含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法

专利名称：含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及新的含异二聚体抗体Fe的蛋白比如双特异性抗体，及制备此类蛋白的新方法。
背景技术：
近年来单克隆抗体已成为成功的治疗分子，特别是用于治疗癌症。但是，不幸的是，当单克隆抗体用作单一疗法时，经常不能治愈疾病。双特异性抗体有可能克服单克隆抗体疗法的一些限制，如它们可用作介质以靶向药物或毒性化合物至靶细胞，用作介质以再靶向效应机制至疾病相关部位或用作介质以增加对肿瘤细胞的特异性，例如通过与只见于肿瘤细胞的靶分子的组合结合。最近关于双特异性抗体的不同形式和用途的综述见于Chames和Baty (2009)Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276。开发双特异性抗体的主要障碍之一是通过传统技术难以制备足够质量和数量的材料，所述传统技术比如杂交杂交瘤和化学缀合方法(Marvin和Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)。由不同重链和轻链组成的两种抗体在宿主细胞中的共表达，除了产生期望的双特异性抗体以外，还产生可能的抗体产物的混合物。已描述数种策略以利于在不同抗体构建体共表达后形成异二聚的(即双特异性)产物。Lindhofer等(1995 J Immunol 155:219)已描述产生不同抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致功能性双特异性抗体的富集，因为优先的物种限制性重/轻链配对。另一种促使形成异二聚体超过同二聚体的策略是“进入孔中的隆突(knob-1nto-hole)”策略，其中在第一重链多肽的界面引入隆起，在第二重链多肽的界面引入对应的腔，使得隆起可位于腔内，以便促使异二聚 体形成和阻碍同二聚体形成。“隆起”是通过用较大的侧链从第一多肽的界面置换小的氨基酸侧链而构建的。与隆起相同或相似大小的互补“腔”是通过用较小的氨基酸侧链置换大的氨基酸侧链而在第二多肽的界面建立的(US专利5，731，168)。EP1870459 (Chugai)和WO 2009089004 (Amgen)描述了有利于在不同抗体域在宿主细胞中共表达后形成异二聚体的其它策略。在这些方法中，组成两个CH3域中的CH3-CH3界面的一个或更多个残基被荷电氨基酸置换，使得在静电上不利于形成同二聚体且在静电上利于异二聚体化。W02007110205 (Merck)描述又一种策略，其中利用IgA与IgG CH3域之间的差异促使异二聚体化。Dall’ acqua 等(1998 Biochemistry 37:9266)已鉴定五个参与 CH3 同二聚体界面中的CH3-CH3接触的在能量上关键的氨基酸残基(366、368、405、407和409)。WO 2008119353 (Genmab)描述用于制备双特异性抗体的体外方法，其中在还原条件下孵育后，在两个单特异性IgG4抗体或IgG4样抗体之间通过“Fab臂”或“半分子”互换(重链与连接的轻链交换)形成双特异性抗体。这种Fab臂互换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果，其中在亲代(原来是单特异性)抗体铰链区的重链二硫键被还原，所得游离半胱氨酸与另一个亲代抗体分子(原来具有不同的特异性)的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲代抗体的CH3域通过解离-缔合释放和再形成。所得产物是具有两个Fab臂的双特异性抗体，所述两个Fab臂可能包含不同序列。但是应当注意的是，该过程是随机的，Fab臂互换也可发生在具有相同序列的两个分子之间，或者两个双特异性分子可参加Fab臂互换以再产生包含原来的单特异性亲代抗体特异性的抗体。现在已惊奇地发现通过在两个单特异性起始蛋白的CH3区引入不对称突变，可迫使Fab臂互换反应变为定向的，从而得到高度稳定的异二聚体蛋白。发明概述
因此，一方面，本发明提供基于稳定的含同二聚体Fe的原料制备高度稳定的含异二聚体Fe的蛋白的有效的体外方法。例如，可基于两种稳定的单特异性抗体作为原料形成具有高收率和纯度的高度稳定的双特异性抗体。因此，一方面，本发明涉及用于产生异二聚体蛋白的体外方法，所述方法包括以下步骤:
a)提供包含免疫球蛋白Fe区的第一同二聚体蛋白，所述Fe区包含第一CH3区，
b)提供包含免疫球蛋白Fe区的第二同二聚体蛋白，所述Fe区包含第二CH3区， 其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区
之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用。c)在足以允许铰链区的半胱氨酸进行二硫键异构化的还原条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起孵育，和
d)获得所述异二聚体蛋白。所述方法可以例如用于体外制备异二聚体蛋白，比如双特异性抗体，用于各种用途，比如治疗或诊断用途。这种体外方法的优点是重链/轻链配对在反应期间保持完整，所以在产物中不会得到不期望的重链与轻链的组合。这与现有技术描述的一些共表达方法(见上文)相反，所述共表达方法中因为在细胞中随机的重链/轻链配对所致，必须发现可与两种重链形成功能性抗体的共用轻链以避免形成非功能性重链/轻链产物。此外，体外方法可在实验室中进行，这与共表达相比允许对异二聚体蛋白更大的控制、更高的灵活性和收率。本发明的体外方法还可用于例如在筛选方法中建立更大大小的化合物文库，以鉴定有利的特异性组合。例如，对于抗体靶标的一些组合，并非任何双特异性抗体都将具有功能，即能够同时与两种靶标结合并介导期望的功能效应。在这样的情况下，具有期望的性质(例如最佳靶结合或细胞杀伤)的双特异性抗体，可通过以下步骤鉴定:
a)提供第一组具有不同可变区的同二聚体抗体，其中所述第一组的所述抗体包含第一CH3 区，
b)提供第二组具有不同可变区的同二聚体抗体，其中所述第二组的所述抗体包含第二CH3 区，
其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用，
c)在足以允许铰链区的半胱氨酸进行二硫键异构化的还原条件下孵育所述第一组抗体与所述第二组抗体的组合，由此产生一组双特异性抗体，
d)任选恢复条件至非还原性，
e)针对给定的期望性质测定所得双特异性抗体组，和f)选择具有期望性质的双特异性抗体。在另外的方面，本发明涉及通过本发明方法获得或可获得的异二聚体蛋白和通过在合适的宿主细胞中共表达而制备本发明异二聚体蛋白的方法。附图简述


图1:通过种间Fab臂互换产生双特异性抗体。通过ELISA确定了在所示EGFR (2F8)与⑶20 (7D8) IgG4抗体之间GSH诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。在ELISA中分析0-1 μ g/mL的浓度系列(总抗体)。恒河猴(Rh)与人(Hu) IgG4抗体之间的Fab臂互换后的双特异性结合高于相同物种的两种抗体之间的Fab臂互换后的双特异性结合。图2:人和恒河猴抗体同种型的核心铰链(即包括两个可能形成重链间二硫键的半胱氨酸残基的人IgGl的CPPC序列，和其它人同种型或其它物种的对应残基)和CH3-CH3界面的氨基酸序列的比对。图3:用参加Fab臂互换的突变人IgGl产生双特异性抗体。通过ELISA确定了人CD20 (7D8) IgG4抗体与所示人EGFR (2F8) IgGl抗体之间GSH诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。呈现的图显示三个独立的Fab臂互换实验的平均数，其中I Pg/mL的总抗体浓度用于ELISA。IgGl-2F8-CPSC-1TL与IgG4_7D8之间的Fab臂互换后的双特异性结合高于两种IgG4抗体之间的Fab臂互换后的双特异性结合。IgG4-7D8与IgGl_2F8_CPSC或IgGl-2F8-1TL组合在所用条件下不产生双特异性抗体。图4:通过人IgG4与突变IgGl抗体的体内Fab臂互换产生双特异性抗体。通过ELISA确定了在人CD20 (7D8) IgG4与所示人EGFR (2F8) IgGl和IgG4突变抗体之间在免疫缺陷小鼠体内Fab臂互换后双特异性抗体的产生。呈现的图显示平均数(n=4)。将双特异性反应性以相对于总IgG浓度的双特异性抗体浓度(百分数)表示。在CH3域具有稳定铰链(CPPC)或R409K突变 的人IgG4不能参与Fab臂互换。在铰链中具有CPSC序列和在CH3域具有K409R突变两者的IgGl参加Fab臂互换。(*)对含有IgGl_2F8、IgG4_2F8_CPPC或IgG4-2F8-R409K的混合物的双特异性低于检测限，因此任意设为O。图5:使用2-巯基-乙胺.Η(:1- (2-ΜΕΑ-)诱导的在人IgGl与IgG4抗体之间的Fab臂互换产生双特异性抗体。通过ELISA确定了在所示人EGFR (2F8)与⑶20 (7D8)抗体之间2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。测试0_40 mM 2-MEA浓度系列。呈现的图显示ELISA的结果，其中使用20 Pg/mL总抗体浓度。在含有稳定铰链(CPPC)的抗体之间，2-MEA也有效地诱导Fab臂互换。至于CH3域，与两种野生型IgG4抗体相比，具有三重突变体T3501-K370T-F405L的人IgG4 x人IgGl的组合，导致产生更高水平的双特异性反应性。图6:使用在人IgGl与IgG4抗体之间2-MEA诱导的Fab臂互换产生双特异性抗体。对于0-40 mM 2-MEA浓度系列的所有样品通过质谱法确定了在所示人EGFR (2F8)与⑶20 (7D8)抗体之间2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。(A)显示利用 O mM、7 mM 和 40 mM 2-MEA 进行的 IgGl_2F8_ITL x IgG4_7D8_CPPC 之间 Fab 臂互换反应的样品的代表性质谱图实例。(B)在质谱数据量化后，计算双特异性抗体百分数，并针对Fab臂互换反应中的2-MEA浓度作图。IgG4_2F8 x IgG4_7D8产生约50%双特异性抗体。IgGl-2F8-1TL x IgG4_7D8_CPPC 产生约 95% 双特异性抗体。
图7:通过2-MEA诱导的Fab臂互换所得的异二聚体双特异性抗体的稳定性分析。在所示浓度的无关IgG4的存在下，在GSH诱导的Fab臂互换反应后，通过在ELISA测量EGFR/CD20双特异性结合，测试通过组合IgGl-2F8-1TL x IgG4_7D8_CPPC (A)或者IgG4-2F8 X IgG4-7D8 (B)由2-MEA诱导的Fab臂互换产生的双特异性样品的稳定性。将双特异性结合相对于原料(对照)的双特异性结合(将其设定为100%)来表示。(A)从IgGl-2F8-1TL x IgG4_7D8_CPPC衍生的2-MEA诱导的双特异性产物的双特异性结合得以保留，提示在GSH条件下不参与Fab臂互换的稳定产物。(B)从IgG4_2F8 x IgG4_7D8衍生的2-MEA诱导的双特异性产物的双特异性EGFR/CD20结合减少，提示产物在GSH条件下参与与无关IgG4的Fab臂互换。
图8:通过2-MEA诱导的Fab臂互换产生的异二聚体双特异性抗体的血浆清除率。对三组小鼠(每组3只小鼠)注射所示抗体:(I) 100 μg通过IgGl-2F8-1TL xIgG4-7D8-CPPC之间体外2-MEA诱导的Fab臂互换产生的双特异性抗体；(2) 100 μg双特异性抗体+1,000 Pg无关 IgG4;(3) 50 Pg IgGl_2F8_ITL + 50 Pg IgG4_7D8_CPPC。(A)通过ELISA确定的随时间推移的总抗体浓度。所有抗体的总抗体血浆浓度曲线相同。(B)通过ELISA确定的双特异性抗体浓度。注射抗体的双特异性在加入和不加入过量的无关IgG4的情况下相同。(*) IgGl-2F8-1TL + IgG4_7D8_CPPC混合物的双特异性结合低于检测限，因此在该图不能绘出对应的符号。显示两个ELISA实验的均值。图9:通过人IgGl_2F8与IgG4_7D8_CPPC之间的Fab臂互换产生的双特异性抗体的纯度。(A)还原SDS-PAGE (a)显示双特异性样品和IgGl对照样品两者的重链和轻链的带。非还原SDS-PAGE (b)。(B) HP-SEC分析的峰结果显示>98%双特异性样品是均质的，几乎检测不到抗体聚集物。(C)质谱法显示Fab臂互换产生约100%双特异性产物。图10:三重突变体(ITL)、双重突变体(IT、IL、TL)和单突变体(L)人IgGl_2F8之间通过与人IgG4-7D8的Fab臂互换产生双特异性抗体的比较。通过ELISA确定，在人IgGl-2F8三重突变体和双重突变体与具有CPSC铰链的野生型IgG4-7D8 (A)或者具有稳定铰链的突变体IgG4-7D8-CPPC (B)，或者单突变体IgGl_2F8_F405L与具有野生型CPSC或稳定CPPC铰链的IgG4-7D8 (C)之间，在2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。在包括双重突变体和单突变体在内的实验中ELISA分析的浓度系列(总抗体)分别是0-20 μ g/mL或0-10 μ g/mL。与双重突变体IgGl_2F8_IL和IgGl_2F8_TL组合导致产生类似于三重突变体IgGl-1TL的双特异性EGFR/CD20结合。与IgGl_2F8_IT组合不产生双特异性产物。与单突变体IgGl-2F8-F405L组合导致产生双特异性EGFR/CD20结合。图11:在不同温度使用2-MEA诱导的Fab臂互换产生双特异性抗体。在(TC、20°C和37°C在2-MEA诱导的体外Fab臂互换反应中通过合并所示人EGFR (2F8)和⑶20 (7D8)抗体产生双特异性抗体，接着即时进行ELISA。双特异性结合在37°C最有效，在20°C较慢。在0°C，测量不到双特异性结合的产生。图12:通过用不同还原剂诱导的体外Fab臂互换产生双特异性抗体。用ELISA测量用所示还原剂的浓度系列在还原反应中通过合并人IgGl-2F8-1TL和IgG4_7D8_CPPC的双特异性抗体产生。在与DTT (在2.5 mM DTT获得最大值)和2-MEA (在25 mM 2-MEA获得最大值)反应，但不与GSH反应后测量双特异性结合。(*)因为形成抗体聚集物所以排除GSH浓度>10 mM的数据。
图13:在 IgGl-2F8-1TL 与 IgGl_7D8_K409X 突变体之间 2-MEA 诱导的 Fab 臂互换。通过ELISA确定在IgGl-2F8-1TL与所示IgGl_7D8_K409X突变体之间2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。(A)分析0-20 μ g/mL的浓度系列(总抗体)。阳性对照是纯化批次的双特异性抗体，其从IgGl-2F8-1TL x IgG4_7D8_CPPC衍生。(B)将互换用相对于阳性对照(黑条)的在20 Pg/mL的双特异性结合表示。深灰色条表示IgG4对照(IgG4-7D8 X IgG4-2F8)、阴性对照(IgGl_2F8 x IgGl-7D8_K409R)和 IgGl_2F8_ITL与IgG4-7D8-CPPC之间的双特异性结合。浅灰色条表示在所示IgGl_7D8_K409X突变体与IgGl-2F8-1TL之间同时进行的Fab臂互换反应的结果。图14:抗体去糖基化不影响通过2-MEA诱导的Fab臂互换产生双特异性抗体。通过ELISA确定所示EGFR (2F8)与⑶20 (7D8)抗体之间2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。比较与7D8抗体和与其酶促去糖基化变体的互换。在ELISA分析0-20U g/mL的浓度系列(总抗体)。涉及去糖基化(deglyc)抗体的Fab臂互换反应显示与它们所衍生自的糖基化变体相同的双特异性结合曲线。图15:参加Fab臂互换的能力与CH3-CH3相互作用强度相关。㈧、⑶和(C)通过在具有所示突变的IgGl-2F8与IgGl-7D8 (A)或者IgG4_2F8与IgG4_7D8 (B和C)构建体之间GSH诱导的Fab臂互换进行的双特异性抗体的产生，其在ELISA中用随时间推移的双特异性结合表示。将双特异性在24小时后与IgG4-2F8 x IgG4_7D8对照相比表示。(D)和(E)对于基于IgGl⑶或基于IgG4(E)的分子在24小时后表观& (表2)与双特异性抗体产生之间的关系(图15A/B/C)。图16:在IgGl、IgG4和(部分)IgG3主链中抗EGFr抗体2F8的序列比对。描述根据Kabat和根据EU索引的氨基酸编号(两者都描述于Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest (免疫学关注的蛋白序列)，第 5版，PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))。图17:通过用不同还原剂诱导的体外Fab臂互换产生双特异性抗体。用ELISA测量在用所示还原剂的浓度系列的还原反应中通过合并人IgGl-2F8-F405L和IgGl-7D8-K409R的双特异性抗体产生。将测量的OD值标准化至从IgGl_2F8_ITL xIgG4-7D8-CPPC之间2-MEA诱导的Fab臂互换衍生的双特异性对照样品的信号，将其设定为100%。在与0.5-50 mM浓度范围DTT、25-50 mM浓度范围2-MEA和0.5-5.0 mM浓度范围三(2-羧乙基)膦(TCEP)但不与GSH反应后，测量最大的双特异性结合。(*)因为形成抗体聚集物所以排除GSH浓度> 25 mM的数据。