用于纯化重组因子Xa衍生物的方法

用于纯化重组因子Xa衍生物的方法
【专利摘要】本文中公开了用于纯化丝氨酸蛋白酶的方法和试剂盒。所述方法需要将所述丝氨酸蛋白酶装载到基于大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的亲和力色谱仪，并且利用包含能破坏所述STI与所述丝氨酸蛋白酶之间的相互作用的试剂的洗脱缓冲液来洗脱所述丝氨酸蛋白酶。
【专利说明】用于纯化重组因子Xa衍生物的方法
[0001] 相关申请的交叉参考 本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2012年6月14日提交的美国临时申请序列号 61/659,821的权益，该临时申请的内容以全文引用的方式并入本公开中。
[0002] 背景 抗凝血剂满足了市场上在治疗或预防倾向于形成血液凝块的患者（举例来说，诸如具 有凝血障碍、长期不能移动或正进行医疗手术的那些患者）的不希望有的血栓形成时的需 求。然而，抗凝疗法的主要局限性之一是与治疗相关的出血风险，而且在用药过量的情况下 或在需要进行紧急手术程序时在快速逆转抗凝血剂活性的能力方面存在诸多局限性。因 而，针对所有抗凝疗法形式的特效解毒剂是非常合乎需要的。出于安全考虑，在新型抗凝血 药的开发中得到抗凝血剂-解毒剂配对也是有利的。
[0003] 先前报告的因子Xa (fXa)蛋白的经修饰衍生物可用作靶向fXa的抗凝血剂的解 毒剂，诸如美国专利号8, 153, 390和8, 268, 783中所描述的那些。fXa蛋白的经修饰衍生 物能结合和/或基本上中和抗凝血剂。然而，引入至这些fXa衍生物中的某些修饰对纯化 提出了若干项挑战，这是因为用于纯化凝结因子的常规方法不能有效地用于这些经修饰的 fXa蛋白。
[0004] 概要 本文中公开了用于纯化丝氨酸蛋白酶的方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述方法 需要将丝氨酸蛋白酶装载到基于大豆胰蛋白酶抑制剂（STI)的亲和力色谱仪，诸如树脂或 柱，并且用洗脱缓冲液来洗脱多肽。在一些实施方案中，所述洗脱缓冲液包含诸如竞争剂等 能破坏STI与丝氨酸蛋白酶之间的相互作用的试剂。在一些实施方案中，所述洗脱缓冲液 还包含盐和/或清洁剂。
[0005] 在一个实施方案中，提供了一种纯化丝氨酸蛋白酶的方法，该方法包括将丝氨酸 蛋白酶装载到基于大豆胰蛋白酶抑制剂（STI)的亲和力色谱仪，和用包含能破坏STI与丝 氨酸蛋白酶之间的相互作用的试剂的洗脱缓冲液来洗脱丝氨酸蛋白酶。
[0006] 在一些方面，所述洗脱缓冲液还包含盐、清洁剂和/或离液剂。
[0007] 在一些方面，所述试剂是竞争剂，所述竞争剂可以选自苯甲脒、对氨基苯甲脒、精 氨酸、小分子fXa抑制剂、肽类fXa抑制剂和肽模拟物类fXa抑制剂。在一些方面，所述竞 争剂是精氨酸。
[0008] 在一些方面，丝氨酸蛋白酶是包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的多肽，或与 SEQ ID NO: 1或2具有至少约80%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位点上具 有突变的多肽。
[0009] 在一些方面，丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 2 具有至少约95%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位点上具有突变的多肽。在 一些方面，所述丝氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
[0010] 在一些方面，所述洗脱缓冲液的pH值为约4. 5至约10. 5。在一些方面，所述洗脱 缓冲液的pH值为约5. 0。在一些方面，所述洗脱缓冲液的pH值为约7. 4。
[0011] 在一些方面，所述洗脱缓冲液包含约250 mM精氨酸至约1000 mM精氨酸。在一些 方面，所述洗脱缓冲液包含约500 mM精氨酸。在一些方面，所述洗脱缓冲液的pH值为约 5. 0〇
[0012] 在一些方面，所述方法进一步包括用离子交换柱对经过洗脱的丝氨酸蛋白酶进行 纯化。
[0013] 还提供了利用本公开的方法制备的经过纯化的丝氨酸蛋白酶。
