变体蔗糖转运蛋白多肽的制作方法
【专利摘要】本文描述了允许细菌在宽泛的基因表达水平和蔗糖浓度范围生长的变体蔗糖转运蛋白多肽此外，还提供了包含这些变体蔗糖转运蛋白多肽的重组细菌、以及利用该细菌来生产诸如甘油和甘油衍生产物的产物的方法。
【专利说明】变体蔗糖转运蛋白多肽
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地，提供了变体蔗糖转运蛋白多 肽（其允许细菌在宽泛的基因表达水平和蔗糖浓度的范围生长）、重组细菌（其包含这些变 体蔗糖转运蛋白多肽）和利用此类细菌来生产诸如甘油和甘油衍生产物的产物的方法。
【背景技术】
[0002] 许多在商业上有用的微生物可利用葡萄糖作为其主要碳水化合物来源。然而，所 开发的用于产生商业上所需的产物的微生物利用葡萄糖的缺点是葡萄糖的高费用。使用蔗 糖和含有蔗糖和其它糖类的混合原料作为微生物生产系统的碳水化合物来源在商业上是 可取的，因为这些材料通常易于以较低成本获得。
[0003] 当生产微生物可利用混合原料中存在的任何蔗糖时，其可更高效地发挥作用。因 而，当生产微生物不具有高效利用蔗糖作为主要碳源的能力时，它不能高效操作。例如，细 菌细胞通常显示出偏好的糖利用，以葡萄糖为最优选的。在含有的糖混合物的人造培养基 中，葡萄糖通常先于其它糖类被完全代谢。此外，许多细菌缺少利用蔗糖的能力。例如，不 到50%的大肠杆菌（Escherichia coli) (E. coli)菌株具有利用庶糖的能力。因而，当生产 微生物不能利用蔗糖作为碳水化合物来源时，希望对该微生物进行工程改造而使得其可利 用蔗糖。
[0004] 已通过整合利用蔗糖的基因来工程改造而可利用蔗糖的重组细菌己有报道。 例如，Livshits等人（美国专利6, 960, 455)描述了利用大肠杆菌菌株来产生氨基酸， 所述菌株含有编码利用蔗糖的代谢途径的基因。此外，Olson等人（Appl. Microbiol. Biotechnol. 74 :1031-1040, 2007)描述了携带负责蔗糖降解的基因的大肠杆菌菌株， 其可利用蔗糖作为碳源来产生L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。Eliot等人（美国专利申请 2011/0136190A1)描述了由蔗糖生产甘油和甘油衍生产物的重组细菌。
[0005] 然而，在基因工程改造生产微生物使得它们能够有效利用蔗糖中存在问题。具体 地，因为过量的蔗糖运输的抑制作用，蔗糖转运基因的高水平表达导致在蔗糖上生长缓慢。 另一方面，低水平的蔗糖转运也导致在蔗糖上亚最佳生长。因此，很难获得正确的蔗糖转运 蛋白基因表达水平。另外，在蔗糖转运过量的条件下（诸如高蔗糖浓度）蔗糖转运基因的 表达，甚至在低蔗糖浓度下生长不受抑制的基因表达水平可抑制生长。因此，还需要能够在 宽泛范围的蔗糖浓度的蔗糖上生长的蔗糖转运蛋白。
【发明内容】
[0006] 一个实施例提供了变体蔗糖转运蛋白多肽，基于Clustal W比对方法，所述变体蔗 糖转运蛋白多肽具有的氨基酸序列与如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列具有至少的 同一性，并且所述变体蔗糖转运蛋白多肽具有在位置300处的精氨酸至丙氨酸或精氨酸至 亮氨酸的氨基酸改变并包含：
[0007] (a)至少一种另外的氨基酸改变，所述另外的氨基酸改变选自：
[0008] (i)在位置353处的谷氨酰胺至组氨酸；
[0009] (ii)在位置61处的亮氨酸至脯氨酸；
[0010] (iii)在位置159处的苯丙氨酸至亮氨酸；
[0011] (iv)在位置162处的甘氨酸至半胱氨酸；
[0012] (v)在位置169处的脯氨酸至组氨酸；
[0013] (vi)在位置61处的亮氨酸至色氨酸；
[0014] (vii)在位置61处的亮氨酸至组氨酸；
[0015] (viii)在位置61处的亮氨酸至苯丙氨酸；和
[0016] (ix)在位置61处的亮氨酸至酪氨酸；或
[0017] (b)从N-末端起402至407个氨基酸的长度；或 ^
[0018] (c)从N-末端起402至407个氨基酸的长度，并且具有（a)的氨基酸改变中的至 少一种。 、
[0019] 另一个实施例提供了变体蔗糖转运蛋白多肽，基于Clustal W比对方法，所述变 体蔗糖转运蛋白多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID N0:68、70、72、74、76、78、80、82、84、 86、88、90、92、94、96和98的氨基酸序列具有至少95%的同一性，并且在与SEQIDN0 :26 的参照氨基酸序列进行比较时，所述变体蔗糖转运蛋白多肽包含在等同位置处的氨基酸， 所述在等同位置处的氨基酸选自：