图18:在人 IgGl-2F8-F405L 与 IgGl_7D8_K409R 之间用 2-MEA 诱导的 Fab 臂互换产生双特异性抗体。(A)通过ELISA确定2-MEA诱导体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。呈现的图显示ELISA的结果，其中使 用20 Pg/mL总抗体浓度。2-MEA有效地诱导Fab臂互换。(B)对于0-40 mM 2-MEA浓度系列的所有样品通过质谱法确定在2-MEA诱导体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。在质谱数据量化后，计算双特异性抗体百分数，针对Fab臂互换反应中2-MEA的浓度作图。IgGl-2F8-F405L x IgGl_7D8_K409R产生约100%双特异性抗体，证实ELISA数据。图19:通过人IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8_K409R之间Fab臂互换产生的双特异性抗体的纯度。质谱法显示Fab臂互换产生约100%双特异性产物。图20:通过2-MEA诱导Fab臂互换产生的双特异性抗体的血浆清除率。对两组小鼠(每组3只小鼠)注射所示抗体:(I) 100 Pg通过IgGl-2F8-F405L x IgGl_7D8_K409R之间体外2-MEA诱导的Fab臂互换产生的双特异性抗体；(2) 100 Pg双特异性抗体+ 1,000Mg无关IgG4。(A)通过ELISA确定的随着时间推移的总抗体浓度。所有抗体的总抗体血衆浓度曲线相同。(B)如通过ELISA确定的双特异性抗体浓度。在加入和不加过量无关IgG4的情况下注射抗体的双特异性是相同的。图21:通过 IgGl-2F8-F405L x IgGl_7D8_K409R 之间 2-MEA 诱导的 Fab 臂互换产生的双特异性抗体对CD20表达细胞的CDC介导的细胞杀伤。所示抗体的浓度系列用于测试它们对Daudi (A)和Raji (B)细胞介导⑶C的能力。两种细胞系都表达⑶20而不表达EGFR0在IgGl-7D8中引入K409R不影响其诱导CDC的能力。从IgGl-2F8_F405L xIgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂互换衍生的双特异性抗体仍然能够诱导⑶C。图22:通过 IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8_K409R 之间 2-MEA 诱导的 Fab 臂互换产生的双特异性抗体对EGFR表达细胞的ADCC介导的细胞杀伤。所示抗体的浓度系列用于测试它们对A431细胞介导ADCC的能力。IgGl-7D8不能结合⑶20阴性A431细胞，因此不诱导ADCC。ADCC由EGFR抗体IgGl-2F8诱导，也在CH3域引入F405L突变后诱导。在通过IgGl-2F8-F405L x IgGl_7D8_K409R之间的Fab臂互换获得的双特异性形式中保留IgGl-2F8-F405L 的 ADCC 效应子功能。图23:在 IgGl-2F8-F405X 突变体与 IgGl_7D8_K409R 之间 2-MEA 诱导的 Fab 臂互换。通过ELISA确定在所示IgGl-2F8-F405X突变体与IgGl-7D8_K409R之间2-MEA诱导体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。(A)在ELISA中分析0_20 μ g/mL的浓度系列(总抗体)。阳性对照是纯化批次的双特异性抗体，其从IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8_K409R衍生。(B)将互换用相对于阳性对照(黑条)的在20 Pg/mL抗体浓度的双特异性结合表示。深灰色条表示 IgG4 对照(IgG4-7D8 x IgG4_2F8)与阴性对照(IgGl_2F8 x IgGl-7D8_K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条表示在所示IgGl-2F8-K405X突变体与IgGl-7D8_K409R或对照之间同时进行的Fab臂互换反应的结果。图24:在 IgGl-2F8-Y407X 突变体与 IgGl_7D8_K409R 之间 2-MEA 诱导的 Fab 臂互换。通过ELISA确定所示IgGl-2F8-Y407X突变体与IgGl-7D8_K409R之间2-MEA诱导体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生。(A)在ELISA分析0-20 μ g/mL的浓度系列(总抗体)。阳性对照是纯化批次的从IgGl-2F8-F405L x IgGl_7D8_K409R衍生的双特异性抗体。(B)将互换以相对于阳性对照(黑条)的在20 Pg/mL抗体浓度的双特异性结合表示。深灰色条表示 IgG4 对照(IgG4-7D8 x IgG4_2F8)与阴性对照(IgGl_2F8 x IgGl-7D8_K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条表示在所示IgGl-2F8-Y407X突变体与IgGl-7D8_K409R或对照之间同时进行的Fab臂互换反应的结果。图25:在非还原(图25(A))和还原(图25(B))条件下通过SDS-PAGE分析由2-MEA诱导Fab臂互换产生的双特异性抗体。图26:同二聚体原料 IgGl-2F8-F405L (图 26 (B))、同二聚体原料 IgGl_7D8_K409R(图26 (A))、两种同二聚 体的混合物(1:1)(图26 (C))和通过IgGl-2F8-F405L xIgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导Fab臂互换产生的双特异性产物(图26 (D))的HP-SEC曲线。图27:同二聚体原料 IgGl-2F8-F405L (图 27 (B))、同二聚体原料 IgGl-7D8_K409R(图27 (A))、两种同二聚体的混合物(1:1)(图27 (C))和通过IgGl-2F8-F405L xIgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导Fab臂互换产生的双特异性产物(图27(D))的质谱法(ES1-MS)。图28:同二聚体原料 IgGl-2F8-F405L (图 28 (A))、同二聚体原料 IgGl_7D8_K409R(图28⑶)、两种同二聚体的混合物(1:1)(图28 (C))和通过IgGl-2F8-F405L xIgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导Fab臂互换产生的双特异性产物(图28(D))的毛细管等电聚焦(cIEF)曲线图。图29:同二聚体原料 IgGl-2F8-F405L (图 29 (A))、同二聚体原料 IgGl_7D8_K409R(图29⑶)、两种同二聚体的混合物(1:1)(图29 (C))和通过IgGl-2F8-F405L xIgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导Fab臂互换产生的双特异性产物(图29 (D))的HPLC-CIEX曲线图。图30:通过共转染编码IgGl-7D8-K409R或IgGl_2F8_F405重链和轻链的表达载体获得的IgG的电喷雾电离质谱分析。异二聚体峰用*表示。同二聚体峰用t表示。图31:同二聚体IgGl-2F8-F405L和IgGl_7D8_K409R的互换反应，如以不同间隔注射后通过高压液相层析阳离子交换(HPLC-CIEX)监测。

图32:互换反应的残留同二聚体，如在图32中用CIEX方法检测显示(用箭头标识)。图33:如通过ELISA确定的在各种IgG浓度、2-MEA浓度、孵育温度和时间下双特异性抗体的产生。图34:如通过ELISA确定并与任意设定为100%的对照相比的在各种IgG浓度、2-MEA浓度、孵育温度和时间下双特异性抗体的产生。图35:如通过HPLC-CIEX分析的在各种IgG浓度、2-MEA浓度、孵育温度和时间下双特异性抗体的产生。图36:用0-20 μ g/mL浓度系列(总抗体)通过ELISA确定所示IgGl_2F8_L368X突变体与IgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生(图37(A))。阳性对照是纯化批次的双特异性抗体，其从IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8_K409R衍生。图37 (B)显示与阳性对照(黑色条)相比在20 Pg/mL的双特异性结合。深灰色条表示 IgG4 对照(IgG4-7D8 x IgG4_2F8)与阴性对照(IgGl_2F8 x IgGl-7D8_K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条表示在所示IgGl-2F8-L368X突变体与IgGl-7D8_K409R同时进行的Fab臂互换反应的结果。图37:用0-20 μ g/mL浓度系列(总抗体)通过ELISA确定所示IgGl_2F8_K370X突变体与IgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生(图37(A))。阳性对照是纯化批次的双特异性抗体，其从IgGl-2F8-F405L x IgGl-7D8_K409R衍生。图37 (B)显示与阳性对照(黑色条)相比在20 Pg/mL的双特异性结合。深灰色条表示 IgG4 对照(IgG4-7D8 x IgG4_2F8)与阴性对照(IgGl_2F8 x IgGl-7D8_K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条表示在所示IgGl-2F8-D370X突变体与IgGl-7D8_K409R之间同时进行的Fab臂互换反应的结果。
图38:用0-20 μ g/mL浓度系列(总抗体)通过ELISA确定所示IgGl_2F8_D399X突变体与IgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导的体外Fab臂互换后双特异性抗体的产生(图38(A))。图37 (B)显示与阳性对照(黑色条)相比在20 Pg/mL抗体浓度的双特异性结合。深灰色条表示 IgG4对照(IgG4-7D8 x IgG4_2F8)与阴性对照(IgGl_2F8 x IgGl-7D8_K409R)之间的双特异性结合。浅灰色条表示在所示IgGl-2F8-D399X突变体与IgGl-7D8_K409R之间同时进行的Fab臂互换反应的结果。图39:如通过夹心ELISA确定的在15°C孵育0、30、60、105和200分钟后四种不同的IgGl突变体组合之间2-MEA诱导的Fab臂互换。图40:如通过夹心ELISA确定的将抗体在15°C孵育90分钟后不同IgGl突变体组合之间2-MEA诱导的Fab臂互换。图41:通过C-Met特异性抗体使c_Met磷酸化。将A549细胞与HGF或一组不同的抗体孵育15分钟。将蛋白通过SDS-page凝胶电泳分离，通过蛋白质印迹法转移至膜。通过抗磷酸化c-Met、总C-Met或β -肌动蛋白的抗体检测磷酸化c_Met、总c_Met和β -肌动蛋白。图42:用NC1-H441细胞进行的增殖测定。将NC1-H441细胞与单价双特异性IgGl069/bl2孵育7天，对照抗体(IgGl-069，UniBody-069, IgGl_bl2)未处理。确定细胞量并作为未处理样品(设为100%)的百分数作图。图 43:通过 IgGl-7D8-F405L 或 IgGl-2F8-F405L 与 IgGl-7D8-K409R之间 2-MEA 诱导的Fab臂互换产生的双特异性抗体对CD20表达细胞的CDC介导的细胞杀伤。用所示抗体的浓度系列测试它们对Daudi (A)和Raji (B)细胞介导CDC的能力。两种细胞系都表达CD20 而不表达 EGFR。通过 IgGl-7D8_F405L x IgGl-7D8_K409R 之间 2-MEA 诱导 Fab 臂互换产生的双特异性抗体与IgGl-7D8同样有效地诱导⑶C介导的细胞杀伤。从IgG2-2F8-F405LX IgGl-7D8-K409R之间2-MEA诱导的Fab臂互换衍生的双特异性抗体产生单价的结合⑶20的双特异性抗体，其轻微 影响CDC介导的细胞杀伤的诱导。图44:由抗K -ETA’预孵育HER2 x HER2双特异性抗体诱导的A431细胞杀伤。在与用抗K -ETAj预孵育的HER2抗体孵育3天后A431细胞的生存力。用Alamarblue量化细胞生存力。显示的数据是用抗κ-ΕΤΑ’缀合的HER2抗体和HER2 x HER2双特异性抗体处理A431细胞的一个实验的荧光强度(FI)。星形孢菌素用作阳性对照，而同种型对照抗体用作阴性对照。图45:HER2 x HER2双特异性分子诱导的HER2受体下调。在与10 μ g/mL mAb孵育3天后在AU565细胞裂解物中HER2表达水平的相对百分数。用HER2特异性捕获ELISA将HER2的量量化，作为与未处理细胞相比的抑制百分数表示。显示的数据是两个实验的平均值加标准差。图46:HER2 x HER2双特异性抗体(FITC)与溶酶体标记物LAMPl (Cy5)的共定位分析。各种单特异性HER2抗体和HER2 x HER2双特异性抗体的与Cy5重叠的FITC像素强度(图46 (B))，将每种被测抗体的三个不同图像的LAMP1/Cy5阳性像素中的FITC像素强度作图。单特异性抗体在LAMP1/Cy5阳性像素中比双特异性抗体显示较低的FITC像素强度。图46(B)表示根据三个不同图像计算的每个LAMP1/Cy5阳性像素的FITC像素强度平均值。这些结果一起提示在内化后与单特异性抗体相比，较高水平的双特异性抗体定位于Lampl/Cy5阳性囊泡。图47:HER-2单特异性抗体和双特异性抗体对增殖的抑制。在10 Pg/mL HER2抗体或HER2 X HER2双特异性抗体的存在下将AU565细胞接种在无血清细胞培养基中。3天后,用Alamarblue量化活细胞的量,将细胞生存力用与未处理细胞相比的百分数表示。同种型对照抗体用作阴性对照。显示的数据是与未处理细胞相比的活AU565细胞百分数，以5倍土标准差衡量。*表示只描述一个数据点。图48:单特异性和双特异性IgGl和铰链缺失的IgGl抗体在不同pH与人和小鼠FcRn的结合。将含有人和小鼠FcRn的板与不同的单特异性和双特异性IgGl抗体或铰链缺失的IgGl分子孵育。在405 nm通过ELISA分析与FcRn的结合。(A)单特异性和双特异性IgGl抗体和铰链缺失的IgGl (Un1-Gl)分子在pH 7.4和6.0与人FcRn的结合。在中性pH与人FcRn的结合非常低。在pH 6.0 (双特异性)抗体有效地结合人FcRn，除非它们含有H435A突变。铰链缺失的IgGl (Un1-Gl)分子以低效率与人FcRn结合。(B)单特异性和双特异性IgGl抗体和铰链缺失的IgGl (Un1-Gl)分子在pH 7.4和6.0与小鼠FcRn的结合。在中性pH与小鼠FcRn的结合非常低。在pH 6.0 (双特异性)抗体非常有效地结合小鼠FcRn，除非它们 在两条Fab臂都含有H435A突变。只在一条Fab臂中具有H435A突变的双特异性分子仍然能够结合小鼠FcRn。铰链缺失的IgGl (Un1-Gl)分子以中等效率结合小鼠FcRn，只在一条Fab臂中具有H435A突变的铰链缺失的IgGl (Un1-Gl)双特异性分子效率稍低。图49:Her2 x⑶3双特异性抗体以及Her2 x⑶3双特异性抗体的N297Q突变体对AU565细胞的T细胞介导的细胞毒性。发明详述 定义