[0014] 在一个实施方案中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括基于大豆胰蛋白酶抑制剂 (STI)的亲和力色谱仪，和包含能破坏STI与丝氨酸蛋白酶之间的相互作用的竞争剂的洗 脱缓冲液。
[0015] 在一些方面，所述洗脱缓冲液还包含精氨酸。在一些方面，所述洗脱缓冲液的pH 值为约4. 5至约10. 5。在一些方面，所述洗脱缓冲液包含约250 mM精氨酸至约1000 mM精 氨酸。在一些方面，所述试剂盒还包含洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液包含约250 mM处于中 性pH值下的NaCl。
[0016] 附图简述 图1示出了在氨基酸106-111处具有连接子-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)的SEQ ID NO: 1，即一种fXa衍生物（也称为r-解毒剂前体）。
[0017] 图2示出了从所述r-解毒剂前体去除了所述连接子的SEQ ID NO: 2,即一种fXa 衍生物（也称为r-解毒剂）。
[0018] 图3示出了如实施例1中所描述在苯甲脒-琼脂糖亲和树脂上使用经过纯化的 r-解毒剂的负载曲线。
[0019] 图4示出了如实施例1中所描述在L-赖氨酸-琼脂糖亲和树脂上使用经过纯化 的r-解毒剂的负载曲线。
[0020] 图5示出了如实施例1中所描述在抑肽酶-琼脂糖亲和树脂上使用经过纯化的 r-解毒剂的负载曲线。
[0021] 图6示出了如实施例1中所描述在STI-琼脂糖亲和树脂上使用经过纯化的r-解 毒剂的负载曲线。
[0022] 图7示出了使用从细胞培养物收集的条件培养基（所收集的细胞培养液）时的 STI-琼脂糖负载曲线，表明功能蛋白被STI树脂俘获（如实施例2中所描述）。
[0023] 图8示出了如实施例2中所描述在HQ-琼脂糖前置柱上（以流过模式）使用所收 集的细胞培养液的负载曲线。
[0024] 图9示出了被装载到STI-琼脂糖的HQ-琼脂糖FT级分的负载曲线，其表明功能 蛋白被STI-树脂俘获。
[0025] 图10A-B示出了如实施例2中所描述用I M苯甲脒洗脱结合的蛋白质。将使用1 M苯甲脒的洗脱曲线示于图IOA中，并且将对经STI洗脱并汇集的级分进行的西方印迹分析 (Western blot)结果示于图IOB中。分子标记被装载到图IOB的第1道和第IA道中；FXa 被装载到第2道和第2B道中；并且从STI-琼脂糖柱洗脱的r-解毒剂被装载到第4道和第 4B道中。
[0026] 图11示出了如实施例2中所描述在苯甲脒梯度下的洗脱曲线。
[0027] 图12示出了在实施例2中所描述的按比例放大的程序的洗脱曲线。
[0028] 图13示出了针对25 L培养基的r-解毒剂纯化方案（波状袋）。UF =超滤；MWCO =分子量截止值；UF/DF =超滤/透滤。
[0029] 图14绘示了如实施例2中所描述对经过纯化的r-解毒剂的SDS-PAGE分析结果。
[0030] 图15示出了如实施例3中所描述使用精氨酸洗脱缓冲液的STI亲和柱的洗脱曲 线。
[0031] 图16绘示了如实施例3中所描述利用来自于具有不同的STI树脂（A-E)的各种 STI亲和柱的负载洗脱剂的还原银染凝胶分析结果。利用精氨酸缓冲液洗脱产生了与利用 苯甲脒洗脱类似的产物分布。
[0032] 详细描述 定义 除非另有指示，否则本公开的实践将采用属于本领域技能范围内的常规组织培养、免 疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA技术。参见例如Sambrook等，（1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 版；Ausubel 等编，（1987) Current Protocols In Molecular Biology ;MacPherson, B.D. Hames和G.R. Taylor编，（1995) PCR 2: A Practical Approach ;Harlow 和 Lane 编，(1988) Antibodies, A Laboratory Manual ;Harlow 和 Lane 编，(1999) Using Antibodies, a Laboratory Manual ;和 R. I. Freshney 编，（1987) Animal Cell Culture。
[0033] 如本文中所使用，术语"约" 一般意指所述值加上或减去该值的10%的范围。
