得产物的结构和纯度。图2是青霉烯酸硫醇汞盐的红外图谱，由图2可知青霉烯酸硫醇汞盐3400(^1ν。H(_C_]，2500(^1 ν "^,)^ 1677011-1 vc =。(_c = c_c = 0)], 1400cm-1 [ δ as-C (CH3) 2]和 1368cm—1 [ δ S-C (CH3) 2]，1010cm—1 [ ν J ；图3是青霉素G钠盐或钾盐的红外图谱，由图3可知青霉素G 钠盐或钾盐:3377cm-1 [ ν 0H(_C_]，1774cm_l [ ν c = 0，β -内酰胺环的特征峰]，1680cm"1 [ vc = 0,酰胺]，HOOcnT1 [ δ as-C (CH3) 2]和 1354cm"1 [ δ s~C (CH3) 2]， 1018cm-1 [ vj 0 1774cm-1 ( β -内酰胺的特征峰)消失了，表明β _内酰胺环在合成反应中被完全降解了。半抗原中的2500cm—1处的峰表明MMPA中存在_SH(或-S-Hg+)。其它非特异的峰在青霉素和MMPA中都存在，比如750CHT1，700CHT1 (单取代苯环)，^27011-1 (-CH2)，1400， 1368cm-1 [-C(CH3)2]。明显地，图2和图3红外光谱的比较可以充分证明合成的半抗原的结构中存在恶唑酮环，取代了青霉素中的β-内酰胺环。青霉烯酸硫醇汞盐含有一个羧基(-C00H)，可以和蛋白质的氨基(-NH2)偶联，生成全抗原。青霉烯酸硫醇汞盐被创新性的用作汞离子半抗原，经过与蛋白质牛血清白蛋白偶联后，形成一种新的汞离子全抗原。为了提高反应的选择性和效率，在反应溶液中需加入一定量的水溶性催化剂EDC ·Ηα，EDC可以活化羧基，与羧基形成不稳定的中间物。反应过程如下将纯化后的50mg半抗原转移至烧杯中，滴加10ml4% NaHCO3，加入200mg EDC · HCl, 搅拌lOmin，使得半抗原上的羧基充分活化。加入50mg BSA (或OVA)，搅拌12个小时；反应完毕后，离心两次，过滤一次去除未反应的固体杂质，上清液转移至透析袋(截留分子量为 10000)中透析2天，更换4次透析液，每次透析时间大于5小时，透析液为IOmM pH 7. 4PBS。 透析完毕后，将全抗原溶液定容，取出一定量的溶液进行紫外和ICP-AES检测，其余的全抗原溶液分装并冻成干粉，-20°C保存。青霉烯酸衍生物都含有恶唑酮环，因此在320 345nm处有特征吸收峰，而其它的青霉素衍生物或降解产物都没有这种特征吸收。所以，紫外可见分光光度法可以用来判断青霉烯酸硫醇汞盐-蛋白质的合成效果。从图4中可以清楚地看出，抗原青霉烯酸硫醇汞盐-牛血清白蛋白在325nm附近有特殊吸收峰，而蛋白质BSA在325nm附近都没有吸收峰， 从而证明半抗原青霉烯酸硫醇汞盐与BSA偶联成功。为了准确的检测半抗原MMPA与BSA 之间的偶联比，我们使用ICP-AES检测抗原溶液中的重金属离子的浓度，从而确定半抗原与蛋白质质检的偶联比为25 1。该抗原被应用于多克隆抗体的制备，我们对抗体做了系统地ELISA分析，我们选取2只强壮的雄性新西兰白兔，每只重量约为3kg。我们采取的注射方式是皮下6 8点注射，第一次基础免疫的抗原剂量为500μ g/只，每次加强免疫的抗原剂量为300μ g/只， 具体操作如下第一次免疫为基础免疫，全抗原用PBS(10mM，pH = 7. 4)稀释成lmg/ml，与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下多点注射；14天后，进行第一次加强免疫，等量的全抗原溶液(lmg/ml)与弗氏不完全佐剂充分乳化，皮下多点注射；共加强免疫4次，每次的间隔时间为14天。从第二次加强免疫起，每次免疫后7天从兔子的耳缘静脉取血，取出的全血 37°C水浴池，离心取上清，分装，-20°C保存。免疫注射前，每只兔子取血作为阴性对照。