术语“免疫球蛋白”指一类结构上相关的糖蛋白，由两对多肽链即一对轻(L)的低分子量链和一对重(H)链构成，所有四条链都通过二硫键互联。已充分表征免疫球蛋白的结构。见例如 Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, ff.编辑，第 2 版，Raven Press, N.Y.(1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区通常包含三个域CH1、CH2和CH3构成。重链在所谓“铰链区”经由二硫键互联。每条轻链通常由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区通常由一个域CL构成。通常，根据EU索引对恒定区的氨基酸残基编号,EU索引如描述于Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest (免疫学关注的蛋白序列)，第 5 版，PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)。图 16 概述抗体2F8的不同同种型形式的EU和Kabat编号(W0 02/100348)。可将VH和VL区进一步细分为高度可变的区(或者在结构上限定的环的序列和/或形式上高变的高变区)，也称为互补决定区(CDR)，其散布在称为框架区(FR)的更保守的区中。每个VH和VL通常由以下列顺序从氨基端排列至羧基端的三个CDR和四个FR构成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (也见 Chothia 和 Lesk J.Mol.Biol.196，901 917 (1987))。当用于本文时，术语“Fab臂”指一个重链-轻链对。当用于本文时，术语“Fe区”指至少包含铰链区、CH2域和CH3域的抗体区。术语“抗体” (Ab)在本发明上下文指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子片段或其任一种的衍生物，它们具有在典型生理条件下与抗原特异性结合的能力，具有显著时间段的半衰期，比如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约I小时，至少约2小时，至少约4小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更久，约48小时或更久，约3、4、5、6、7或更多天等，或者任何其它相关功能限定的时间段(比如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原关联的生理反应的时间和/或抗体足以募集效应活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(比如效应细胞)和补体系统的组分比如Clq,补体活化经典途径的第一组分。抗体也可以是双特异性抗体、双抗体(diabody)或类似分子。术语“双特异性抗体”指对至少两种不同表位、通常是非重叠表位具有特异性的抗体。如上所示，除非另外声明或者与上下文明确矛盾，否则本文的术语抗体包括保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。此类片段可通过任何已知的技术提供，比如酶促切割、肽合成和重组表达技术。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段例如F (ab’)2片段实施。还应理解除非另外指定，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽，比如嵌合抗体和人源化抗体。如此产生的抗体可具备任何同种型。术语“全长抗体”当用于本文时，指含有正常见于该同种型抗体的所有重链和轻链恒定域和可变域的抗体。本文所用的“同种型”指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE 或 IgM)。本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有从人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文所用的术语“人抗体”并不旨在包括其中从另一哺乳动物物种比如小鼠种系衍生的CDR序列已移植在人框架序列上的抗体。当用于本文时，术语“重链抗体”指只由两条重链组成且缺乏通常见于抗体的两条轻链的抗体。重链抗体，自然存在于例如骆驼(camelid)，可结合抗原，尽管只具有VH域。术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由表面集合的分子(例如氨基酸或糖侧链)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特性。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂存在时，与前者的结合而非与后者的结合丧失。表位可包含直接参与结合的 氨基酸残基(亦称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效封闭的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的覆盖区(footprint)内)。在抗体与预定抗原结合的情况下，本文所用术语“结合”通常是这样的结合，即在使用抗原作为配体，抗体作为分析物，通过例如表面等离子体共振(SPR)技术在BIAcore3000仪器中测定时，其亲和力相当于约1(T6 M或更小，如1(T7 M或更小，比如约1(T8 M或更小，比如约10_9 M或更小，约10, M或更小，或者约10_n M或甚至更小的Kd,且与所述预定抗原结合的亲和力相当于以下KD，其是所述抗体与并非预定抗原或密切相关的抗原的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力的Kd的至多1/10、例如至多1/100、例如至多1/1，000、例如至多1/10，000、例如至多1/100,000。亲和力较低时的量取决于抗体的KD，使得如果抗体的Kd非常低(即抗体是高特异性的)，则对抗原的亲和力的量可为对非特异性抗原的亲和力的量的至多1/10，000。本文所用术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作
用的解离平衡常数。当用于本文时术语“第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用”指第一CH3/第二 CH3异二聚体蛋白中第一 CH3区与第二 CH3区之间的相互作用。当用于本文时术语“第一 CH3区与第二 CH3区的同二聚体相互作用”指第一 CH3/第一 CH3同二聚体蛋白中第一 CH3区与另一个第一 CH3区之间的相互作用和第二 CH3/第二 CH3同二聚体蛋白中第二 CH3区与另一个第二 CH3区之间的相互作用。本文所用的“分离的抗体”表示材料已脱离其原来环境(例如如果它是自然存在的则是自然环境或者如果它是重组表达的则是宿主细胞)。还有利的是，抗体呈纯化形式。术语“纯化的”并不需要绝对纯度；相反，它旨在作为相对定义，表示与原料相比相对于组合物中污染物的浓度的抗体浓度增加。本文所用的术语“宿主细胞”旨在指其中已引入表达载体如编码本发明抗体的表达载体的细胞。重组宿主细胞包括例如转染瘤，比如CHO细胞、HEK293细胞、NS/0细胞和淋巴细胞。当用于本文时，术语两种或更多种核酸构建体的“共表达”，指两种构建体在单个宿主细胞中表达。术语“肿瘤细胞蛋白”指位于肿瘤细胞的细胞表面上的蛋白。本文所用的术语“效应细胞”指参与与免疫应答的识别期和活化期相对的免疫应答效应期的免疫细胞。示例性免疫细胞包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋巴细胞(比如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞比如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应细胞表达特异性Fe受体和执行特异性免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)，比如自然杀伤细胞，能够诱导ADCC。在一些实施方案中，效应细胞可吞噬靶抗原或靶细胞。术语“还原条件”或“还原环境”指其中底物(这里是抗体铰链区的半胱氨酸残基)与被氧化相比更可能被还原的条件或环境。术语“二硫键异构化”指不同半胱氨酸之间二硫键的互换，即二硫键的改组。
_5] 本发明的其它方面和实施方案
如上所述，在第一方面本发明涉及用于产生异二聚体蛋白的体外方法，所述方法包含以下步骤:
a)提供包含免疫球蛋白Fe区的第一同二聚体蛋白，所述Fe区包含第一CH3区，
b)提供包含免疫球蛋白Fe区的第二同二聚体蛋白，所述Fe区包含第二CH3区， 其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区
之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用，
c)在足以允许铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起孵育，和
d)获得所述异二聚体蛋白。 双特异性形式可以许多方式用于产生期望的双特异性抗体组合。除了能够以非常选择性的方式组合靶向不同抗原的抗体以外， 它可用于通过组合两种靶向相同抗原的不同抗体来改变期望的性质，例如增加CDC。另外，它可用于通过用无关(无活性)抗体制备其双特异性抗体来除去拮抗抗体的部分激动活性或者将激动抗体转化为拮抗抗体。在一个实施方案中，同二聚体蛋白选自(i) Fe区，(ii)抗体，(iii)包含Fe区的融合蛋白，比如与受体、细胞因子或激素融合的Fe区，和(iv)与前药、肽、药物或毒素缀合的Fe区。在一些实施方案中，所述第一和/或第二同二聚体蛋白除了包含Fe区以外，还包含抗体的一个或更多个或所有其它区，即CHl区、VH区、CL区和/或VL区。因此，在一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白是全长抗体。在另一个实施方案中，所述第二同二聚体蛋白是全长抗体。在重要的实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白都是抗体，优选全长抗体，并结合不同的表位。在此类实施方案中，产生的异二聚体蛋白是双特异性抗体。所述表位可位于不同抗原或相同抗原上。但是，在其它实施方案中，只有一种同二聚体蛋白是全长抗体，另一种同二聚体蛋白不是全长抗体，如不含可变区的Fe区，其连同另一蛋白或肽序列如受体、细胞因子或激素一起表达，或者与前药、肽、药物或毒素缀合。在又一个实施方案中，同二聚体蛋白都不是全长抗体。例如，两种同二聚体蛋白可以是与另一蛋白或肽序列如受体、细胞因子或激素融合或者与前药、肽、药物或毒素缀合的Fe区。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白的Fe区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种型，第二同二聚体蛋白的Fe区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种型。在优选实施方案中，所述第一和所述第二同二聚体蛋白两者的Fe区都是IgGl同种型。在另一个优选实施方案中，所述同二聚体蛋白的Fe区之一是IgGl同种型，另一种是IgG4同种型。在后一个实施方案中，所得异二聚体包含IgGl的Fe区和IgG4的Fe区，因此可具有在效应子功能活化方面的引入关注的中间性质。如果所述第一和/或所述第二同二聚体蛋白包含除去用于Asn连接的糖基化的受体位点的突变或者另外操作以改变糖基化性质，则可获得类似产物。在又一个实施方案中，通过例如按US2009317869所述或按van Berkel等(2010)Biotechnol.Bioeng.105:350所述，在抗体产生期间向培养基中加入化合物，或者例如按 Yamane-Ohnuki 等(2004) Biotechnol.Bioeng 87:614 所述，使用 FUT8 敲除细胞，对同二聚体蛋白中的一种或两种进行糖改造以减少岩藻糖，因此提高ADCC。可采用Umafia等(1999) Nature Biotech 17:176所述方法，备选地使ADCC最优化。在又一个实施方案中，例如按照Natsume等(2009) Cancer Sc1.100:2411所述改造同二聚体蛋白中的一种或两种以增强补体活化。在又一个实施方案中，已改造同二聚体蛋白中的一种或两种以减少或增加对新生儿Fe受体(FcRn)的结合以便操纵异二聚体蛋白的血清半衰期。在又一个实施方案中，已将同二聚体起始蛋白中的一种改造为不结合蛋白A，从而允许通过使产物穿过蛋白A柱让异二聚体蛋白与所述同二聚体起始蛋白分离。对于其中与作为原料的另一同二聚体蛋白相比使用过量的一种同二聚体蛋白的实施方案这可能特别有用。在此类实施方案中，可能有用的是，改造过量的同二聚体蛋白以便免除其结合蛋白A的能力。在异二聚体化反应后，异二聚体蛋白可通过穿过蛋白A柱与过剩的未互换同二聚体蛋白分离。在又一个实施方案中，一种同二聚体蛋白是Fe区或者识别无关表位的全长抗体或者含有不经历体细胞高度突变且不结合自身抗原的种系衍生序列的全长抗体。在此类实施方案中异二聚体蛋白发挥单价抗体的功能。在另一个实施方案中，两种同二聚体蛋白包含相同的重链，但只有一种同二聚体蛋白含有与所述重链形成功能性抗原结合位点的轻链，而另一种同二聚体蛋白含有非功能性轻链，其不与所述重链组合结合任何抗原。在此类实施方案中，异二聚体蛋白发挥单价抗体的功能。此类非功能性轻链可以是例如不经历体细胞高度突变且不结合自身抗原的种系衍生序列。待用作本发明同二聚体原料的抗体可以例如通过首先由Kohler等，Nature256，495 (1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备。单克隆抗体也可从曬菌体抗体文库用描述于例如Clackson等，Nature 352, 624 628 (1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222，581 597 (1991)的技术分离。单克隆抗体可从任何合适来源获得。因此，例如，单克隆抗体可从自用目标抗原(其例如呈在表面上表达该抗原的细胞或者编码目标抗原的核酸形式)免疫的小鼠获得的鼠脾脏B细胞制备的杂交瘤获得。单克隆抗体还可从自经免疫的人或非人哺乳动物比如大鼠、狗、灵长类等的抗体表达细胞衍生的杂交瘤获得。待用作本发明同二聚体原料的抗体可以是例如嵌合或人源化抗体。在另一个实施方案中，同二聚体起始蛋白中的一种或两种除了任何指定突变以外是人抗体。人单克隆抗体可用转基因或转染色体小鼠如HuMAb小鼠(其携带人免疫系统而不是小鼠系统的部分)产生。HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，其编码非重排人重链(μ和Y)和K轻链免疫球蛋白序列以及灭活内源性μ和K链基因座的靶定突变(Lonberg, N.等，Nature 368，856 859 (1994))。因此，小鼠具有降低的小鼠 IgM 或K表达，且在响应免疫时，所引入的人重链和轻链转基因进行类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgG, K单克隆抗体(Lonberg, N.等(1994)，同上；综述见Lonberg,N.Handbook of Experimental Pha rmacology 113, 49 101 (1994) , Lonberg, N.和Huszar, D., Intern.Rev.Tmmunol.第 13 卷 65 93 (1995)和 Harding, F.和 Lonberg,N.Ann.N.Y.Acad.Sci 764 536 546 (1995))。HuMAb 小鼠的制备详细描述于 Taylor,L.等，Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992), Chen, J.等，InternationalImmunology 5，647 656 (1993)，Tuaillon 等，J.1mmunol.152，2912 2920 (1994)，Taylor, L.等，International Immunology 6, 579 591 (1994), FishwiId, D.等，Nature Biotechnology 14，845 851 (1996)。还见 US 5，545，806、US 5，569，825、US5，625，126、US 5，633，425、US 5，789，650、US 5，877，397、US 5，661，016、US 5，814，318、US 5，874，299、US 5，770，429、US 5，545，807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO92/22645、W0 92/03918和WO 01/09187。这些转基因小鼠的脾细胞可用于按照熟知的技术产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。此外，本发明的人抗体或者来自其它物种的本发明抗体可使用本领域熟知的技术通过展示型技术鉴定，包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示、哺乳动物展示及其它技术，所得分子可进行另外的成熟，比如亲和力成熟，因为此类技术在本领域众所周知。
在本发明又一个实施方案中，抗体或其部分如一个或更多个CDR，是骆驼科(Camelidae)物种的(见W02010001251)，或者是软骨鱼物种比如铰口鲨的，或者是重链抗体或域抗体。在本发明方法的一个实施方案中，在步骤a)和b)提供的所述第一和第二同二聚体蛋白是纯化的。在一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白与药物、前药或毒素缀合或者含有药物、前药或毒素的受体基团。此类受体基团可以是例如非天然氨基酸。如上所述，同二聚体起始蛋白的第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用。在一个实施方案中，与各种同二聚体相互作用相比异二聚体相互作用的强度增力口，是因为CH3修饰,而非因为引入共价键、半胱氨酸残基或荷电残基。在一些实施方案中，本发明的产物高度稳定，在体外的温和还原条件下或者重要地在体内给予人类后在体内，不经历Fab臂互换。因此，在一个实施方案中，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在描述于实施例13的条件下在0.5 mM GSH下不能发生Fab臂互换。在另一个实施方案中，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在描述于实施例14的条件下在小鼠体内不发生Fab臂互换。在另一个实施方案中，例如在按实施例30所述确定时，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用强度为两种同二聚体相互作用中的最强相互作用强度的大于2倍，比如大于3倍，如大于5倍。在又一个实施方案中，所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列使得所得异二聚体蛋白中所述第一与第二蛋白之间的异二聚体相互作用的解离常数低于0.05微摩尔，如按实施例30描述测定时。在又一个实施方案中，所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列使得如按实施例21描述测定时，两种同二聚体相互作用的解离常数高于0.01微摩尔，比如高于0.05微摩尔，优选0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，比如0.05_5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者0.01-0.1。其中同二聚体起始蛋白相对稳定的实施方案可具有更容易制备大量起始蛋白和例如避免聚集或错折叠的优点。在一些实施方案中，可基于两种在CH3区只含有少数相当保守的不对称突变的同二聚体起始蛋白，利用本发明的方法以高收率获得稳定的异二聚体蛋白。因此，在一个实施方案中，所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列在不完全相同的位置含有氨基酸取代。氨基酸取代基可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。非天然氨基酸的实例例如公开于Xie J和Schultz P.G., Current Opinion in Chemical Biology (2005), 9:548-554,和 Wang Q.等，Chemistry & Biology (2009), 16:323-336。

