专利名称：一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
免疫分析方法(Immunoassay，IA)是一种以抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析的一门技术，是基于抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应，具有特异性强、灵敏度高、方便快速、高通量、检测成本低、安全可靠等特点。该方法一般不需要贵重仪器，使用人员技术要求不高，容易普及和推广，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析。以该技术为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等已广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。免疫分析法起始于20世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，创立了放射免疫分析技术。1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免·疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术(放射性标记、酶标记、荧光标记、金标记、化学发光等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。标记免疫分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记，这种标记物既保持了抗体或抗原的活性，也不影响标记物的活性，当它与相应抗体或抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，从而直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用，可以提高免疫分析技术的敏感性。免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点，已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。目前采用免疫分析方法进行多残留检测常有两种方法，一种是采用一类药物的共有结构作为免疫半抗原，获得对同类农药具有特异性识别反应的广谱抗体，如Alococer等用有机磷的通用结构膦酸作为半抗原，成功制备了广谱性的多克隆抗体，且对10种以上的有机磷农药有特异性识别；骆爱兰等用拟除虫菊酯类农药的共有结构间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原，也成功制备了广谱性的多克隆抗体，并对5种菊酯有特异性识别。另一种是采用将多个农药的半抗原偶联到载体蛋白上制备成人工抗原，经过动物免疫获得对目标农药有特异性识别的“宽谱特异性抗体(broad specificity antibody)”,如王姝婦等通过对人工抗原的设计，将克百威、三唑磷、毒死蜱和甲基对硫磷半抗原偶联到一个载体蛋白分子上制备出了多抗原决定簇的人工抗原并获得了能同时识别上述四种农药的“宽谱特异性”多克隆抗体，达到多残留检测的目的。抗体在多残留免疫分析中的作用非常关键，抗体质量的好坏直接影响免疫分析的准确性和灵敏度，因此获得好的抗体是多残留免疫分析技术的首要工作，已报道的药物多残留免疫检测的抗体均为多克隆抗体，由于多克隆抗体会随着动物种类及个体差异而有变化，生产数量上也会受到一定的限制，制备的抗体可重复性差，在应用中会受到一定的限制，随着单克隆抗体技术的出现，解决了抗体制备过程中抗体性状不稳定的问题，并且单克隆抗体技术获得的杂交瘤细胞在体外能无限量分泌性状稳定的抗体，因此，在小分子药物免疫分析中单克隆抗体已逐渐取代多克隆抗体。传统的免疫快速诊断技术中使用的抗体不论是多克隆抗体还是普通单克隆抗体，一个抗体分子均只识别一种或者一类抗原，使检测范围受到很大的限制，随着单克隆杂交瘤技术的发展和不断完善，Milstein等首次报道了一株能分泌双特异性单克隆抗体(Bispecific Monoclonal Antibodies, BisMcAb)的杂交-杂交瘤(Hybrid Hybridomas)细胞，标志着双特异性单克隆抗体技术的创立。双特异性单克隆抗体是结构上双价，功能上单价的免疫球蛋白分子。其基本结构中两个Fab端的结构和功能不相同，能分别结合两种不同抗原。由于双特异性单克隆抗体在结构上的特殊性，具有两个不同的抗原识别位点，如果能把该抗体技术引入到药物残留快速诊断技术中来，特别是在面临多残留快速检测技术需求的背景下，在一定程度上能满足多残留检测所面临的新的要求，该技术从抗体的结构和特性上入手，区别于传统的多残留免疫分析技术在半抗原和人工抗原的结构上进行一系列的改造，通过杂交-杂交瘤技术获得能特异性识别两种同类药物甚至是结构差异大得两类药物的双特异性单克隆抗体，与传统的抗体快速检测相比具有质的飞跃，为探索药物多残留快速检测技术新的研究领域和发展方向方面具有重要意义。三唑憐[triazophos, 0,0-二乙基-0_ (1-苯基-1, 2,4_三唑_3_基)硫代憐酸酯]，作为甲胺磷等高毒农药的替代品种，近年来被广泛应用于果树、蔬菜、谷物、茶叶等作物上鳞翅目害虫、螨类、线虫等的防治，也是长江流域防治水稻螟虫不可替代的农药品种。三唑磷原药属中等毒性，对鱼、蜜蜂有毒害作用。由于三唑磷在农业生产上的广泛使用，其在作物及环境中的残留问题也逐渐受到人们的重视。