[0034] 如本说明书和权利要求书中所使用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式"一 (种）"、"一个"和"所述"包括复数个引用对象。
[0035] 术语"蛋白质"、"肽"和"多肽"可互换使用且在其最广泛意义上是指具有两个或更 多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。所述亚单位可通过肽键连接。在 另一个实施方案中，所述亚单位可通过其它键，例如酯、醚等连接。蛋白质或肽必须含有至 少两个氨基酸，且对蛋白质或肽序列中可包含的氨基酸的最大数目并无限制。如本文中所 使用，术语"氨基酸"是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D与L光 学异构体两者、氨基酸类似物和肽模拟物。"肽模拟物"是旨在模拟肽的小蛋白质样链。其 可由修饰现有的肽，或通过设计能模拟肽的类似系统（诸如类肽和￠-肽）来制得。
[0036] 如本文中关于诸如DNA或RNA等核酸使用的术语"分离"或"重组"是指与其它DNA 或RNA分离的分子。术语"分离"在本文中还用于指与其它细胞蛋白质分离的多核苷酸、多 肽和蛋白质且意在涵盖经过纯化的和重组的多肽。举例来说，分离的细胞是与具有不相似 的表型或基因型的组织或细胞分离的细胞。分离的多核苷酸是与其在其原生或天然环境中 (例如，在染色体上）在正常情况下所缔合的3'和5'连续核苷酸分离。如本领域技术人员 所了解，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要"分离"以将其与其 天然存在的对应物相区别。
[0037] 术语蛋白质、肽或多核苷酸的"生物学等效物"是指具有至少约80%同源性或序列 同一性，且可选地至少约85%、或可选地至少约90%、或可选地至少约95%、或可选地98%同源 性或序列同一性，并且展现与参考蛋白质、多肽或核酸基本上等同的生物活性的蛋白质、肽 或多核苷酸。
[0038] "杂交"是指可在不同"严格度"的条件下进行的杂交反应。增加杂交反应的严格 度的条件在本领域中是众所周知的并且已经公布：参见例如Sambrook等，见下文。相关 条件的例子包括（按照严格度增加的顺序）：孵育温度25°C、37°C、50°C和68°C ;缓冲液浓 度 10XSSC、6XSSC、1XSSC、0. IXSSC (其中 SSC 是 0? 15 M NaCl 和 15 mM 柠檬酸盐缓冲液） 以及其使用其它缓冲液系统的等效物；甲酰胺浓度〇%、25%、50%和75% ;孵育时间5分钟至 24小时，和持续时间增加、频率增加或缓冲液浓度降低的洗涤。
[0039] 与另一个序列具有某一百分比（例如，80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%)的"序列 同一性"的多核苷酸或多核苷酸区（或多肽或多肽区）意指在比较两个序列的过程中，当对 准时，该百分比的碱基（或氨基酸）是相同的。比对和百分比同源性或序列同一性可使用本 领域中已知的软件程序来测定，例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等编，1987)增刊30,章节7. 7. 18,表7. 7. I中所描述的软件程序。优选地，使用缺省参数 进行比对。优选比对程序是BLAST，使用缺省参数。确切地说，优选程序是BLASTN和BLASTP， 使用以下缺省参数：遗传密码=标准；过滤器=无；股=两股；截止值=60 ;期望值=10 ;基 质=BL0SUM62 ;描述=50个序列；排序方式=得分高低；数据库=非冗余GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 翻译 + SwissProtein + SPupdate + PIR。这些程序的细节 可见于以下互联网地址：ncbi. nlm. nih. gov/cgi-bin/BLAST。
[0040] "同源性"或"同一性"或"相似性"是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相 似性。同源性可以通过对可能出于比较目的而被对准的各序列中的位置进行比较来确定。 当被比较的序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置处是同源的。序列 之间的同源性程度随所述序列所共有的匹配位置或同源位置的数目而变化。举例来说，"非 相关"或"非同源"序列与本公开的序列之一共有小于40%的同一'丨生，或可选地小于25%的 同一I"生。