在一个实施方案中，氨基酸是天然氨基酸。在一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在CH3区具有不超过I个氨基酸取代，第二同二聚体蛋白在CH3区具有不超过I个氨基酸取代，与野生型CH3区相比。
在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405、407和409，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405、407和409，其中所述第一同二聚体蛋白与所述第二同二聚体蛋白不在相同位置取代。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在366位具有氨基酸取代，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:368、370、399、405、407和409。在一个实施方案中 366 位氨基酸选自 Arg、Lys、Asn、Gin、Tyr> Glu 和 Gly0在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在368位具有氨基酸取代，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、370、399、405、407和409。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在370位具有氨基酸取代，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、399、405、407和409。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在399位具有氨基酸取代，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、405、407和409。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在405位具有氨基酸取代，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、407和409。在一个实施方案中 ，第一同二聚体蛋白在407位具有氨基酸取代，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405和409。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在409位具有氨基酸取代，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405和407。因此，在一个实施方案中，所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列含有不对称突变，即在两个CH3区的不同位置的突变，如在一个CH3区的405位的突变而另一个CH3区的409位的突变。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405和407。在一个此类实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在405位具有非Phe的氨基酸。在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在405位具有非Phe、Arg或Gly的氨基酸。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在405位包含Phe和在409位包含非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在405位包含非Phe的氨基酸和在409位包含Lys。在本文的又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在405位包含Phe和在409位包含非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在405位包含非Phe、Arg或Gly的氨基酸和在409位包含Lys。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在405位包含Phe和在409位包含非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含405位的Leu和409位的Lys。在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含405位的Phe和409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白包含405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸和409位的Lys。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含405位的Phe和409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含405位的Leu和409位的Lys。
在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含409位的Lys、370位的Thr和405位的Leu。在又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含409位的Lys、370位的Thr和405位的Leu。在甚至又一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含370位的Lys、405位的Phe和409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白包含409位的Lys、370位的Thr和405位的Leu。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含409位的Lys和:a) 350位的Ile和405位的Leu，或者b) 370位的Thr和405位的Leu。
`
在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含409位的Lys和:a) 350位的Ile和405位的Leu，或者b) 370位的Thr和405位的Leu。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含350位的Thr、370位的Lys、405位的Phe和409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含409位的Lys和:a) 350位的Ile和405位的Leu，或者b) 370位的Thr和405位的Leu。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白包含350位的Thr、370位的Lys、405位的Phe和409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含350位的Ile、370位的Thr、405位的Leu 和 409 位的 Lys。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在407位具有非Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser或Thr的氨基酸。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val或Trp。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在407位具有Gly、Leu、Met、Asn或Trp。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有407位的Tyr和409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸,所述第二同二聚体蛋白具有407位的非Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser或Thr的氨基酸和409位的Lys。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有407位的Tyr和409位的非Lys> Leu或Met的氨基酸,所述第二同二聚体蛋白具有407位的Ala、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Val 或 Trp 和 409 位的 Lys。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有407位的Tyr和409位的非Lys> Leu或Met的氨基酸,所述第二同二聚体蛋白具有407位的Gly、Leu、Met、Asn或Trp和409位的Lys。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有407位的Tyr和409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白具有407位的非Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser或Thr的氨基酸和409位的Lys。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有407位的Tyr和409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白具有407位的Ala、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Val或Trp和409位的Lys。在另一个实施方案中，所述第一同二聚体蛋白具有407位的Tyr和409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白具有407位的Gly、Leu、Met、Asn或Trp和409位的Lys。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，第二同二聚体蛋白具有:
⑴在368位非Phe、Leu和Met的氨基酸，或者 ( )在370位的Trp，或者
(iii)在399位的非Asp、Cys> Pro、Glu或Gln的氨基酸。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在409位具有Arg、Ala、His或Gly，第二同
二聚体蛋白具有:
(i)在 368 位的 Lys、Gln、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Asn、Arg、Ser、Thr、Val 或 Trp,
或者
( )在370位的Trp，或者
(iii)在 399 位的 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr> Trp、Phe、His、Lys> Arg 或
Tyr。在一个实施方案中，第一同二聚体蛋白在409位具有Arg，第二同二聚体蛋白具有:
(i)在368 位的 Asp、Glu、Gly、Asn、Arg、Ser、Thr、Val 或 Trp,或者
(ii)在370位的Trp，或者
(iii)在399 位的 Phe、His、Lys> Arg 或 Tyr。除了上文指定的氨基酸取代以外，所述第一和第二同二聚体蛋白可含有相对于野生型Fe序列的其它氨基酸取代、缺失或插入。在又一个实施方案中，所述第一和第二 CH3区除了包含指定的突变以外，还包含在 SEQ ID NO:1 (IgGlm(a))阐明的序列:
SEQ ID NO:1:
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在又一个实施方案中，所述第一和第二 CH3区除了包含指定的突变以外，还包含在SEQID NO:2 (IgGlm⑴)阐明的序列:
SEQ ID NO:2:
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在又一个实施方案中，所述第一和第二 CH3区，除了包含指定的突变以外，还包含在SEQ ID NO:3 (IgGlm(ax))阐明的序列:
SEQ ID NO:3:
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK
在其它实施方案中，提供的同二聚体蛋白可以是显示优先配对的大鼠抗体和小鼠抗体(如描述于Lindhofer等(1995) J Immunol 155:219 (见上文))，或者所谓进入孔中的隆突变体抗体(如描述于美国专利5，731，168 (见上文))。但是，有时，后一种同二聚体起始蛋白可能更难制备，因为同二聚体CH3-CH3相互作用太弱。因此，可优选本文所述的在350、370,405和409位具有突变的变体。同二聚体起始蛋白铰链区的序列可变化。但是，所得异二聚体蛋白在一些情况下可能更稳定，如果铰链区不是IgG4样的，优选为IgGl样的。因此，在一个实施方案中，所述第一或所述第二同二聚体蛋白在(核心)铰链区都不包含 Cys-Pro-Ser-Cys 序列。在又一个实施方案中，所述第一和所述第二同二聚体蛋白在(核心)铰链区都包含 Cys-Pro-Pro-Cys 序列。在其中第一和所述第二同二聚体蛋白是抗体的许多实施方案中，所述抗体还包含轻链。如上文所解释的，所述轻链可能不同，即序列不同且各自只与一条重链形成功能性抗原结合域。但是，在另一个实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白是重链抗体，其不需要轻链用于抗原结合，见例如 Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446。如上所述，本发明方法的步骤c)包括在足以允许在铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起孵育。本文给出合适条件的实例。对用于经历二硫键异构化的铰链区中的半胱氨酸的最低要求可根据同二聚体起始蛋白，特别是根据铰链区中的确切序列而不同。重要的是，所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用足够弱以允许铰链区中的半胱氨酸在给定条件下经历二硫键异构化。在一个实施方案中，步骤c)的还原条件包括加入还原剂，如选自下列的还原剂:2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二流赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基-乙醇，优选选自下列的还原剂:2_巯基乙胺、二硫苏糖醇和二(2-羧乙基)勝。 在一个实施方案中，以所需氧化还原电位的方式描述使受控Fab臂互换成为可能的还原条件。三肽谷胱甘肽(GSH)是在细胞中的主要低分子量硫醇，并控制硫醇-二硫化物氧化还原状态，其为体内正常氧化还原信号转导必需。通过维持还原型GSH及其氧化形式GSSG的硫醇-至-二硫化物状态来实现细胞氧化还原平衡的动力学。可测量还原电位的数值，如参见 Rost 和 Rapoport, Nature 201: 185 (1964)和 Aslund 等，J.Biol.Chem.272:30780-30786 (1997)。将每个GSSG氧化两个GSH的化学计量加以考虑的氧化还原电位Eh为对氧化还原状态的定量衡量。通过能斯特方程式计算Eh:Eh = E0 + (RT/nF) In ([GSSG(氧化型)]/[GSH (还原型)]2)。Eo是在限定pH下氧化还原对的标准电位，R是气体常数，T是绝对温度，F是法拉第常数，η是转移的电子数。GSH/GSSG对的Eh的体内估测值是-260M-200 mV (Aw, Τ., News Physiol.Sc1.18:201-204 (2003))。因此终末分化的细胞维持-200 mV等级的Eh，而活跃增殖的细胞维持约-260 mV的更为还原的Eh。DTT 的标准氧化还原电位是-330 mV (Cleland 等 Biochemistry 3: 480-482(1964))。TCEP已显示在溶液中还原DTT，因此具有比DTT更负的氧化还原电位。但是精确数值尚未报道。因此可以所需氧化还原电位Eh的方式描述允许受控Fab臂互换条件的还原条件，所需氧化还原电位Eh最好低于在体内在正常血浆条件下获得的数值，并且高于还原位于铰链区且参与重链间二硫键形成的抗体二硫键以外的抗体二硫键的氧化还原电位。因此，在又一个实施方案中，步骤c)在具有低于-50 mV，比如低于_150 mV，优选-150 至-600 mV,比如-200 至-500 mV,更优选-250 至-450 mV,比如-250 至-400 mV,甚至更优选-260至-300 mV的氧化还原电位的还原条件下进行。在又一个实施方案中，步骤c)包括在至少25 mM 2_巯基乙胺存在下或者至少0.5mM 二硫苏糖醇存在下在至少20°C温度孵育至少90分钟。孵育可在5至8的pH，比如pH7.0或pH 7.4进行。在又一个实施方案中，步骤d)包括例如通过除去还原剂如通过脱盐将条件恢复至非还原性或较小还原性。·在一些实施方案中，本发明的方法得到抗体产物，其中超过80%，比如超过90%，如超过95%，比如超过99%抗体分子是期望的双特异性抗体。与基于共表达的现有技术方法相比后生产(post-production)更灵活和更容易控制。如本文公开的在还原条件(比如通过加入2-MEA)下通过Fab互换制备双特异性抗体的后生产性质使其成为用于(高通量)筛选多种特异性组合用于双特异性抗体发现的非常合适的策略。此外，体外方法可在文库中进行，这与共表达相比允许对异二聚体蛋白更大的控制、更高的灵活性和收率。该策略另外的优点是筛选可以最终的治疗形式进行，排除先导选择后对改造的需要。如上文所解释的，在又一方面，本发明的方法可用于“矩阵”筛选，即基于两组抗体产生大量的结合特异性的不同组合，一组抗体具有完全相同的第一 CH3区和另一组具有完全相同的第二 CH3区，其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用。因此，在一个实施方案中本发明涉及选择具有期望性质的异二聚体蛋白的方法，所述方法包括下述步骤:
a)提供第一组包含Fe区的同二聚体蛋白，其中同二聚体蛋白具有完全相同的第一CH3
区，
b)提供第二组包含Fe区的同二聚体蛋白，其中同二聚体蛋白具有完全相同的第二CH3
区，
其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用，
c)将所述第一组同二聚体蛋白与所述第二组同二聚体蛋白的组合孵育在足以允许在铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下，由此产生一组双特异性抗体，
d)任选恢复条件至非还原性，
e)针对给定的期望性质测定所得异二聚体蛋白组，和
f)选择具有期望性质的异二聚体蛋白。在一个实施方案中，本发明涉及选择具有期望性质的双特异性抗体的方法，所述方法包括下述步骤:
a)提供第一组包含具有不同可变区的抗体的同二聚体抗体，其中所述第一组的所述抗体包含完全相同的第一 CH3区，
b)提供第二组包含具有不同可变区或完全相同可变区的抗体的同二聚体抗体，其中所述第二组的所述抗体包含完全相同的第二 CH3区，
其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用，
c)将所述第一组抗体与所述第二组抗体的组合孵育在足以允许在铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下，由此产生一组双特异性抗体，
d)任选恢复条件至非还原性，
e)针对给定的期望性质测定所得双特异性抗体组，和
f)选择具有期望性质的双特异性抗体。在一个实施方案中，第二组同二聚体抗体具有不同的可变区。在一个实施方案中，第二组同二聚体抗体具有完全相同的可变区，但在抗原结合区外具有不同的氨基酸或结构变异。可根据期望以许多不同方式组成所述两组。因此，所述两组可靶向在相同抗原上的相同表位或不同的表位。所述两组还可靶向不同抗原，每组可含有与所述抗原上相同表位或不同表位结合的抗体。而且，所述组之一或所述两组可各自含有靶向不同抗原的抗体。在另一个实施方案中，所述期望的性质是细胞杀伤、细胞裂解、抑制细胞增殖，或者与表达两种抗原靶标的细胞结合。筛选策略包括两组含有一定范围特异性的抗体载体，其中将一组克隆入能够在还原条件(比如通过加入2-MEA)下参加与第二组主链的Fab臂互换的主链内。例如，将第一组克隆入IgGl-F405L主链，将第二组 克隆入IgGl-K409R主链(关于其它可能的主链组合还见实施例 19、28、29、30、35、36、37、38 和 39)。然后将两组抗体载体的每个成员各自小规模表达。例如,将所有抗体载体瞬时转染在HEK293细胞中，在24孔板的2.3 mL培养物中表达。或者，可使用本领域已知的其它合适的(小规模)制备系统。然后将两组抗体的表达抗体以矩阵样方式等摩尔地比成对混合。例如，将所有单独抗体通过小规模蛋白A层析纯化，通过在280 nm波长的吸光度测量抗体浓度。或者可使用其它合适的(小规模)纯化方法或者本领域已知的用于确定蛋白浓度的方法。在另一个实施方案中，如果表达培养基不影响下游应用则可省略纯化步骤。随后，标准化抗体浓度以便合适的体积包含等摩尔量的两种抗体。例如，将一组8种在F405L主链中的抗体各自与8种在K409R主链中的抗体混合以便64种100 μ 混合物含有80 Pg/mL抗体A (F405L)和80 Pg/mL抗体B (K409R)。或者，如果策略包含下游双特异性抗体特异性纯化步骤，则可省略标准化抗体量的步骤。向抗体的混合物内，加入合适量的还原剂，并在允许的温度下孵育合适的时间段。例如，向含 80 Pg/mL 抗体 A (F405L)和 80 Pg/mL 抗体 B (K409R)的 100 μ 内，加入 25 μ 125 mM 2-MEA (终浓度25 mM 2-MEA)并在25 °C孵育过夜。于是从混合物(现在含有双特异性抗体)除去还原剂以促进二硫键的氧化和避免筛选测定时还原剂的干扰。例如，使用Zeba Spin 96孔脱盐板(Pierce Biotechnology,#89807)通过进行64种混合物的缓冲液交换除去2-MEA。或者，可使用本领域已知的除去还原剂的其它合适方法。然后将双特异性抗体在生化上或功能上表征以鉴定先导候选物。例如，评估64种双特异性抗体对合适细胞系增殖的抑制或者对合适细胞系的结合。然后将鉴定的先导候选物以较大规模制备并更详细地表征。通过共表达制备
本发明的异二聚体蛋白还可通过使编码第一和第二多肽的构建体在单一细胞中共表达获得。因此，又一方面，本发明涉及制备异二聚体蛋白的方法，所述方法包含以下步骤:
a)提供编码包含免疫球蛋白第一Fe区的第一多肽的第一核酸构建体，所述第一 Fe区包含第一 CH3区，
b)提供编码包含免疫球蛋白第二Fe区的第二多肽的第二核酸构建体，所述第二 Fe区包含第一 CH3区，
其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用，和其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405和407。和/ 或
其中所述第一和第二 CH3区的序列使得当按实施例21所述测定时，每个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，比如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者0.01-0.1。c)使所述第一和第二核酸构建体在宿主细胞中共表达，和
d)从细胞培养物中获得所述异二聚体蛋白。用于制备抗体的合适表达载体(包括促进子、增强子等)和合适的宿主细胞在本领域众所周知。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，比如CHO或HEK细胞。在该方法的一个实施方案中，所述第一 CH3区在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区在405位具有非Phe的氨基酸。和/或
所述第一和第二 CH3区的序列使得当按实施例21所述测定时，每个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，比如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者0.01-0.1。在该方法的另一个实施方案中:
所述第一 CH3区在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区具有在405位的非Phe的氨基酸，比如在405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸或者
所述第一 CH3区在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区在407位具有非 Tyr ，Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸。在一些实施方案中，所述第一和第二多肽是结合不同表位的两种抗体的全长重链(即所述第一和第二核酸构建体编码结合不同表位的两种抗体的全长重链)，因此异二聚体蛋白是双特异性抗体。这种双特异性抗体可以是重链抗体，或者所述宿主细胞可另外表达编码轻链的一种或多种核酸构建体。如果只有一种轻链构建体与重链构建体共表达，则只有在轻链序列使得它可与每条重链形成功能性抗原结合域时，才形成功能性双特异性抗体。如果两种或更多种不同的轻链构建体与重链共表达，将形成多种产物。在其它实施方案中，本发明的共表达方法包括在上文体外方法下描述的任何其它特征。又一方面，本发明涉及包含上文指定的第一和第二核酸构建体的表达载体。在甚至又一方面，本发明涉及包含上文指定的第一和第二核酸构建体的宿主细胞。异二聚体蛋白
又一方面，本发明涉及通过本发明方法获得或可获得的异二聚体蛋白。另外，本发明的方法能够形成不对称分子，在每条Fab臂或者每个CH3域上具有不同特征的分子或者在整个分子内具有不同修饰的分子，例如具有用于缀合的非天然氨基酸取代的分子。此类不对称分子可以任何合适的组合产生。这在下文通过一些非限制性实例进一步说明。双特异性抗体可用于预靶向目标靶细胞，包括但不限于肿瘤细胞。靶细胞的预靶向可用于成像研究或者免疫治疗目的。在本发明方法的实施方案中，双特异性分子的第一 Fab臂结合肿瘤细胞，比如肿瘤细胞表面蛋白或者肿瘤细胞表面碳水化合物，比如本文列出的肿瘤细胞表面蛋白中的一种，第二 Fab臂识别放射活性效应分子，包括但不限于与肽或半抗原偶联或连接(经由螯合齐U)的放射性标记。此类放射性标记肽的实例是铟标记的二乙烯三胺五乙酸(抗DTPA(In)van Schai jk 等 Clin.Cancer Res.2005; 11: 7230s_7126s)。另一种实例是使用携带放射性核素比如锝-99的半抗原标记的胶粒比如脂质体、聚合物胶束的纳米粒(Jestin等Q JNucl Med Mol Imaging 2007; 51:51-60)。在另一个实施方案中 ，使用半抗原偶联的备选细胞生长抑制分子比如毒素。

在本发明方法的又一个实施方案中，将双特异性分子的第一 Fab臂在N297位置(EU编号)糖基化，将双特异性分子的第二 Fab臂去糖基化(aglycosylated)(非糖基化，例如通过将 N297 突变为 Q 或 A 或 E 突变(Bolt S 等，Eur J Immunol 1993，23:403-411))。在Fe区的不对称糖基化影响与Fe Y -受体的相互作用，影响抗体的抗体依赖性细胞毒性效应(Ha等，Glycobiology 2011年4月5号)以及与其它效应子功能分子比如Clq的相互作用。在本发明方法的另一个实施方案中，双特异性分子的第一 Fab臂与FcRn (新生儿 Fe 受体)相互作用(Roopenian DC 等 Nat.Rev.1mmunol.2007, 7: 7I5-725),通过使分子上FcRn相互作用位点突变例如通过产生H435A突变，来损害第二 Fab臂与FcRn结合(Shields, R.L.等，J Biol Chem, 2001, Firan, M.等，Int Immunol, 2001)。在本发明方法的另一个实施方案中，双特异性分子的第一 Fab臂与经常用于抗体纯化的葡萄球菌蛋白 A (蛋白 A, Deisenhofer 等，Biochemistry 20, 2361-2370 (1981)和链球菌蛋白G (蛋白G，Derrick等，Nature 359，752-754 (1992)相互作用，双特异性分子第二 Fab臂与蛋白A或G的相互作用受损。结果是，通过用蛋白A或G纯化双特异性分子，容易清除在互换成异二聚体后残留量的具有受损的蛋白A或G结合的同二聚体。在另一个实施方案中，在双特异性分子两条Fab臂中的一条上改善或减少与Fcy-受体或FcRn的结合。在另一个实施方案中，在双特异性分子两条Fab臂中的一条上改善或减少与Clq的结合。在另一个实施方案中，已将蛋白改造为在分子的两条Fab臂中的一条或两条上增强补体活化。在另一个实施方案中，存在于双特异性分子中的每条Fab臂从不同的IgG亚类衍生。在另一个实施方案中，存在于双特异性分子中的每条Fab臂携带不同的异型突变(Jefferis & Lefranc, 2009, MABs 1:332-8)。在另一个实施方案中，另一类不对称免疫治疗分子通过用免疫活性细胞因子、免疫刺激性细胞因子或免疫抑制性细胞因子置换双特异性分子的一条Fab臂的Fab产生。此类细胞因子的非限制性实例是IL-2、IFN-a、IFN-β、IFN1、TNF-α、G-CSF, GM-CSF,IL-10、IL-4、IL-6、IL-13。或者，在分子中包括(生长)因子或激素刺激剂或抑制剂。在另一个实施方案中，一条Fab臂的Fab被裂解肽置换，裂解肽即能够裂解肿瘤细胞、细菌、真菌等的肽，包括但不限于抗微生物肽如爪蟾抗菌肽、蜂毒肽(mellitin)、天蚕杀菌妝、KLAKKLAK 及其变体(Schweizer 等 Eur.J.Pharmacology 2009; 625: 190-194，Javadpour, J.Med.Chem., 1996, 39: 3107-3113，Marks 等，Cancer Res 2005;65:2373-2377，Rege 等，CancerRes.2007; 67:6368-6375)或阳离子裂解肽(CLYP 技术，US2009/0269341)。在另一个实施方案中，Fab臂上的Fab中之一或两者被细胞因子和/或生长因子的受体置换，产生所谓诱饵受体，其中靶向TNF- α的Enbrel (依那西普)和靶向VEGF的VEGF-trap是众所周知的实例。将这两种诱饵受体合并入一个分子内显示优于单一诱饵受体的优秀活性(Jung, J.Biol.Chem.2011; 286:14410-14418)。

在另一个实施方案中，另一类不对称免疫治疗分子通过将免疫活性细胞因子、免疫刺激性细胞因子或免疫抑制性细胞因子与存在于双特异性分子中的Fab臂中的一条或两条的N-端或C-端融合而产生。这可对双特异性分子的抗肿瘤活性产生积极影响。此类分子的实例是(但不限于下文列表)IL-2 (Fournier等，2011，Int.J.0ncology,do1: 10.3892/i j0.2011.976)、IFN-α、IFN-β 或 IFN-Y (Huan 等，2007; J.1mmunol.179:6881-6888，Rossie 等，2009; Blood 114: 3864-3871)、TNF-α。或者，细胞因子比如G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL_4、IL-6或IL-13的N-端或C-端融合可积极地影响双特异性抗体分子效应子功能。或者将(生长)因子或激素刺激剂或抑制剂包括在分子的N-端或C-端。在另一个实施方案中，裂解肽比如抗微生物肽如爪蟾抗菌肽、蜂毒肽、天蚕杀菌妝、KLAKKLAK 及其变体(Schweizer 等 Eur.J.Pharmacology 2009; 625: 190-194，Javadpour, J.Med.Chem., 1996, 39: 3107-3113，Marks 等，Cancer Res 2005;65:2373-2377，Rege 等，CancerRes.2007; 67:6368-6375)或阳离子裂解肽(CLYP 技术，US2009/0269341)在一条或两条Fab臂上的N-端或C-端融合可增强分子的活性。在另一个实施方案中，另一类别的不对称免疫治疗分子是单价抗体，该分子以一条Fab臂与选择的靶标相互作用。在此类分子中，存在于双特异性分子中的一条Fab臂针对选择的祀分子，分子的第二条Fab臂不携带Fab或者具有非结合/非功能性Fab比如对MetMab所述的(Genentech; WO 96/38557)。或者，可产生单体的Fe-融合蛋白比如对因子VIII 和 IX 所述的那些(Peters 等，Blood 2010; 115: 2057-2064)。或者，可通过本发明方法产生任何上述不对称分子的组合。在甚至又一方面，本发明涉及异二聚体蛋白，其包含含有免疫球蛋白第一 Fe区的第一多肽，所述第一 Fe区包含第一 CH3区；和含有免疫球蛋白第二 Fe区的第二多肽，所述第二 Fe区包含第二 CH3区，其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用，
其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405和407和/或
其中所述第一和第二 CH3区的序列·使得当按实施例21所述测定时，各个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，比如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者0.01-0.1。在一个实施方案中，所述第一 CH3区具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸并且所述第二 CH3区具有在405位的非Phe的氨基酸
