一种抗间皮素的纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途
【专利摘要】本发明公开了一种抗间皮素的纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途，它涉及一种抗肿瘤分化抗原的纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途。本发明提供的抗间皮素的纳米抗体的氨基酸如SEQ?ID?NO：2所示。抗间皮素的纳米抗体编码基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。用抗间皮素的纳米抗体制备高表达间皮素癌细胞的探针或制备抑制高表达间皮素癌细胞的药物。本发明纳米抗体mesnab1能够特异性结合肿瘤细胞表面表达的间皮素，可用于治疗和诊断间皮素高表达的肿瘤，以及研究间皮素在肿瘤发生中的作用。本发明可应用于生物、医学领域。
【专利说明】一种抗间皮素的纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗肿瘤分化抗原的纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途。【背景技术】
[0002]间皮素(mesothelin，MSLN)是近年来新发现的一种肿瘤分化抗原。其前体是糖磷脂酰基醇(GPI)锚定的、糖基化的细胞表面蛋白，可被furin蛋白酶水解为31kD的N-末端分泌型蛋白和40kD的C-末端蛋白，后者主要以膜结合的GPI锚定的形式存在，有限分布于正常间皮细胞及表面上皮细胞，故命名为间皮素。
[0003]间皮素在正常组织中有限表达，而在某些肿瘤中高表达，如胰腺癌(100%病例)、卵巢腺癌(70%的病例)、肺腺癌(50%的病例)和恶性间皮瘤(100%的病例)等。间皮素诱导肿瘤发生的机制可能包括以下三个方面:
[0004]第一，间皮素可以通过与粘蛋白MUC16 (即CA125)相互作用而促进肿瘤细胞的腹膜种植和转移；
[0005]第二，间皮素能通过NF- K B信号通路促进肿瘤细胞的存活和增殖；
[0006]第三，间皮素的表达会增强肿瘤细胞对某些特定的药物(如:TNF-c1、紫杉醇、钼-环磷酰胺复合物)的耐受能力。
[0007]由此可见，间皮素是一个用于肿瘤治疗的理想靶标。
【发明内容】
[0008]间皮素作为一种用于肿瘤治疗的理想靶标，本发明提供一种抗肿瘤分化抗原的纳米抗体及其编码基因和该纳米抗体的用途。
[0009]本发明抗间皮素的纳米抗体的氨基酸如SEQ ID NO:2所示。
[0010]上述抗间皮素的纳米抗体编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011]用上述抗间皮素的纳米抗体制备高表达间皮素癌细胞的探针。
[0012]用上述抗间皮素的纳米抗体制备抑制高表达间皮素癌细胞的药物。
[0013]本发明抗间皮素的纳米抗体被命名为纳米抗体mesnabl。纳米抗体mesnabl能够特异性结合肿瘤细胞表面表达的间皮素，通过对肿瘤细胞的迁移等抑制作用而用于高表达间皮素癌症的治疗。
[0014]本发明纳米抗体mesnabl可用于治疗和诊断间皮素高表达的肿瘤(如胰腺癌、卵巢腺癌、肺腺癌和恶性间皮瘤)，以及研究间皮素在肿瘤发生中的作用。
[0015]本发明纳米抗体mesnabl分子量较小，约15kD，因此具有更好的组织渗透性，结合空间上存在位阻效应的抗原表位的能力也更强。所以，可以将本发明纳米抗体mesnabl作为口服药用于治疗间皮素高表达的肿瘤。
[0016]本发明纳米抗体mesnabl具有与FcRn的结合能力，血衆半衰期长达IOh。
[0017]本发明纳米抗体mesnabl可在原核表达系统进行表达，具有生产成本低、周期短的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是实施例3中纳米抗体mesnabl和间皮素结合ELISA测定结果图，图1中“ ”曲线为纳米抗体mesnabl，图1中“ ?”曲线为阴性对照抗体mOls ；
[0019]图2是实施例4中与纳米抗体mesnabl共孵育的人卵巢癌细胞SK_0V_3细胞明场观察图；
[0020]图3是实施例4中与纳米抗体mesnabl共孵育的人卵巢癌细胞SK-0V-3细胞TexasRed荧光检测图；
[0021]图4是实施例4中与纳米抗体mesnabl共孵育的人卵巢癌细胞SK_0V_3细胞DAPI染色检测图；
[0022]图5是实施例4中与抗体mOls共孵育的人卵巢癌细胞SK-0V-3细胞明场观察图；
[0023]图6是实施例4中与抗体mOls共孵育的人卵巢癌细胞SK-0V-3细胞Texas Red荧光检测图；
[0024]图7是实施例4中与抗体mOls共孵育的人卵巢癌细胞SK_0V_3细胞DAPI染色检测图；
[0025]图8是实施例5流式细胞分析检测图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明说明，本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】,还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0027]【具体实施方式】一:
[0028]本实施方式抗间皮素的纳米抗体的氨基酸如SEQ ID NO:2所示。
[0029]本实施方式抗间皮素的纳米抗体可用于高表达间皮素癌症的治疗，包括胰腺癌、卵巢腺癌、肺腺癌和恶性间皮瘤等。
[0030]本实施方式抗间皮素的纳米抗体可用作探针，用于检测高表达间皮素的肿瘤，如胰腺癌、卵巢腺癌、肺腺癌和恶性间皮瘤等。