[0041] 术语"级分"当被用于蛋白质分离的情形下时是指基于特定性质分离的材料集合。 所述特定性质可以包括（但不限于）尺寸、质量、等电点、电荷等等。
[0042] "因子Xa"或"fXa"或"fXa蛋白"是指血液凝聚路径中的丝氨酸蛋白酶，其是由 非活性因子X (fX)产生。因子Xa被因子IXa与其辅因子因子VIIIa的复合物（称为内在 Xase)或因子Vila与其辅因子组织因子的复合物（称为外在Xase)激活。fXa与因子Va 形成膜结合凝血酶原酶复合物，并且是凝血酶原酶复合物中能催化凝血酶原转化成凝血酶 的活性组分。凝血酶是能催化纤维蛋白原转化成纤维蛋白的酶，其最终导致血液凝块形成。
[0043] 如本文中所使用，"fXa衍生物"是指在组装至凝血酶原酶复合物中的方面不与fXa 竞争，但结合和/或基本上中和诸如fXa抑制剂等抗凝血剂的经过修饰的fXa蛋白。在一 些实施方案中，fXa衍生物具有降低的促凝血活性或不具有促凝血活性。fXa衍生物的一个 例子在本文中被提供为SEQ ID NO: 2 (图2)或其生物等效形式。
[0044] 术语"活性位点"是指酶或抗体中发生化学反应的部分。"经过修饰的活性位点"是 在结构上经过修饰以提供具有增加或降低的化学反应性或特异性的活性位点的活性位点。 活性位点的例子包括但不限于人类因子X的包含235-488个氨基酸残基的催化域和人类因 子Xa的包含fXa的195-448个氨基酸残基的催化域。经过修饰的活性位点的例子包括但 不限于人类因子Xa的在位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414或Arg424处具有至 少一个氨基酸取代的催化域。
[0045] 如上文所述，本发明的衍生物可具有经过修饰的Gla域或被去除了整个Gla域。 fXa的Gla域是指野生型fXa蛋白的氨基酸残基1-45。在一些实施方案中，所述衍生物完 全（1-45)或部分缺失Gla域（例如1-44、1-39或6-39)。
[0046] "r-解毒剂前体"是指由SEQ ID NO: 1表示的fXa衍生物，其相对于人类野生型 fXa含有三个突变。第一个突变是缺失野生型fX蛋白在位置6-39处的Gla域。第二个突 变是用-RKR-置换活化肽序列氨基酸143-194。这就产生了连接轻链和重链的-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)连接子。在分泌后，这个连接子在CHO中被裂解，产生裂解的双链多肽。术 语"裂解的双链多肽"是指SEQ ID NO: 2的多肽，或与SEQ ID NO: 2具有80%同一性、具 有两条链并且通过二硫键连接在一起的多肽。N末端链由SEQ ID NO: 2的氨基酸1-105组 成，且C末端链由SEQ ID NO: 2的氨基酸106-359组成。任选地，LC链可含有所述连接子 的1、2、3、4、5或6个氨基酸残基。这样的附加残基由不完全去除连接子多肽产生。第三个 突变是活性位点残基S379突变成Ala残基（氨基酸编号是基于分泌的人类fX序列）。这 个氨基酸取代分别对应于SEQ ID NO: 1和2的氨基酸296和290。
[0047] 术语"r-解毒剂"可以是指去除所述连接子之前的多肽（SEQ ID NO: 1)或去除连 接子之后的多肽（SEQ ID NO: 2)。以全文引用的方式并入本文中的美国申请13/766, 652 描述了用于对单链r-解毒剂前体进行改良型或增强型加工以使充当针对fXa抑制剂的解 毒剂的双链r-解毒剂蛋白裂解的方法和细胞。
[0048] "STI"或"大豆胰蛋白酶抑制剂"是指从大豆分离的胰蛋白酶抑制剂或其生物等效 物。胰蛋白酶抑制剂的大小为约20 kDa，并且能降低胰蛋白酶（一种蛋白水解酶）以及血浆 激肽释放酶、因子Xa和纤溶酶活性。STI可购自诸如Life Technologies (Grand Island, NY)等供应商。STI的一个例子是得自于毛豆（大豆）的GenBank登录号为NP_001238611 的KTI3 Kunitz胰蛋白酶抑制剂。
[0049] 术语"竞争剂"是可通过破环STI与丝氨酸蛋白酶之间的电荷-电荷相互作用或 通过与STI竞争结合于丝氨酸蛋白酶来帮助从STI亲和柱洗脱丝氨酸蛋白酶的分子。非限 制性例子包括苯甲脒、对氨基苯甲脒、精氨酸、小分子fXa抑制剂、肽类fXa抑制剂和肽模拟 物类fXa抑制剂。