目前，三唑磷残留的检测一般采用色谱和色质联用等理化分析方法，`虽然结果准确，但检测设备昂贵，需专业人员操作，样品前处理方法烦琐，不适于批量样品的筛选检测任务，因此，开发一种简单、快速，适于农药残留现场监控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的现实意义。毒死蝶[chlorpyrifos, 0，O-二乙基_0_ (3，5，6_三氯_2_卩比唳基)硫代磷酸酯]，商品名为毒死蝶，乐斯本等，1965年由Dow Chemical Company推广使用的一种高效杀虫剂，在世界范围内应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。它对哺乳动物毒性中等，但对非靶标水生生物毒性较高。由于毒死蜱广泛地应用于农业生产上，在粮食等作物上引起的残留问题已有所报道。而且，环境样品中发现毒死蜱残留的情况也日趋严重，对人们的健康构成了潜在的威胁。因此，随着人们对毒死蜱残留的毒性与环境风险的日益关注，急需更科学、快捷和高效的检测手段。目前，有关毒死蜱残留量分析方法多采用气相色谱法。由于常规仪器分析方法不适于批量样品的筛选检测或现场检测任务，而免疫分析技术因其具有快速、方便、廉价等优点，成为新的发展趋势。
目前虽然有三唑磷和毒死蜱的免疫分析技术报道，但均局限于单一的分析技术和手段，在面临多残留分析需求的背景下，建立能同时检测两种或者两类目标化合物的免疫分析技术就显得尤为迫切，而制备优质的双特异性单克隆抗体是建立免疫多残留分析技术的新的手段和方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体及其制备方法和应用的技术方案。所述的一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体对三唑磷和毒死蜱同时具有特异性。所述的一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤
1)合成三唑磷和毒死蜱的半抗原和人工抗原；
2)利用三唑磷人工抗原制备分泌抗三唑磷的杂交瘤细胞株；
3)利用毒死蜱人工抗原制备分泌抗毒死蜱的杂交瘤细胞株；
4)抗三唑磷的杂交瘤细胞株 和抗毒死蜱的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体。所述的一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中分泌抗三唑磷的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到以4-
硫代磷酰胺基]-丁酸为半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，然后经过含8-杂氮鸟嘌呤或5-溴-2-脱氧尿苷筛选，使其HGPRT酶或者TK酶缺陷后得到分泌抗三唑磷的杂交瘤细胞株。所述的一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中分泌抗毒死蜱的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到以4-
-丁酸为毒死蜱半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，然后经过含5-溴-2-脱氧尿苷或8-杂氮鸟嘌呤筛选，使其HGPRT酶或者TK酶缺陷后得到分泌抗毒死蜱的杂交瘤细胞株。所述的一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体在检测三唑磷和毒死蜱中的应用。本发明制备得到的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，并用这个抗体建立了 ELISA分析方法，为三唑磷和毒死蜱的快速检测提供技术基础。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步说明本发明。1.免疫原的制备1.1三唑磷半抗原、人工抗原和包被抗原的的制备1.1.1 O-乙基硫代磷酰二氯(TZLM-1)的合成
称取三氯硫磷(PSCl3) 68 g(约O. 4 mol)置于带有低温温度计的三口烧瓶中，以冰盐水浴将其冷却至-10 -5 °C,在剧烈搅拌下滴加入无水乙醇55g (约1. 2 mol),严格控制滴加速度，使反应液温度始终不大于O °C。滴加完毕后在10 °C下继续反应2 h。反应完，以(0±5)°C蒸馏水洗涤反应液(100 ml X 2)，分出油层并以无水Na2SO4干燥，再经水泵减压蒸馏，收集65 75 °C馏分，得到51. 8 g无色透明油状液体(收率72. 3%，以三氯硫磷计)。1.1. 2 O-乙基-O -[3-(1-苯基-1, 2，4_ 三唑基)]硫代磷酰一氯(TZLM-2)的合成
称取TZM-1 36 g (约O. 2 mol)置于250 ml三口烧瓶中，按照投料比TZM-1:1-苯基-1，2，4-三唑醇=1:1 1:6在搅拌下加入1-苯基-1，2，4-三唑醇，再加入15 30 mlTEA和80 120 ml 二氯甲烷。待固体全部溶解后，用冰水浴将该溶液降温至20 °C以下，加入微量催化剂并逐滴加入55 ml 2 mol/L的NaOH水溶液，继续反应I h。反应完毕后，加入50 ml 5%Na0H冰水溶液，振荡后分出水层，油层以冰水洗涤至中性，再经无水Na2S04干燥，减压浓缩，得少量棕色油状物，该油状物用石油醚萃取(50 ml X2)，提取液再减压浓缩，得10. 6 g黄色液体(收率35%，以1-苯基-1，2，4-三唑醇计)。1.1. 3三唑磷半抗原4-[O-乙基-O-[3-(1-苯基_1，2，4_三唑基)]硫代磷酰胺基]-丁酸(简称THBu)的合成