实验结果表明(1)合成的全抗原对动物是安全的，没有发现动物的中毒现象；(2)免疫全抗原可以刺激动物的免疫系统产生高亲和性的抗体。抗原具有很高的免疫原性，经过4次加强免疫后，动物血清中抗体的效价超过83000 ；(3)虽然动物的免疫系统产生针对Hg(II)特异的抗体是非常困难的，我们仍然试图找寻能够证明高亲和性抗体存在的证据。实验原理比较免疫血清与两种包被抗原 OVA-GSH-Hg和OVA-GSH的亲和性的差异。OVA-GSH-Hg和OVA-GSH分别用50mM的碳酸盐缓冲液稀释为20μ g/ml，100 μ L/孔，37°C水浴中温育3小时，而后用OVA 300 μ L/孔封闭； 每孔滴加100 μ L免疫血清(稀释300倍)，37°C水浴中温育1小时，然后，用PBST (含0. 05% TffEEN 20的IOmMpH 7. 4PBS)洗涤3次；洗涤完毕后，每孔滴入100 μ L羊抗兔IgG-HRP，37°C水浴1个小时，PBST洗涤5次；最后100 μ L/孔TMB显色液((IOmL 50mM pH 5. 6柠檬酸缓冲溶液+400 μ L0. 6% ΤΜΒ+10μ L30% H2O2，其中0.6% TMB溶液的溶剂为DMS0)，显色 15min后加入50 μ L/孔2MH2S04终止反应。使用酶标仪测量450nm下的吸光度值。
实验结果表明抗体与包被抗原OVA-GSH-HgCl反应所得吸光度值(0D值)大于 0VA-GSH，表明血清中含有针对汞离子特异的抗体。半抗原及全抗原的合成步骤非常简单， 易于表征。该全抗原可以应用于汞离子单克隆抗体的制备，有很大的市场潜力。
权利要求
1. 一种青霉烯酸硫醇汞盐的应用，所述青霉烯酸硫醇汞盐的结构如下COOR2其中，R1为C6H5-CH2-, R2为Na、K或H，其特征在于，将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗原。
2.一种根据权利要求1所述青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法，其特征在于，以 EDC · HCl作为水溶性催化剂，将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗原经过与蛋白质牛血清白蛋白偶联后，形成汞离子全抗原。
3.根据权利要求2所述的青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法，其特征是，所述方法具体步骤为1)将纯化后的50mg半抗原转移至烧杯中，滴加10ml4%NaHC03，加入200mgEDC'HCl, 搅拌lOmin，使得半抗原上的羧基充分活化，加入50mg BSA或OVA，搅拌12个小时；2)反应完毕后，离心两次，过滤一次去除未反应的固体杂质，上清液转移至截留分子量为10000的透析袋中透析2天，更换4次透析液，每次透析时间大于5小时，透析液为IOmM pH7. 4PBS ；3)透析完毕后将全抗原溶液定容，取出一定量的溶液进行紫外和ICP-AES检测，其余的全抗原溶液分装并冻成干粉，-20°C保存。
全文摘要
一种化工技术领域的基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法，通过将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗原，并进一步以EDC·HCl作为水溶性催化剂，将青霉烯酸硫醇汞盐作为汞离子半抗原经过与蛋白质牛血清白蛋白偶联后，形成汞离子全抗原。本发明制备得到的半抗原及全抗原的合成步骤非常简单，易于表征；该全抗原可以应用于汞离子单克隆抗体的制备。
文档编号C07K14/765GK102161645SQ201110039200
公开日2011年8月24日 申请日期2009年8月20日 优先权日2009年8月20日
发明者周培, 席涛, 张薇, 曹成喜, 樊柳荫, 谢鹏 申请人:上海交通大学