[0050] 术语"因子Xa抑制剂"或"因子Xa的抑制剂"是指能在体外和/或体内直接或 间接地抑制凝血因子Xa催化凝血酶原转化成凝血酶的活性的化合物、肽、肽模拟物。已知 fXa抑制剂的例子包括但不限于磺达肝癸（fondaparinux)、艾卓肝素（idraparinux)、经过 生物素标记的艾卓肝素、依诺肝素（enoxaparin)、法安明（fragmin)、NAP-5、rNAPc2、组织 因子路径抑制剂、DX_9065a (例如，如 Herbert, J.M.等，//7Aazmaco/ /-- 1996 276 (3) :1030-8 中所描述）、YM-60828 (例如，如Taniuchi, Y?等，VaewoW. 1998 79(3):543-8 中所描述）、YM-150 (例如，如 Eriksson, B.I?等，财 oot/ 2005;106(11)， Abstract 1865 中所描述）、阿哌沙班（apixaban)、利伐沙班（rivaroxaban)、^)-348292 (例如，如Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007 中所描述）、奥米沙班（otamixaban)、雷扎沙班（razaxaban) (DPC906)、BAY 59-7939 (例如，如 Turpie, A. G?等，7； ?你 ewost 2005，3 (11) :2479-86 中所 描述）、DU-176b (例如，如 Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 2007 8(9) :778-783 中所 描述）、LY517717 (例如，如 Agnelli, G?等，7； VaewoW. 2007 5(4):746-53 中所描述）、GSK913893、贝曲西班（betrixaban)(如下文所描述）以及其衍生物。低分子 量肝素（"LMWH"）也被视为因子Xa抑制剂。
[0051] 术语"离液剂"意指能破坏诸如蛋白质和核酸等大分子的结构并且使其变性的物 质。离液剂包括例如丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫 脲和尿素。
[0052] 方法 本公开描述了用于对来自于含丝氨酸蛋白酶的样品的呈活性形式的丝氨酸蛋白酶进 行纯化的方法。这些方法优于常规的丝氨酸蛋白酶纯化方法。此外,所述方法在对甚至经 过修饰的丝氨酸蛋白酶进行纯化时也是有效的，所述修饰，诸如与野生型fXa相比在r-解 毒剂中的那些修饰，能影响蛋白酶的结合和/或酶促活性。
[0053] 已经证明，因子Xa和其它丝氨酸蛋白酶可使用苯甲脒-琼脂糖亲和色谱仪进行纯 化。初步测试（参见例如实施例1)指示，缺乏Gla域的某些fXa衍生物由于缺失Gla域而 对诸如Q-琼脂糖等常规离子交换色谱仪具有低亲和力。令人惊讶的是，r-解毒剂不能结 合于苯甲脒-琼脂糖亲和色谱仪，或其它类似的市售小配体亲和色谱仪。本公开描述了使 用基于STI的亲和色谱仪纯化丝氨酸蛋白酶，和利用竞争剂和任选地存在的盐和清洁剂的 洗脱步骤。
[0054] 可以如先前所描述（例如在13/766, 652中）或利用本领域中已知的其它重组蛋 白质产生方法来重组产生丝氨酸蛋白酶。举例来说，可将蛋白质克隆到DNA构筑体（即质 粒、病毒载体、粘粒、表达载体、噬菌粒、福斯质粒和人工染色体，诸如细菌人工染色体、酵母 人工染色体和人类人工染色体）中，并且通过诸如基于化学的转染（诸如磷酸钙转染和 多聚转染）和非基于化学的转染（诸如电穿孔、光学转染和基因电转移）等基因转移技术 引入合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，包括但不限于细菌 细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、绵羊细胞、猿细 胞和人类细胞。接着可通过诸如超声处理或冻融等物理技术或通过使用诸如含有150 mM NaCl、1.0% IGEPAL? CA - 630、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS 和 50 mM Tris 的 RIPA 缓冲液 (Radi-免疫沉淀测定）（pH 8. 0)等清洁剂或溶解缓冲液，或通过物理分离（诸如离心或过 滤）来溶解细胞，以便从哺乳动物细胞培养物中收集澄清培养液。然后可将所得可溶性蛋 白质提取物用于本文中所描述的纯化方法中。