称取1. 03 g (约10 mmol ) 4-氨基丁酸,溶解于10 ml NaOH溶液(I mol/L)中，置于250 ml三口烧瓶中，冰水浴冷却至0-10 °C，搅拌下缓慢加入1. 51 g (约5 mmol)溶解于10 ml 二氧六环的TZLM-2溶液，滴加10 ml NaOH水溶液(I mol/L)。升温至15 — 25 °C，反应4 h。反应完毕后，加入50 ml水，再用石油醚洗涤上述混合液(40 ml X 2)，弃石油醚层，以2 mol/L HCl调节水相pH约为3，再以乙酸乙酯萃取(40 ml X 2)，提取液用少量水洗涤后经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，残余物于4°C密封存放过夜，有无色晶体析出。以乙酸乙酯-石油醚重结晶，过滤，干燥，得1. 01 g白色固体(收率54%，以一氯中间体计)。1.1. 4免疫原的合成与纯化 采用碳二亚胺法，将50 80 Mmol半抗原THBu，溶解在I 2 mL的N，N- 二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环已基碳二亚胺和N—羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500 800 μ 缓慢滴加到4 8 ml 15 20 mg/mL的牛血清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4 6 h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2 4次，然后用生理盐水透析3 d，分装保存于一 20 V的冰箱中。1.1.5包被抗原的合成
采用混合酸酐法，将50 80 Mmol半抗原THBu，溶解在I 2 ml的N，N- 二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应I h后，取500 800 μ 反应液加入到4 8 mll5 20 mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4 6 h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2 4次，然后用生理盐水透析3 d，分装保存于一 20 °C的冰箱中。1. 2毒死蜱半抗原和人工抗原的制备1.2.1 O-乙基硫代磷酰二氯(CHM-1)的合成
称取三氯硫磷(PSCl3) 68 g(约0. 4 mol)置于带有低温温度计的三口烧瓶中，以冰盐水浴将其冷却至-10 -5 °C,在剧烈搅拌下滴加入无水乙醇55 8(约1.2 mol),严格控制滴加速度，使反应液温度始终处于-30 O °C。滴加完毕后在-20 10 1继续反应2 h。反应完，以(0±5) °C蒸馏水洗涤反应液(100 ml X 2)，分出油层并以无水Na2SO4干燥，再经水泵减压蒸馏，收集65 75 °C馏分，得到51. 8 g无色透明油状液体(收率72. 3%，以三氯硫磷计)。1. 2. 2 O-乙基-O 5，6_三氯_2_吡啶基)硫代磷酰氯(CHM-2)的合成称取CHM-1 18.8 g (约0.05 mol)置于250 ml三口烧瓶中，按照投料比CHM-1:
3，5，6-三氯吡啶-2-酚=1:1在搅拌下加入3，5，6-三氯吡啶-2-酚，再加入15 30 mlTEA和80 120 ml DCM0待固体全部溶解后，用冰水浴将该溶液降温至_20 20 V以下，加入微量催化剂并逐滴加入55 ml 2 mol/L的NaOH水溶液，继续反应I h。反应完毕后，加入50 ml 5%Na0H冰水溶液，振荡后分出水层，油层以冰水洗涤至中性，再经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得少量棕色油状物，该油状物用石油醚萃取(50 ml X2)，提取液再减压浓缩，得8. 35 g黄色液体(收率40. 9%，以三氯吡啶酚计)。1. 2. 3毒死牌半抗原4_
_ 丁酸(简称CHBu)的合成
称取1. 03g (约10 mmol ) 4-氨基丁酸,溶解于10 ml NaOH溶液(I mol/L)中，置于250 ml三口烧瓶中，冰水浴冷却至0-10 °C，搅拌下缓慢加入3. 41 g(约10 mmol)溶解于10 ml 二氧六环的CHM-2溶液,滴加10 ml NaOH水溶液(I mol/L)。保温反应2h。反应完毕后，加入50ml 5%Na0H冰水溶液，调节反应液的pH约为8 10。再用石油醚洗涤上述混合液(40 mlX2)，弃石油醚层，以2 mol/L HCl调节水相pH约为3，再以乙酸乙酯萃取(40 ml X 2),提取液用少量水洗漆后经无水Na2S04干燥,减压浓缩,残余物于4°C密封存放过夜，有无色晶体析出。以乙酸乙酯-石油醚重结晶，过滤，干燥，得1. 33g白色固体(收率32. 6%,以4_氛基丁酸计)。
1.2. 4免疫原的合成与纯化
免疫原的合成利用碳二亚胺法。将50 80 Mmol半抗原CHBu，溶解在I 2 ml的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环已基碳二亚胺和N—羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500 800 μ 加入到4 8 mll5 20 mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4 6 h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2 4次，然后用0. 8 0. 9%生理盐水透析，分装保存于一 20°C的冰箱中。1. 2. 5包被抗原的合成与纯化