[0020] (a)在等同于位置300的位置处的丙氨酸；和
[0021] (b)在等同于位置300的位置处的亮氨酸。
[0022] 另一个实施例提供了重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一种重组构 建体上包含：
[0023] (a)编码变体蔗糖转运蛋白多肽的核苷酸序列，基于Clustal W比对方法，所述变 体蔗糖转运蛋白多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID N0:26、68、70、72、74、76、78、80、82、 84、86、88、90、92、94、96和98的氨基酸序列具有至少95%的同一'性，并且在与SEQ ID N0 : 26的参照氨基酸序列进行比较时，所述变体蔗糖转运蛋白多肽具有在等同位置处的氨基 酸，所述在等同位置处的氣基酸选自：
[0024] (i)在等同于位置300的位置处的丙氨酸；和
[0025] ()在等同于位置300的位置处的亮氨酸；和
[0026] (b)编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列；
[0027] 其中（a)和（b)各自可操作地连接至相同的或不同的启动子，进一步地，其中所述 重组细菌能够代谢蔗糖。
[0028] 在一个实施例中，所述重组细菌产生1，3-丙二醇、甘油和/或3-羟基丙酸。
[0029]另一个实施例提供了由蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所 述方法包括：
[0030] a)在蔗糖的存在下，培养本文所公开的产生1，3-丙二醇、甘油和/或3-羟基丙酸 的重组细菌；以及
[0031] b)任选地，回收所产生的甘油、1，3_丙二醇和/或3_羟基丙酸。
[0032] 简单的序刟谥昍
[0033] 下列序列符合37C. F. R. 1· 8211. 825 ( "对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的 专利申请的要求-序列规则"），并且符合世界知识产权组织（WIPO)标准ST. 25 (2009)和 ΕΡ0和PCT的序列表要求（规则5. 2和49. 5 (a bis)，以及行政指令的208节和附录C)。用 于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C. F. R. § 1. 822所示的规定。
[0034] 表 1
[0035] 基闵和蛋白质SEQ ID N0')「总
[0036]
【权利要求】
1. 变体蔗糖转运蛋白多肽，基于Clustal W比对方法，所述变体蔗糖转运蛋白多肽具 有的氨基酸序列与如SEQ ID NO :26所示的氨基酸序列具有至少95%的同一性，并且所述 变体蔗糖转运蛋白多肽具有在位置300处的精氨酸至丙氨酸或精氨酸至亮氨酸的氨基酸 改变并包含： (a) 至少一种另外的氨基酸改变，所述另外的氨基酸改变选自： (i) 在位置353处的谷氨酰胺至组氨酸； (ii) 在位置61处的亮氨酸至脯氨酸； (iii) 在位置159处的苯丙氨酸至亮氨酸； (iv) 在位置162处的甘氨酸至半胱氨酸； (v) 在位置169处的脯氨酸至组氨酸； (vi) 在位置61处的亮氨酸至色氨酸； (vii) 在位置61处的亮氨酸至组氨酸； (viii) 在位置61处的亮氨酸至苯丙氨酸；和 (ix) 在位置61处的亮氨酸至酪氨酸；或 (b) 从N-末端起402至407个氨基酸的长度；或 (c) 从N-末端起402至407个氨基酸的长度，并且具有（a)的氨基酸改变中的至少一 种。
2. 变体蔗糖转运蛋白多肽，基于Clustal W比对方法，所述变体蔗糖转运蛋白多肽具 有的氨基酸序列与选自 SEQ ID 勵：68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96和 98的氨基酸序列具有至少95%的同一性，并且在与SEQ ID NO :26的参照氨基酸序列进行 比较时，所述变体蔗糖转运蛋白多肽包含在等同位置处的氨基酸，所述在等同位置处的氨 基酸选自： (a) 在等同于位置300的位置处的丙氨酸；和 (b) 在等同于位置300的位置处的亮氨酸。