[0055] 将蛋白质提取物施加于基于大豆胰蛋白酶抑制剂（STI)的亲和色谱仪。大豆胰 蛋白酶抑制剂是20 kDa蛋白质，并且可以被固定在固体载体树脂上以用于纯化某些蛋白 质。除了大豆胰蛋白酶抑制剂以外，还可以使用其它胰蛋白酶抑制剂蛋白质，诸如从血清、 利马豆、牛胰腺或卵类粘蛋白或其经修饰形式中分离的那些胰蛋白酶抑制剂蛋白质。还预 期某些蛋白酶抑制剂，确切地说是丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以用于制备亲和树脂，以便纯化 r_解毒剂、丝氨酸蛋白酶或其它因子Xa衍生物。可以利用本文中所公开的方法从这些蛋白 酶抑制剂中鉴别出合适的。
[0056] 然后可以用包含竞争剂、盐、清洁剂或离液剂的洗脱缓冲液来洗脱丝氨酸蛋白 酶。竞争剂中断STI与丝氨酸蛋白酶之间的相互作用或通过与STI竞争结合于丝氨酸蛋 白酶来实现。竞争剂的非限制性例子包括苯甲脒、精氨酸、小分子fXa抑制剂、肽类fXa 抑制剂或肽模拟物类fXa抑制剂。直接因子Xa抑制剂包括NAP-5、rNAPc2、组织因子路 径抑制剂、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、TAK-442、PD-348292、奥米 沙班、依杜沙班（edoxaban)、LY517717、GSK913893、雷扎沙班、贝曲西班或其药学上可接 受的盐以及其组合。肽类fXa抑制剂包括如Betz等，"Inhibition of Factor Xa by a Peptidyl-a-ketothiazole Involves Two Steps. Evidence for a Stabilizing Conformational Change"，Biochemistry (1999)，38，14582-14591 中所描述的三肤酮 噻唑和相应的醛，该文献出于所有目的以引用的方式并入。
[0057] 在一个实施方案中，竞争剂是精氨酸。用精氨酸洗脱是有利的，因为它是GRAS ( - 般认为是安全的）赋形剂，并且不需要从经过纯化的蛋白质中去除。精氨酸的另一个益处 是它实际上提高了丝氨酸蛋白酶（例如，r-解毒剂）的溶解度，并且可以被用作最终制剂 中的赋形剂。
[0058] 洗脱缓冲液中所采用的精氨酸或竞争剂的浓度可为约250 mM至约1000 mM。在一 个实施方案中，洗脱缓冲液中的精氨酸或竞争剂的浓度为约500 mM。在其它实施方案中， 所述浓度为约250 mM、或约300 mM、或约350 mM、或约400 mM、或约450 mM、或约550 mM、 或约600 mM、或约650 mM、或约700 mM、或约750 mM、或约800 mM、或约850 mM、或约900 mM、或约I M。所述洗脱缓冲液任选地还包含盐、清洁剂或离液剂。可用于本文中所公开的 方法和试剂盒的洗脱缓冲液中的盐包括氯化钠、氯化铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、氯化钾、氯化 镁、氯化钙、磷酸钠、磷酸钙、磷酸铵、磷酸镁、磷酸钾、硫酸钠、硫酸铵、硫酸钾、硫酸镁、硫酸 钙等等。可用于本文中所公开的方法和试剂盒的洗脱缓冲液中的清洁剂包括例如聚山梨醇 醋80、尿素、狐等等。
[0059] 本文中所描述的方法和试剂盒中的洗脱缓冲液的pH值是允许有效洗脱吸附在树 脂上的丝氨酸蛋白酶蛋白而不造成丝氨酸蛋白酶失活和/或沉淀的pH值。某些fXa衍生 物，诸如r-解毒剂，在低pH值下会失活或沉淀。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的pH值为 约4. 5至约10. 5。在另一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH值为约pH 5.0。在另一个实施方 案中，洗脱缓冲液的pH值为约pH 7.4。可选地，洗脱缓冲液的pH值为至少约4. 5、约5. 5、 约6、约6. 5、约7、约7. 5、约8. 0、约8. 5、约9、约9. 5或至少约10。在另一个实施方案中， 洗脱缓冲液的pH值不高于约5. 5、约6、约6. 5、约7、约7. 5、约8. 0、约8. 5、约9、约9. 5、约 10或不高于约10. 5。在一个实施方案中，洗脱缓冲液的pH值当使用苯甲脒作为竞争剂时 为约7. 4且当使用精氨酸作为竞争剂时为pH 5. 0。