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将50 80 Mmol半抗原CHBu,溶解在I 2 ml的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应I h后,取500 800 μ 反应液加入到4 8 mll5 20 mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应2 6 h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2 4次，然后用0. 8 0. 9%生理盐水透析，分装保存于一 20°C的冰箱中。2.免疫动物
实验选用6-10周龄的BALB/C小鼠，20-22 g，免疫5_10只小鼠。取6 — 8周龄体重18-20 g BALB/C雌性小鼠，将制备的THBu-BSA交联物和CHBu-BSA交联物分别与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射，剂量为50 μδ/每只，以后每隔3周，取抗原(与一免等剂量)和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔和皮下注射加强免疫，加强免疫共4次，末免以加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3 d后取脾细胞进行融合。3.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-12 1的比例，在无血清的RPM1-1640培养基中混匀，1500 rpm离心5 min，去除培养基，用50 % PEG (Sigma)作为融合剂，在37 °C下水浴下加入O. 5-0. 7 ml，使其融合2 min，用无血清的RPM1-1640培养基终止融合后1500 rpm离心5 min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37 °C, 5 % C02的细胞培养器皿中培养。4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞在细胞培养板中培养5 d后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。三唑磷筛选共获30多个对上述抗原有反应的阳性孔，选择其中10个呈强阳性反应的细胞孔进行间接ELISA，最后筛选5个较理想的阳性孔 ，这5个阳性孔进行有限稀释法克隆，最终获得I株能分泌抗三唑磷的特异性抗体的杂交瘤细胞5E3，经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。毒死蜱筛选共获40多个对上述抗原有反应的阳性孔，选择其中15个呈强阳性反应的细胞孔进行间接ELISA，最后筛选6个较理想的阳性孔，这6个阳性孔进行有限稀释法克隆，最终获得I株能分泌抗毒死蜱的特异性抗体的杂交瘤细胞1H9，经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。5.单克隆抗体的特异性检测
阳性孔的特异性检测采用间接ELISA方法，用包被液稀释成I 一 10 ug/mL的包被抗原(THBu-OVA、CHBu-OVA) 100 uL/孔包被ELISA板，37 V 2 h，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用I 一 10%的脱脂奶粉或I 一 3% BSA或3 — 6%牛血清封闭30-60 min;加入阳性孔培养上清100 uL/孔，37 0C 1-2 h ;PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)100 uL/孔，37 V I 一 2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2 mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD49tl的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。6.四体杂交瘤细胞的制备
对5E3细胞株用含8-杂氮鸟嘌呤(8-AG)浓度为100-300 Pg/mL的RPMI1640培养基培养3-6周，使5E3细胞HGPRT酶缺失；对1H9细胞株采用含5-溴-2-脱氧尿苷(5-BrdU)浓度为50-300 Pg/mL的RPMI1640培养基中培养3_6周，使1H9细胞胸苷激酶(TK)缺失；将上述两种酶缺陷型细胞进行再融合制备杂交-杂交瘤细胞，以三唑磷包被抗原和毒死蜱包被抗原进行阳性和灵敏度筛选，以对三唑磷和毒死蜱具有较好的特异性和灵敏度为筛选依据，最终筛选获得2株四体杂交瘤细胞6D6和2F8，经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。7.双特异性单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射O. 3-0. 5 ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X IO6个6D6杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000 rpm离心3 min,收集上清液，即为双特异性单克隆抗体腹水。