和/或
所述第一和第二 CH3区的序列使得当按实施例21所述测定时，各个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，比如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者0.01-0.1。在异二聚体蛋白的又一个实施方案中
所述第一 CH3区具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区具有在405位的非Phe的氨基酸，比如在405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸或者
所述第一 CH3区具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区具有在407 位的非 Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸。在其它实施方案中，本发明的异二聚体蛋白包含上文关于制备方法描述的任何其它特征。因此，在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽是抗体(优选人抗体)的全长重链。在本发明异二聚体蛋白的另一个实施方案中，所述第二多肽是抗体(优选人抗体)的全长重链。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一和第二多肽都是两种抗体(优选结合不同表位的两种人抗体)的全长重链，因此所得异二聚体蛋白是双特异性抗体。这种双特异性抗体可以是重链抗体，或者是除了重链以外还包含两条全长轻链(其可相同或不同)的抗体。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，第一多肽的Fe区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的(除了指定突变以外)，第二多肽的Fe区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的(除了指定突变以外)。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽两者的Fe区都是IgGl同种型的。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述多肽的一个Fe区是IgGl同种型的，另一个是IgG4同种型的。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，异二聚体相互作用与各个同二聚体相互作用相比的强度增加归因于CH3修饰，而非归因于共价键、半胱氨酸残基或荷电残基的引入。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，异二聚体蛋白中所述第一与第二多肽之间的异二聚体相互作用使得在描述于实施例13的条件下在0.5 mM GSH时不会发生Fab臂互换。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所得异二聚体蛋白中所述第一与第二多肽之间的异二聚体相互作用使得在描述于实施例14的条件下在小鼠体内不会发生Fab臂互换。 在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含在405位的Phe和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区包含在405位的非Phe的氨基酸和在409位的Lys。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含在405位的Phe和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基 酸，所述第二 CH3区包含在405位的Leu和在409位的Lys。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二 CH3区包含在405位的Leu和在409位的Lys。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区包含在409位的Lys和:a)在350位的Ile和在405位的Leu，或者b)在370位的Thr和在405位的Leu。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含在409位的Arg，所述第二 CH3区包含在409位的Lys和:a)在350位的Ile和在405位的Leu，或者b)在370位的Thr和在405位的Leu。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含在350位的Thr、在370位的Lys、在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二 CH3区包含在409位的Lys和:a)在350位的Ile和在405位的Leu，或者b)在370位的Thr和在405位的Leu。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一 CH3区包含在350位的Thr、在370位的Lys、在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二 CH3区包含在350位的He、在370位的Thr、在405位的Leu和在409位的Lys0在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽或所述第二多肽在铰链区都不含Cys-Pro-Ser-Cys序列。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽两者在铰链区都包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。在本发明异二聚体蛋白的又一个实施方案中，所述第一多肽和/或所述第二多肽包含除去用于Asn-连接的糖基化的受体位点的突变。革E抗原如上文所解释的，在本发明的重要实施方案中，异二聚体蛋白是包含两个具有不同结合特异性(即结合不同表位)的可变区的双特异性抗体。原则上，任何特异性组合都是可能的。如上文提到，双特异性抗体有可能用于克服单特异性抗体的一些局限性。单特异性抗体一种可能的局限性是缺乏对期望的靶细胞的特异性，这是因为靶抗原表达在对其不期望抗体结合的其它细胞类型上。例如，在肿瘤细胞上过度表达的靶抗原也可表达在健康组织，这可导致在用针对该抗原的抗体治疗后产生不期望的副作用。对只表达在靶细胞类型上的蛋白具有进一步特异性的双特异性抗体有可能改善与肿瘤细胞的特异性结合。因此，在本发明一个实施方案中，所述第一和第二表位位于同一细胞如肿瘤细胞上。肿瘤细胞上的合适祀标包括但不限于下列祀标:erbBl (EGFR)、erbB2 (HER2)、erbB3、erbB4、MUC-U CD19、CD20、CD4、CD38、CD138、CXCR5、c_Met、HERV-包膜蛋白、骨膜蛋白(periostin)、818113、5 六1 (:、80 、0)79、0)3736卩1^111、1^-0六厘、六父1^组织因子(TF)、CD74、EpCAM和MRP3。肿瘤细胞祀标的可能组合包括但不限于:erbBl + erbB2、erbB2 + erbB3、erbBl + erbB3、CD19 + CD20、CD38 + CD34、CD4 + CXCR5、CD38 + RANKL、CD38 + CXCR4、CD20 + CXCR4、CD20 + CCR7、CD20 + CXCR5、CD20 + RANKL、erbB2 + AXL、erbBl + cMet、erbB2 + c_Met、erbB2 + EpCAM、c-Met + AXL、c_Met + TF、CD38 + CD20、CD38 + CD138。在又一个实施方案中，所述第一和第二表位可位于同一祀抗原上,其中两个表位在靶抗原上的位置使得抗体与一个表位的结合不干扰抗体与另一表位的结合。在本文又一个实施方案中，所述第一和第二同二聚体蛋白是结合位于同一靶抗原上两个不同表位，但具有不同的靶细胞如肿瘤细胞杀伤作用模式的抗体。例如，在一个实施方案中，靶抗原是erbB2 (HER2)，双特异性抗体组合培妥珠单抗和曲妥珠单抗抗原结合位点。在另一个实施方案中，靶抗原是erbBl (EGFr)，双特异性抗体组合扎芦木单抗和尼妥珠单抗抗原结合位点。双特异性抗体还可作为介质用于将效应机制再靶向疾病相关组织如肿瘤。因此，在又一个实施方案中，所述第一表位或所述第二表位位于肿瘤细胞比如肿瘤细胞蛋白或肿瘤细胞碳水化合物上，另一表位位于效应细胞上。在一个实施方案中，效应细胞是T细胞。效应细胞上的可能靶标包括下列靶标:Fe Y RI (⑶64):表达在单核细胞和巨噬细胞和活化的嗜中性粒细胞上；Fe Y RIII (⑶16):表达在自然杀伤细胞和巨噬细胞上；⑶3:表达在循环T细胞上；CD89:表达在PMN (多形核嗜中性粒细胞)、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞KD32a:表达在巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞上；表达在嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的Fe ε RI。在一个实施方案中表位位于表达在T细胞上的⑶3上。在另一个实施方案中，第一抗体对病原微生物具有结合特异性，第二抗体对效应细胞蛋白(比如 CD3、CD4、CD8、CD40、CD25、CD28、CD16、CD89、CD32、CD64、Fe ε RI 或 CDl)具有结合特异性。另外，双特异性抗体可用于使化疗剂更特异性地靶向该化疗剂应对其发挥作用的细胞。因此，在一个实施方案中，同二 聚体蛋白中的一种是识别小分子或肽的抗体，或者能够例如根据描述于Rader等，(2003) PNAS 100:5396的原理与此类分子形成共价键。在本发明方法的又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞表面蛋白(比如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、EGFR3vII1、CEA, MUC-U CD19、CD20、CD4、CD38、EPCAM、c_Met、AXL、Ll-CAM、组织因子、CD74或者CXCR5)具有结合特异性(即结合所述肿瘤细胞或肿瘤细胞表面蛋白上的表位)，第二抗体对化疗剂比如毒素(包括放射性标记肽)、药物或前药具有结合特异性。双特异性抗体还可用于靶向囊泡，如电子致密囊泡，或者含有针对肿瘤的毒素、药物或前药的微细胞。参见例如MacDiarmid等(2009) Nature Biotech 27:643。微细胞是非染色体细胞，其是不含有染色体DNA的异常细胞分裂产物。因此，在另一个实施方案中，其中所述第一或所述第二表位位于肿瘤细胞，比如肿瘤细胞蛋白或肿瘤细胞碳水化合物上，另一表位位于电子致密囊泡或微细胞上。另外，通过将对血清蛋白的结合特异性包括在双特异性抗体中可改变抗体的血清半衰期。例如，通过将对血清白蛋白的结合特异性包括在双特异性抗体中可延长血清半衰期。因此，在本发明方法又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白比如erbBl (EGFR)、erbB2 (HER2)、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4、CD38、CD 138、CXCR5、c-Met、HERV-包膜蛋白、骨膜蛋白、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFrvI 11, Ll-CAM, AXL、组织因子(TF)、⑶74、EpCAM或MRP3、CEA具有结合特异性，第二抗体对血液蛋白比如血清白蛋白具有结合特异性。第二结合特异性还可用于使抗体靶向特定组织，比如中枢神经系统或脑(跨越血脑屏障)。因此，在本发明方法又一个实施方案中，第一抗体对脑特异性靶标具有结合特异性，脑特异性靶标比如淀粉样蛋白_β (如用于治疗阿尔茨海默病)、Her-2(如用于治疗乳腺癌脑转移)、EGFr (如用于治疗原发性脑癌)、Nogo A (如用于治疗脑损伤)、TRAIL (如用于治疗HIV)、α-突触核蛋白(如用于治疗帕金森病)、Htt (如用于治疗亨廷顿病)、朊病毒(如用于治疗疯牛病)、西尼罗病毒蛋白；第二抗体对血脑屏障蛋白具有结合特异性，血脑屏障蛋白比如转铁蛋白受体(TfR)、胰岛素受体、黑素转铁蛋白受体(MTfR)、乳铁蛋白受体(LfR)、载脂蛋白E受体2 (ApoER2)、LDL受体相关蛋白I和2 (LRPI和LRP2)、高级糖基化终产物的受体(RAGE)、白喉毒素受体=肝素结合表皮生长因子样生长因子(DTR= HB-EGF)、gpl90 (Abbott 等，Neurobiology of Disease 37 (2010) 13-25)。对血脑屏障蛋白的 结合特异性还可用于使另一种非抗体分子靶向特定组织，t匕如中枢神经系统或脑(跨越血脑屏障)。因此，在又一个实施方案中，一种同二聚体蛋白是对血脑屏障蛋白(比如TfR、胰岛素受体、MTfR, LfR, ApoER2、LRPl、LRP2、RAGE、DTR (=HB-EGF)或gpl90)具有结合特异性的全长抗体，另一种同二聚体蛋白是在N-或C-端连接另一种蛋白的Fe区，所述蛋白比如细胞因子、可溶性受体或者其它蛋白，如VIP (血管活性肠肽)、BDNF (脑衍生的神经营养因子)、FGF (成纤维细胞生长因子)、多种FGF、EGF(表皮生长因子)、PNA (肽核酸)、NGF (神经生长因子)、神经营养蛋白(NT)-3、NT-4/5、胶质细胞衍生的神经营养因子、睫状神经营养因子、神养蛋白、神经调节蛋白、白介素、转化生长因子(TGF)-C1、TGF-β、促红细胞生成素、肝细胞生长因子、血小板衍生的生长因子、artemin、persephin、导蛋白、心肌营养蛋白-1、干细胞因子、中期因子、多效营养因子、骨形态发生蛋白、脑信号蛋白、脑信号蛋白、白细胞抑制因子、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰基-半乳糖胺-6-硫酸酯酶、芳香基硫酸酯酶B、酸性α -葡萄糖苷酶或者鞘憐脂酶(Pardridge, Bioparmaceutical drug targeting to the brain (革巴向脑的生物药物)，Journal of Drug Targeting 2010, 1-11; Pardridge, Re-engineeringBiopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojan horses (用于利用分子特洛伊木马递送至脑的再改造生物药物).Bioconjugate Chemistry 2008, 19:1327-1338。此外，第二结合特异性可用于使凝血因子靶向特别期望的作用位点。例如，具有对肿瘤细胞的第一结合特异性和对凝血因子的第二结合特异性的双特异性抗体可把血液凝固指向肿瘤，由此停止肿瘤生长。因此，在本发明方法又一个实施方案中，第一抗体对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白比如 erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC_l、CD19、CD20、CD4 或 CXCR5 具有结合特异性，第二抗体对参与凝血的蛋白比如组织因子具有结合特异性。其它特别引入关注的结合特异性组合包括:CD3 + HER2、CD3 +CD20、IL-12 +IL18、IL-1a + IL-lb、VEGF + EGFR、EpCAM + CD3、CD2 + CD3、CD3 + CD3、HER2 + CD64、EGFR + CD64、CD30 + CD16、NG2 + CD28、HER2 + HER3、CD20 + CD28、HER2 + CD16、BeI2 +CD3、CD19 + CD3、CEA + CD3、EGFR + CD3、IgE + CD3、EphA2 + CD3、CD33 + CD3、MCSP +CD3、PSMA + CD3、TF + CD3、CD19 + CD16、CD19 + CD16a、CD30 + CD16a、CEA + HSG、CD20+ HSG, MUCl + HSG, CD20 + CD22、HLA-DR + CD79、PDGFR + VEGF, IL17a + IL23、CD32b+ CD25、CD20 + CD38、HER2 + AXL、CD89 + HLA 类别 I1、CD38+CD138、TF + cMet、Her2 +EpCAM、HER2 + HER2、EGFR + EGFR、EGFR + c-Met,c-Met + 非结合臂以及 G-蛋白偶联受体的组合。在又一个实施方案中，本发明的双特异性抗体可基本按照Taylor等J.1mmunol.158:842-850 (1997)和 Taylor 和 Ferguson, J.Hematother.4:357-362，1995 所述，通过靶向红细胞而用于清除病原体、病原性自身抗体或者有害化合物比如来自循环的毒液和毒素。所述第一表位位于红细胞(红血球)蛋白(包括但不限于红细胞补体受体1)上，所述第二表位位于待靶定清除的化合物或生物体上。在又一个实施方案中，第二 Fab臂包含代表自身抗原或者连接自身抗原的缀合位点比如dsDNA的融合蛋白。因此通过本发明的双特异性抗体靶向病原体、自身抗体或有害化合物以及接着的红细胞介导的清除，可在各种疾病和综合征的治疗中具有治疗效用。缀合