[0060] 在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶是fXa衍生物，举例来说，其为包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的多肽，或与SEQ ID NO: 1或2具有至少约80%、85%、90%、95%、98%或 99%序列同一性的多肽。在一些实施方案中，与SEQ ID NO: 1或2具有序列同一性的多肽 具有基本上与SEQ ID NO: 1或2相同的活性。由SEQ ID NO: 1表示的fXa衍生物相对 于fXa含有三个突变。第一个突变是缺失野生型蛋白质中FX在位置6-39处的Gla域。第 二个突变用-RKR-置换活化肽序列143-194 aa。这就产生了连接轻链和重链的-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)连接子。在分泌后，这个连接子在CHO中被裂解，产生双链fXa分子（SEQ ID NO: 2)。第三个突变是活性位点残基S379突变成Ala残基（基于分泌的人类fX氨基 酸序列）。这个氨基酸取代分别对应于SEQ ID NO: 1和2的位置296和位置290处的氨基 酸。fXa衍生物在组装至凝血酶原酶复合物中的方面不与fXa竞争，而是结合和/或基本上 中和诸如fXa抑制剂等抗凝血剂。可用作解毒剂的衍生物经过修饰以减少或去除内在促凝 血和抗凝血活性，同时保留结合抑制剂的能力。在结构上，所述衍生物经过修饰以便无促凝 血活性或降低促凝血活性。"促凝血活性"在本文中称为药剂引起血液凝固或形成凝块的能 力。降低的促凝血活性意指促凝血活性与野生型fXa相比降低了至少约50%或约90%以上 或约95%以上。在一个相关实施方案中，与SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基 酸序列与野生型因子Xa相比具有降低的促凝血活性。在另一个实施方案中，与SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基酸序列不组装至凝血酶原酶复合物中。
[0061] 在一个实施方案中，可以在允许丝氨酸蛋白酶吸附至柱上的条件下将丝氨酸蛋白 酶添加（装载）至柱上，并且可以用允许丝氨酸蛋白酶继续吸附至柱上且污染流经物中的 蛋白质或分子的洗涤缓冲液对柱进行洗涤。在一个实施方案中，洗涤缓冲液可以包含盐并 且处于中性pH值下。术语"中性pH值"意在指约6至约8的pH值。在某些实施方案中， 洗涤缓冲液包含约200至约500 mM处于中性pH值下的NaCl。在其它实施方案中，pH值为 约6或约7或约8。
[0062] 本文中所公开的方法还可以包括其它纯化和色谱步骤，举例来说，诸如过滤、离子 交换色谱、混合模式树脂、排阻色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱法或等电点聚焦。在 一个实施方案中，所述方法还包括将含有所述多肽的溶液施加于离子交换柱。
[0063] 合适的阳离子交换树脂包括本领域中已知的多种材料，包括能够在较宽pH值范 围内结合多肽的那些材料。举例来说，羧甲基化的、磺化的、琼脂糖基的或聚合的聚苯乙烯/ 二乙烯基苯阳离子交换基质是特别优选的。其它可用基质材料包括但不限于纤维素基质， 诸如纤维状、微粒状和珠粒状基质；右旋糖酐、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅和 聚醚基质；和复合物。其它适合用于阳离子交换色谱的材料在本领域技术人员的知识范围 内。
[0064] 阴离子交换色谱是使用如本领域中已知的对其适当的介质来进行。合适的介质 包括例如聚合的聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂和琼脂糖基的树脂，以及琼脂糖珠粒、右旋糖 酐珠粒、聚苯乙烯珠粒、包含经衍生化而具有叔氨基或季氨基的不溶性颗粒状载体和经 衍生化而具有三甲基氨基乙基的载体的介质。