3. 根据权利要求2所述的变体蔗糖转运蛋白多肽，其中所述变体蔗糖转运蛋白多肽还 包含： (a) 在与SEQ ID NO :26的参照氨基酸序列进行比较时，下列在等同位置处的氨基酸中 的至少一种： (i) 在等同于位置353的位置处的组氨酸； (ii) 在等同于位置61的位置处的脯氨酸； (iii) 在等同于位置159的位置处的亮氨酸； (iv) 在等同于位置162的位置处的半胱氨酸； (v) 在等同于位置169的位置处的组氨酸； (vi) 在等同于位置61的位置处的色氨酸； (vii) 在等同于位置61的位置处的组氨酸； (viii) 在等同于位置61的位置处的苯丙氨酸； (ix) 在等同于位置61的位置处的酪氨酸；和/或 (b) 在与SEQ ID N0:26的参照氨基酸序列进行比较时，在等同于位置407、406、405、 404、403或402的位置处的截短。
4. 重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一种重组构建体上包含： (a) 编码变体蔗糖转运蛋白多肽的核苷酸序列，基于Clustal W比对方法，所述变体蔗 糖转运蛋白多肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID N0:26、68、70、72、74、76、78、80、82、84、 86、88、90、92、94、96和98的氨基酸序列具有至少95%的同一性，并且在与SEQIDN0 :26 的参照氨基酸序列进行比较时，所述变体蔗糖转运蛋白多肽具有在等同位置处的氨基酸， 所述在等同位置处的氨基酸选自： (i) 在等同于位置300的位置处的丙氨酸；和 (ii) 在等同于位置300的位置处的亮氨酸；和 (b) 编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列； 其中（a)和（b)各自可操作地连接至相同的或不同的启动子，进一步地，其中所述重组 细菌能够代谢蔗糖。
5. 根据权利要求4所述的重组细菌，其中所述变体蔗糖转运蛋白多肽还包含： (a) 在与SEQ ID NO :26的参照氨基酸序列进行比较时，下列在等同位置处的氨基酸中 的至少一种： (i) 在等同于位置353的位置处的组氨酸； (ii) 在等同于位置61的位置处的脯氨酸； (iii) 在等同于位置159的位置处的亮氨酸； (iv) 在等同于位置162的位置处的半胱氨酸； (v) 在等同于位置169的位置处的组氨酸； (vi) 在等同于位置61的位置处的色氨酸； (vii) 在等同于位置61的位置处的组氨酸； (viii) 在等同于位置61的位置处的苯丙氨酸； (ix) 在等同于位置61的位置处的酪氨酸；和/或 (b) 在与SEQ ID N0:26的参照氨基酸序列进行比较时，在等同于位置407、406、405、 404、403或402的位置处的截短。
6. 根据权利要求4所述的重组细菌，其中所述具有蔗糖水解酶活性的多肽归类为 EC3. 2. 1. 26 或 EC2. 4. 1. 7。
7. 根据权利要求4所述的重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一种重组构 建体上还包含编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。
8. 根据权利要求7所述的重组细菌，其中所述具有果糖激酶活性的多肽归类为 EC2. 7. 1. 4、EC2. 7. 1. 3 或 EC2. 7. 1. 1。
9. 根据权利要求4所述的重组细菌，其中所述细菌选自下列属：埃希氏菌属 (Escherichia)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、朽 1檬酸杆菌属（Citrobacter)和气杆菌属 (Aerobacter)〇
10. 根据权利要求9所述的重组细菌，其中所述细菌为大肠杆菌（Escherichia coli)。
11. 根据权利要求4所述的重组细菌，其中所述重组细菌产生1，3-丙二醇、甘油和/或 3_羟基丙酸。
12. 由蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所述方法包括： a)在蔗糖存在下培养权利要求11所述的重组细菌；以及 b)任选地，回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。
【文档编号】C07K14/195GK104245723SQ201380012343
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年3月5日 优先权日:2012年3月5日
【发明者】M. W. 波拉克 D., K. 范德克 T. 申请人:纳幕尔杜邦公司