[0031]本实施方式抗间皮素的纳米抗体还可以与自身或其它多肽融合，用于高表达间皮素癌症的治疗和检测。
[0032]本实施方式抗间皮素的纳米抗体与其它分子偶联，包括但不仅限于放射性同位素和毒素，形成偶联抗体用于高表达间皮素癌症的治疗和检测。
[0033]本实施方式纳米抗体mesnabl具有较高的抗聚集能力。
[0034]本实施方式纳米抗体mesnabl引入一对二硫键，因此稳定性高,其Tm值不低于80°C。本实施方式纳米抗体mesnabl具有更为优异的可溶性表达与蛋白酶抗性。
[0035]【具体实施方式】二:
[0036]本实施方式抗间皮素的纳米抗体的核酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0037]本实施方式抗间皮素的纳米抗体的核酸序列由生物工程公司合成。
[0038]实施例1。
[0039]按SEQ ID NO:1人工合成得到纳米抗体mesnabl的基因，克隆到原核表达载体pComb3中，转化入E.coli HB2151中;再接种菌种于含100 μ g/ml氨苄的SB培养基(IL培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和IOg MOPS, pH值用NaOH调至7.0)中，待0D600达到0.7~1.0时加入IPTG至终浓度为200 μ g/ml，于37°C、220r/min的条件下进行诱导表达14~16h ;然后在4°C、6000r/min条件下15min离心收集菌体，弃培养基，沉淀重悬于Buffer A (50mM Tris-HCl, 450mM NaCl,pH8.0)中，再经多粘菌素 B (polymyxin B)处理 I小时后离心收集上清；用N1-NTA树脂(QIAGEN公司)纯化纳米抗体mesnabl。
[0040]实施例2。
[0041]经SDS-PAGE验证纳米抗体mesnabl的纯度在98%以上。随后用截留分子量为3kD的超滤离心管(Merck Millipore公司)超滤浓缩纳米抗体mesnabl。以pComb为载体表达所得到的纳米抗体mesnabl的C-末端含6 XHis标签和FLAG标签。
[0042]实施例3。
[0043]将间皮素(2 μ g/mL)包被在ELISA板上，4 V孵育过夜后用PBS+3%mi Ik于37 °C封闭Ih0加入不同稀释浓度的纳米抗体mesnabl，37°C孵育2小时后用PBST (PBS+0.05%Tween20)洗四次，再加辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗FLAG单克隆抗体于37°C孵育I小时后，用PBST 洗四次，再加入 ABTS 进行检测。并以抗体 m01s(Gong R, et al., J Biol Chem.,2011)作为阴性对照。
[0044]纳米抗体mesnabl和间皮素结合的EC50为273nM,而抗体mOls不能和间皮素结合(如图1所示)。ELISA实验证明纳米抗体mesnabl能够与抗原间皮素相结合。
[0045]实施例4。
[0046]将500 μ L 的 SK-0V-3 (5Χ IO5 ~6Χ IO5 个 /ml)细胞接种 24 孔板，培养 14 ~16h后加入纳米抗体mesnabl，3`7°C孵育2小时；之后用PBSA (PBS+0.5%BSA)、PBS分别清洗3次后加入荧光二抗(Texas Red偶联的羊抗鼠IgG)于37°C孵育Ih后，再用PBSA、PBS分别清洗洗3次后于荧光显微镜下观察细胞的染色情况，并以抗体mOls作为阴性对照。
[0047]DAPI染色用以指示细胞核的存在。根据图2~图7，与纳米抗体mesnabl共孵育的人卵巢癌细胞SK-0V-3细胞被染上红色，而SK-0V-3已被证明能够高表达间皮素，表明纳米抗体mesnabl可以与人卵巢癌细胞SK-0V-3细胞表面表达的间皮素结合。作为阴性对照，抗体m01 s未检测到与间皮素的结合。
[0048]实施例5。
[0049]取SK-0V-3细胞(约I X IO6个)，与纳米抗体mesnabl在37°C孵育2小时，用PBSA、PBS分别清洗3次后加入鼠抗FLAG单克隆抗体，37°C孵育I小时；再用PBSA、PBS分别清洗3次后加入荧光二抗(Texas Red偶联的羊抗鼠IgG)，于37°C孵育Ih后，之后用PBSA、PBS分别清洗3次后于在流式细胞仪上进行分析。并以抗体mOls作为阴性对照。
[0050]如图8所示，加入纳米抗体mesnabl的SK_0V_3细胞的荧光有显著的迁移，印证了实施例4细胞免疫荧光染色的结论。同时说明纳米抗体mesnabl对高表达间皮素癌细胞具有抑制作用。
[0051]本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种抗间皮素的纳米抗体，其特征在于所述纳米抗体的氨基酸如SEQ ID N0:2所/Jn ο
2.如权利要求1所述抗间皮素的纳米抗体的编码基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述抗间皮素的纳米抗体的用途，其特征在于用抗间皮素的纳米抗体制备高表达间皮素癌细胞的探针。
4.如权利要求1所述抗间皮素的纳米抗体的用途，其特征在于用抗间皮素的纳米抗体制备抑制高表达间皮素癌细胞的·药物。
【文档编号】C07K16/28GK103819559SQ201310667427
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】龚睿, 肖庚富, 徐婷, 张哲 , 陈小波 申请人:中国科学院武汉病毒研究所