在本发明的其它实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至选自下列的化合物:毒素(包括放射性同位素)、前药或药物。此类化合物可例如在癌症疗法中更有效地杀伤靶细胞。因此所得异二聚体蛋白是免疫缀合物。或者化合物可与所得异二聚体蛋白偶联，即在已发生Fab臂互换之后。用于形成本发明免疫缀合物的合适化合物包括泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二轻炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌罗霉素、抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨(fludarabin)、5-氟尿喃唳、达卡巴嗪(decarbazine)、轻基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烧化剂(例如氮芥、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺钼和其它钼衍生物，例如卡钼)、抗生素(例如放线菌素D (旧称放线菌素)、博来霉素、柔红霉素(旧称道诺霉素)、多柔比星、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、安曲霉素(AMC))、白喉毒素和相关分子(例如白喉A链和其活性片段和杂交分子)、蓖麻毒蛋白毒素(例如蓖麻毒蛋白A或去糖基化蓖麻毒蛋白A链毒素)、霍乱毒素、志贺样毒素(SLT-1、SLT-1I> SLT-1IV) > LT毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素、alorin、肥阜草蛋白、塑莲根毒蛋白I1、gelanin、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAP1、PAP11和PAP-S)、苦瓜ijnomordica charan tia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴 毒蛋白、肥阜草isapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素毒素。其它合适的缀合分子包括核糖核酸酶(RNase)、脱氧核糖核酸酶1、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌内毒素、美登木素生物喊、Auristatins (MMAE、MMAF)、刺抱霉素和 Duocarmycin 类似物(Ducry 和 Stump,Bioconjugate Chem.2010, 21: 5-13)、Dolostatin-lO、Dolostatin-15、伊立替康或其活性代谢物SN38、吡咯并苯并二氮杂 (PBD’ S)。在本发明又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至α发射体，包括但不限于钍-227、镭-223、铋-212和锕-225。在本发明又一个实施方案中，第一和/或第二同二聚体蛋白连接至β发射放射性核素，包括但不限于碘-313、钇-90、氟-18、铼-186、镓-68、锝-99、铟-111和镥-177。在另一个实施方案中，待缀合化合物包括核酸或核酸相关分子。在本发明一个这样的方面，缀合的核酸是细胞毒性核糖核酸酶、反义核酸、抑制性RNA分子(如SiRNA分子)或免疫刺激性核酸(如免疫刺激性含CpG基序的DNA分子)。可采用本领域已知用于缀合的任何方法,包括描述于Hunter等，Nature 144，945 (1962), David 等，Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain 等，J.Tmmunol.Meth.40, 219 (1981)和 Nygren, J.Histochem.and Cytochem.30, 407 (1982)的方法。可通过使其它部分与蛋白的N-端侧 或C-端侧在化学上缀合制备缀合物(参见例如AntibodyEngineering Handbook, Osamu Kanemitsu 编辑，Chijin Shokan 出版(1994))。在适当的情况下，还可通过在内部残基或糖处缀合产生此类缀合的抗体衍生物。作用剂可直接或间接与本发明的蛋白偶联。第二作用剂间接偶联的一个实例是通过间隔基部分偶联。用于药物缀合物的连接技术最近已概括于Ducry和Stump (2010) Bioconjugate Chem.21: 5。鉬合物和用涂
在又一个主要方面，本发明涉及包含如本文所述的本发明异二聚体蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。可按照常规技术配制药物组合物，所述常规技术例如公开于下述文献中的常规技术:Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第 19版，Gennaro主编，MackPublishing C0., Easton, PA, 1995。本发明的药物组合物可包含例如稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如非离子型洗涤剂，例如吐温-20 (Tween-20)或吐温_80)、稳定剂(例如不含糖或蛋白质的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适于纳入药物组合物中的其它物质。药学上可接受的载体包括与本发明的化合物在生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延缓剂等。可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐溶液、乙醇、葡萄糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇)。药学上可接受的载体包括无菌水性溶液剂或分散剂和用于临时配制无菌注射用溶液剂或分散剂的无菌粉剂。可通过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过保持所需粒径和通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(I)水溶性抗氧化齐U，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化齐IJ，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α -生育酚等；和⑶金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。本发明的药物组合物还可在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇，例如甘露醇、山梨糖醇、甘油或氯化钠。本发明的药物组合物还可含有适于所选给药途径的可提高药物组合物的保存期限或有效性的一种或多种辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂。可将本发明的化合物与可防止化合物快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。这类载体可包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、生物可降解的生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和单独的或与蜡一起的聚乳酸，或者本领域众所周知的其它物质。用于制备这类制剂的方法一般为本领域技术人员所知。可根据需要通过将所需量的活性化合物与例如上文列举的一种成分或成分的组合一起掺入适当溶剂中，接着除菌微量过滤，来制备无菌注射用溶液剂。药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对于特定患者、组合物和给药方式有效实现所需治疗反应而又对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多个药代动力学因素，包括所用的本发明具体组合物的活性、给药途径、给药时间、所用具体化合物的排泄率、治疗持续时间、与所用具体组合物联用的其它药物、化合物和/或物质、待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等医学领域众所周知的因素。可通过任何合适的途径和方式给予药物组合物。在一个实施方案中，胃肠外给予本发明的药物组合物。本文所用“胃肠外给予”意指非肠内和局部给药的给予方式，通常通过注射给予,包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中，通过静脉内或皮下注射或输注而给予药物组合物。在一个主要方面，本发明涉及用作药物的本发明异二聚体蛋白比如本发明的双特异性抗体。本发明的异二聚体蛋白可用于多种目的。具体来讲，如上文解释的，本发明的异二聚体蛋白可用于治疗各种形式的癌症，包括转移癌和难治性癌。因此，一方面，本发明涉及抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，其包括将如本文描述的本发明异二聚体蛋白给予有需要的个体。

在另一个实施方案中本发明的异二聚体蛋白用于治疗免疫疾病和自身免疫疾病、炎性疾病、感染性疾病、心血管疾病、CNS和肌肉骨骼疾病。调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。例如，可给予单次推注，可随时间给予若干分剂量，或可按治疗情况危急程度所示，按比例减少或增加剂量。异二聚体蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病况，可由本领域技术人员决定。本发明双特异性抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围为约0.1-100 mg/kg,比如约0.1-50 mg/kg,例如约0.1-20 mg/kg,比如约0.1-10 mg/kg,例如约0.5,约比如0.3,约1、约3、约5或者约8 mg/kg ο具有本领域普通技能的医生或兽医可容易决定和处方开给有效量的所需药物组合物。例如，医生或兽医可以低于达到·所需治疗效果所需的水平开始给予用于药物组合物中的异二聚体蛋白的剂量，逐渐增加剂量直到达到所需效果。一般而言，本发明组合物的合适日用量是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。给药可以是例如胃肠外，例如静脉内、肌内或皮下。本发明的异二聚体蛋白还可预防性给药以减小发生疾病比如癌症的危险，在疾病进展中延迟事件出现的开始时间，和/或当疾病比如癌症缓解时减小复发的危险。本发明的异二聚体蛋白比如双特异性抗体还可在组合疗法中给药，即与其它与待治疗疾病或病况有关的治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含异二聚体蛋白的药物与一种或更多种其它治疗剂比如细胞毒性剂、化疗剂或抗血管生成剂组合。此类组合给药可以同时、单独或序贯给予。在又一个实施方案中，本发明提供治疗或预防疾病比如癌症的方法，该方法包括给予有需要的受试者治疗有效量的与放疗和/或手术组合的异二聚体蛋白，比如本发明的双特异性抗体。本发明的异二聚体蛋白比如双特异性抗体还可用于诊断目的。
实施例实施例1:用于表达人IgGl_2F8和IgGl_7D8的表达载体
将 HuMab 2F8 (W0 02/100348)和 HuMab 7D8 (W0 04/035607)的 VH 和 VL 编码区克隆在表达载体pConGlf (含有人IgGlf异型恒定区的基因组序列(Lonza Biologies))中用于制备人IgGl重链,和克隆在pConKappa (含有人κ轻链恒定区，Lonza Biologies)中用于制备K轻链。对于IgG4抗体，将VH区插入pTomG4载体(含有在pEE12.4载体(LonzaBiologies)中的人IgG4恒定区的基因组序列)中。或者，在随后的构建体中，使用含有在PEE12.4载体中的重链(IgGl或IgG4)的完全密码子优化编码区或者在pEE6.4载体(LonzaBiologies)中的HuMab 2F8或HuMab 7D8的人κ轻链的载体。实施例2:用于表达铰链缺失的IgGl_2F8和含有特定突变的人IgGl和IgG4CH2-CH3片段的表达载体
为了在抗体重链的铰链和CH3区引入突变，根据制造商的推荐使用Quickchange定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla, CA)。或者完全合成构建体或将VH区克隆在已含有编码取代的特定氨基酸的载体中。通过PCR或者合成构建完全密码子优化的编码CH2和CH3片段的构建体。这些构建体具有N-端信号肽和6个氨基酸的His标签，含有人IgGl/4恒定区的341-447位氨基酸。将构建体克隆在PEE12.4中。为了构建铰链缺失的IgGl (Un1-Gl)分子，制备编码具有EGFR特异性的人IgGl同种型的Un1-Gl形式的合成DNA构建体。在该构建体中天然铰链区(如由铰链外显子所限定的)缺失。在IgGl构建体中在158位制造额外的Ser至Cys突变以补救该亚型中HC链与LC链之间的Cys键。蛋白序列显示如下。将构建体插入到pEE6.4载体中，称为pHGl_2F8。QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWDDGSYKYY ⑶ SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGVMKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
实施例3:用于表达恒河猴IgG4-2F8和IgG4-7D8的表达载体合成含有中国恒河猴IgG4重链和κ轻链的编码区和Humab 2F8和7D8的VH和VL区的载体，将其完全密码子优化并插在PEE12.4 (重链)和ρΕΕ6.4 (轻链)中。所用重链恒定区序列(基于由Scinicariello等，Immunology 111: 66-74，2004描述的序列)如下(与人序列比对):
权利要求
1.一种用于产生异二聚体蛋白的体外方法，所述方法包含以下步骤: a)提供包含免疫球蛋白Fe区的第一同二聚体蛋白，所述Fe区包含第一CH3区， b)提供包含免疫球蛋白Fe区的第二同二聚体蛋白，所述Fe区包含第二CH3区， 其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用， c)在足以允许铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一蛋白与所述第二蛋白一起孵育，和 d)获得所述异二聚体蛋白。
2.权利要求1的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白选自⑴Fe区，(ii)抗体，(iii)包含Fe区的融合蛋白，和(iv)与前药、肽、药物或毒素缀合的Fe区。
3.权利要求1的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白是全长抗体。
4.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第二同二聚体蛋白是全长抗体。
5.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二同二聚体蛋白都是抗体且结合不同的表位。
6.述权利要求中任一项的体外方法，其中第一同二聚体蛋白的Fe区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同 种型的，其中第二同二聚体蛋白的Fe区是选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的。
7.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和所述第二同二聚体蛋白两者的Fe区都是IgGl同种型的。
8.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述同二聚体蛋白的一个Fe区是IgGl同种型的，另一个是IgG4同种型的。
9.述权利要求中任一项的体外方法，其中与每种同二聚体相互作用相比的异二聚体相互作用强度增加是因为CH3修饰，而非因为引入共价键、半胱氨酸残基或荷电残基。
10.述权利要求中任一项的体外方法，其中在所得异二聚体蛋白中所述第一蛋白与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在实施例13描述的条件下在0.5 mM GSH下不会发生Fab臂互换。
11.述权利要求中任一项的体外方法，其中在所得异二聚体蛋白中所述第一蛋白与第二蛋白之间的异二聚体相互作用使得在实施例14描述的条件下在小鼠体内不会发生Fab臂互换。
12.述权利要求中任一项的体外方法，其中例如按照实施例30所述测定时，在所得异二聚体蛋白中所述第一蛋白与第二蛋白之间的异二聚体相互作用强度为两种同二聚体相互作用中的最强相互作用强度的大于2倍，例如大于3倍，例如大于5倍。
13.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二CH3区的序列使得当按照实施例30所述测定时，在所得异二聚体蛋白中所述第一蛋白与第二蛋白之间异二聚体相互作用的解离常数低于0.05微摩尔。