取I倍体积腹水加2倍体积O. 06M pH4. 8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30 μΙ/mL腹水)，室温下边加边搅拌，4 °C澄清lh，12000rpm离心20 min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4 °C放置2 h，3000 rpm离心20 min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4 1流动透析24 h后即获纯化的腹水抗体，-70 °C保存。8.双特异性单克隆抗体ELISA分析方法的建立8.1三唑磷ELISA分析方法的建立
采用包被抗体-酶标半抗原的反应模式，建立ELISA分析方法。具体步骤如下1.确定工作浓度。采用正交实验法梯度包被双特异性单克隆抗体浓度为O. 125-8 μδ/mL于ELISA板，37°C 2 h，PBST洗涤三次后用I — 10%的脱脂奶粉或1 — 3% BSA或3 —6%牛血清封闭30-60 min，加入浓度梯度为1-32 ng/mL酶标半抗原THBu-HRP，100 uL/孔，37 0C1- 2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2 mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD49tl的值，OD值在1. O左右的抗体-酶标半抗原的浓度组合为初选工作浓度，然后将初选的双特异性单克隆抗体包被ELISA板，37 V 2 h，PBST洗涤三次后用I 一 10%的脱脂奶粉或I 一 3% BSA或3 — 6%牛血清封闭30-60 min;加入梯度稀释的三唑磷标准溶液50 μ 1，再加入经缓冲液稀释的2倍浓度的酶标半抗原50 μ 1,37 °C I 一 2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2 mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD49tl的值，根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算抑制率(％)=
权利要求
1.一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体对三唑磷和毒死蜱同时具有特异性。
2.一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)合成三唑磷和毒死蜱的半抗原和人工抗原；2)利用三唑磷人工抗原制备分泌抗三唑磷的杂交瘤细胞株；3)利用毒死蜱人工抗原制备分泌抗毒死蜱的杂交瘤细胞株；4)抗三唑磷的杂交瘤细胞株和抗毒死蜱的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体的制备方法， 其特征在于所述的步骤2)中分泌抗三唑磷的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到以4-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-丁酸为半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，然后经过含8-杂氮鸟嘌呤或5-溴-2-脱氧尿苷筛选，使其HGPRT酶或者TK酶缺陷后得到分泌抗三唑磷的杂交瘤细胞株。
4.如权利要求2所述的一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体的制备方法， 其特征在于所述的步骤3)中分泌抗毒死蜱的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到以 4-[O-乙基-O-(3，5, 6-二氯-2-卩比唳基)硫代憐酸胺基]_ 丁酸为毒死蝶半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选,然后经过含5-溴-2-脱氧尿苷或8-杂氮鸟嘌呤筛选，使其HGPRT酶或者TK酶缺陷后得到分泌抗毒死蜱的杂交瘤细胞株。
5.一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体在检测三唑磷和毒死蜱中的应用。
全文摘要
一种抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。该双特异性单克隆抗体对三唑磷和毒死蜱同时具有特异性；该单克隆抗体的制备方法如下合成三唑磷和毒死蜱的半抗原和人工抗原；利用三唑磷人工抗原制备分泌抗三唑磷的杂交瘤细胞株；利用毒死蜱人工抗原制备分泌抗毒死蜱的杂交瘤细胞株；抗三唑磷的杂交瘤细胞株和抗毒死蜱的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗三唑磷和毒死蜱的双特异性单克隆抗体。本发明制备得到的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，并用这个抗体建立了ELISA分析方法，为三唑磷和毒死蜱的快速检测提供技术基础。
文档编号C07K16/44GK103044553SQ20121056919
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者金仁耀, 朱国念, 桂文君 申请人:浙江工商大学