14.述权利要求中任一 项的体外方法，其中所述第一和第二CH3区的序列使得当按照实施例21所述测定时，两种同二聚体相互作用的解离常数都高于0.01微摩尔，比如高于,0.05微摩尔，优选0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5,比如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者0.01-0.1微摩尔。
15.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二CH3区的序列在不同的位置含有氨基酸取代。
16.权利要求15的体外方法，其中氨基酸取代基是天然氨基酸或非天然氨基酸。
17.述权利要求中任一项的体外方法，其中与野生型CH3区相比，所述第一同二聚体蛋白在CH3区具有不超过I个氨基酸取代，第二同二聚体蛋白在CH3区具有不超过I个氨基酸取代。
18.述权利要求1至16中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405、407和409，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405、407和409，其中所述第一同二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白不在相同位置取代。
19.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405 和 407。
20.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在405位具有非Phe的氨基酸。
21.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在405位具有非Phe、Arg或Gly的氨基酸。
22.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的非Phe的氨基酸和在409位的Lys。
23.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸和在409位的Lys。
24.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的Leu和在409位的Lys。
25.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸和在409位的Lys。
26.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含在405位的Leu和在409位的Lys0
27.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。
28.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu ο
29.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白包含在370位的Lys、在405位的Phe和在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白包含在409位的Lys、在370位的Thr和在405位的Leu。
30.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸,所述第二同二聚体蛋白在407位具有非Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸。
31.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val 或 Trp0
32.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基 酸,所述第二同二聚体蛋白在407位具有Gly、Leu、Met、Asn或 Trp0
33.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白具有在407位的非 Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸和在 409 位的 Lys。
34.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白具有在407位的 Ala、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Val 或 Trp 和在 409 位的 Lys。
35.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白具有在407位的 Gly、Leu、Met、Asn 或 Trp 和在 409 位的 Lys。
36.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白具有在407位的非Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸和在 409 位的 Lys。
37.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的Arg，所述第二同二聚体蛋白具有在407位的Ala、Gly、His、He、Leu、Met、Asn、Val 或 Trp 和在 409 位的 Lys。
38.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在407位的Tyr和在409位的Arg,所述第二同二聚体蛋白具有在407位的Gly、Leu、Met、Asn或Trp和在409位的Lys。
39.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，第二同二聚体蛋白具有: ⑴在368位的非Phe、Leu和Met的氨基酸，或者 (ii)在370位的Trp，或者 (iii)在399位的非Asp、Cys>Pro、Glu或Gln的氨基酸。
40.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在409位的Arg、Ala、His或Gly,第二同二聚体蛋白具有:(i)在 368 位的 Lys、Gin、Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Asn、Arg、Ser、Thr> Val 或 Trp,或者 (ii)在370位的Trp，或者(iii)在399 位的 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr> Trp> Phe、His、Lys> Arg 或Tyr。
41.述权利要求1至18中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白具有在409位的Arg，第二同二聚体蛋白具有:(i)在368 位的 Asp、Glu、Gly、Asn、Arg、Ser、Thr、Val 或者 Trp,或者 (ii)在370位的Trp，或者(iii)在399 位的 Phe、His、Lys> Arg 或 Tyr。
42.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和第二CH3区除了指定突变以外包含在SEQ ID NO:1阐明的序列。
43.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白或所述第二同二聚体蛋白在铰链区都不包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。
44.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白在铰链区都包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
45.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白和第二同二聚体蛋白除了任何指定突变以外是人抗体。
46.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白和第二同二聚体蛋白是重链抗体。
47.述权利要求1至46中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白和所述第二同二聚体蛋白都进一步包含轻链。
48.权利要求47的体外方法，其中所述轻链是不同的。
49.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一同二聚体蛋白和/或所述第二同二聚体蛋白包含除去用于Asn连接的糖基化的受体位点的突变。
50.述权利要求中任一项的体外方法，其中在步骤a)和b)提供的所述第一和第二同二聚体蛋白是纯化的。
51.述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一和/或第二同二聚体蛋白与药物、前药或毒素缀合或者含有其受体基团。
52.述权利要求4至51中任一项的体外方法,其中所述第一表位和/或所述第二表位位于肿瘤细胞上。
53.述权利要求4至52中任一项的体外方法，其中所述第一表位或所述第二表位位于肿瘤细胞上，另一表位位于效应细胞上。
54.述权利要求4至53中任一项的体外方法，其中表位位于T细胞，比如在T细胞上表达的⑶3上。
55.述权利要求4至52中任一项的体外方法，其中所述第一表位或所述第二表位位于肿瘤细胞上，另一表位位于放射性同位素、毒素、药物或前药上，放射性同位素、毒素、药物或前药可任选与肽或半抗原偶联或连接。
56.述权利要求4至52中任一项的体外方法，其中所述第一表位或所述第二表位位于肿瘤细胞上，另一表位位于电子致密囊泡或微细胞上。
57.述权利要求1至52中任一项的体外方法，其中所述同二聚体蛋白都是抗体，其中第一抗体和第二抗体结合至相同肿瘤细胞上的不同表位。
58.述权利要求1至52中任一项的体外方法，其中所述同二聚体蛋白都是抗体，其中第一抗体结合至肿瘤细胞上的表位，另一抗体是无关或无活性抗体，其对于预期应用没有任何相关的体内结合活性。
59.述权利要求中任一项的体外方法，其中在步骤c)的还原条件包括加入还原剂，如选自下列的还原剂:2_巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦或其化学衍生物。
60.述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)在具有-150至-600mV、t匕如-250至-400 mV的氧化还原电位的还原条件下进行。
61.述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括在至少25mM 2-巯基乙胺的存在下或者在至少0.5 mM 二硫苏糖醇的存在下在至少20°C温度孵育至少90分钟。
62.述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤d)包括除去还原剂，如通过脱盐。
63.一种用于选择具有期望的性质的双特异性抗体的方法，所述方法包括下列步骤: a)提供第一组包含具有不同可变区的抗体的同二聚体抗体，其中所述第一组的所述抗体包含完全相同的第一 CH3区， b)提供第二组包含具有不同可变区或完全相同的可变区的抗体的同二聚体抗体，其中所述第二组的所述抗体包含完全相同的第二 CH3区， 其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用， c)在足以允许铰链区的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下孵育所述第一组抗体和所述第二组抗体的组合，从而产生一组双特异性抗体， d)任选恢复条件至非还原性， e)针对给定的期望性质测定所得双特异性抗体组，和 f)选择具有期望性质的双特异性抗体。
64.权利要求63的方法，其中第二组同二聚体抗体具有不同的可变区。
65.权利要求63的方法，其中第二组同二聚体抗体具有完全相同的可变区，但在抗原结合区外具有不同的氨基酸或结构变异。
66.一种用于制备异二聚体蛋白的方法，所述方法包含以下步骤: a)提供编码包含免疫球蛋白第一Fe区的第一多肽的第一核酸构建体，所述第一 Fe区包含第一 CH3区， b)提供编码包含免疫球蛋白第二Fe区的第二多肽的第二核酸构建体，所述第二 Fe区包含第一 CH3区， 其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用，并且 其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405和407 ； 和/或 其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列使得当按照实施例21所述测定时，各个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，比如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者 0.01-0.1 ； c)使所述第一和第二核酸构建体在宿主细胞中共表达，和 d)从细胞培养物获得所述异二聚体蛋白。
67.权利要求66的方法，其中 所述第一 CH3区具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区具有在405位的非Phe的氨基酸，比如在405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸 或者 所述第一 CH3区具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区具有在407 位的非 Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸。
68.权利要求66或67的方法，其中所述第一和第二多肽是结合不同表位的两种抗体的全长重链。
69.述权利要求66至68中任一项的方法，其中步骤c)进一步包括将一种或更多种编码轻链的核酸构建体在所述宿主细胞中共表达。
70.述权利要求66至69中任一项的方 法，其进一步包括权利要求2至58中任一项或多项的特征。
71.一种表达载体,其包含在权利要求66至70中任一项指定的核酸构建体。
72.一种宿主细胞，其包含在权利要求66至70中任一项指定的核酸构建体。
73.一种异二聚体蛋白，其通过前述权利要求1至72中任一项的方法获得或可获得。
74.一种异二聚体蛋白，其包含:含有免疫球蛋白第一 Fe区的第一多肽，所述第一 Fe区包含第一 CH3区；和含有免疫球蛋白第二 Fe区的第二多肽，所述第二 Fe区包含第二 CH3区，其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列不同，并使得所述第一 CH3区与第二 CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一 CH3区与第二 CH3区各自的同二聚体相互作用，和 其中所述第一同二聚体蛋白在409位具有非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二同二聚体蛋白在选自下列的位置具有氨基酸取代:366、368、370、399、405和407 和/或 其中所述第一 CH3区与第二 CH3区的序列使得当按照实施例21所述测定时，各个CH3区的同二聚体相互作用的解离常数为0.01-10微摩尔，比如0.05-10微摩尔，更优选0.01-5，比如0.05-5微摩尔，甚至更优选0.01-1微摩尔，比如0.05-1微摩尔，0.01-0.5或者 0.01-0.1。
75.权利要求73的异二聚体蛋白，其中 所述第一 CH3区具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区具有在405位的非Phe的氨基酸，比如在405位的非Phe、Arg或Gly的氨基酸 或者 所述第一 CH3区具有在409位的非Lys、Leu或Met的氨基酸，所述第二 CH3区具有在407 位的非 Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gin、Arg、Ser 或 Thr 的氨基酸。
76.权利要求74或75的异二聚体蛋白，其中所述第一和第二多肽是结合不同表位的两种抗体的全长重链。
77.权利要求76的异二聚体蛋白，其进一步包含两条全长轻链。
78.述权利要求73至77中任一项的异二聚体蛋白，其进一步包含权利要求2至58中任一项或多项的特征。
79.权利要求74至78中任一项的异二聚体蛋白，其用作药物。
80.权利要求79的异二聚体蛋白，其用于治疗癌症。
81.一种药物组合物，其包含权利要求74至78中任一项的异二聚体蛋白和药学上可接受的载体。
82.一种用于抑制肿瘤细胞生长和/或增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，其包括将权利要求74至78中任一项的 异二聚体蛋白给予有需要的个体。
全文摘要
本文公开了新的含异二聚体抗体Fc的蛋白(比如双特异性抗体)和用于制备此类蛋白的新方法。
文档编号C07K16/32GK103097417SQ201180030540
公开日2013年5月8日 申请日期2011年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者A.F.拉布里恩, J.米斯特斯, E.v.d.布雷默, J.J.内杰森, P.v.伯克尔, B.d.戈伊杰, T.文克, J.范德温克尔, J.舒尔曼, P.帕伦 申请人:根马布股份公司