合适的这样的介质的例子包括DE92 (二 乙基氛基乙基纤维素，Whatman) ;DEAE 纤维素（Sigma)、BAKERB0ND ABX 40 mu (J. T. Baker, Inc.) ;DEAE 树脂，诸如 FRACTOGEL EMD DEAE-650 (EM Separations)、FRACT0GEL EMDTMAE-650 (S)TM (EM Science， Gibbstown，NJ)、 TSK 凝胶 DEAE-SPW (Tosohaas)、 DEAE-SEPHAROSE CL-6BT" 和螯合 SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech AB)、DEAE MERE SEP. I000TM ( Millipore)和 DEAE SPHERODEX (S印racor) !RESOURCE QTm 和 Q SEPHAROSE (QSFF) (Amersham Pharmacia Biotech AB) ；MACR〇-PEP QTM (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA) ；Q-HYPERD (BioSepra, Inc. ,Marlborough,Mass);等等。其 它合适的阴离子交换色谱材料以及用于本申请的这些材料的选择和使用在本领域中是常 规的。
[0065] 可以在STI亲和色谱法之前或之后进行离子交换色谱、过滤、纳米过滤或附加纯 化步骤。附加步骤还可以包括通过例如对蛋白质提取物进行溶剂和清洁剂处理或通过纳米 过滤进行病毒灭活步骤。
[0066] 一般来说，"纯化"是指增加蛋白质或肽在样品中的浓度和/或纯度。在一些实施 方案中，纯化过程对样品进行分馏以去除各种其它组分，在此期间蛋白质或肽基本上保持 其生物活性。组合物中经过充分纯化的蛋白质或肽形成了该组合物的主要组分，诸如构成 样品溶液的干组分中的蛋白质的至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约 90%、至少约95%或以上。
[0067] 本领域技术人员根据本公开将会获知用于对蛋白质或肽的纯化程度进行定量的 各种方法。这些方法包括例如测定活性级分的比活性或通过SDS/PAGE分析来估计级分内 的多肽的量。用于估计级分的纯度的一种优选方法是计算该级分的比活性，将它与初步提 取物的比活性相比较并且由此计算纯度程度，在本文中通过"纯化倍数"来估计。用于表示 活性的量的实际单位当然将取决于用于追踪纯化和所表达的蛋白质或肽是否展现可检测 活性的所选特定测定技术。
[0068] 适用于蛋白质纯化的各种技术对于本领域技术人员将为熟知的。这些技术包括例 如与硫酸铵、PEG (聚乙二醇）、抗体等等一起沉淀或利用热变性，随后离心；色谱步骤，诸 如离子交换、凝胶过滤、逆相、羟基磷灰石和亲和色谱；等电点聚焦；凝胶电泳；和这些与其 它技术的组合。
[0069] 本文中所公开的另一个方面涉及一种经过纯化的丝氨酸蛋白酶，其包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1或2具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、 至少约95%、至少约97%、至少约98%或至少约99%序列同一性的多肽，其中所述多肽是通过 本文中所描述的方法产生。在一些实施方案中，与SEQ ID NO: 1或2具有序列同一'丨生的多 肽具有基本上与SEQ ID NO: 1或2相同的活性。
[0070] 本申请还描述了一种试剂盒，其包含大豆胰蛋白酶抑制剂亲和树脂；包含竞争剂 和/或精氨酸的洗脱缓冲液；和使用说明。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤缓冲 液。在一个相关实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约250 mM处于中性pH值下的NaCl。
[0071] 实验实施例 参考以下实施例进一步了解本公开，所述实施例意在单纯地例示本公开。本公开在范 围方面不受所例示的实施方案限制，所述实施方案仅意在说明本公开的单一方面。功能上 等效的任何方法都在本公开的范围之内。根据以上描述和附图，除了本文中所描述以外对 本公开的各种修改将变得为本领域技术人员所显而易见。所述修改属于所附权利要求书的 范围内。
[0072] 除非另有说明，否则所有温度都是以摄氏度表示。还有，在这些实施例和其它部分 中，缩写具有以下含义：
【权利要求】
1. 一种纯化丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括： 将所述丝氨酸蛋白酶装载到基于大豆胰蛋白酶抑制剂（STI)的亲和力色谱仪，和 利用包含能破坏所述STI与所述丝氨酸蛋白酶之间的相互作用的试剂的洗脱缓冲液 来洗脱所述丝氨酸蛋白酶。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述洗脱缓冲液还包含盐、清洁剂和/或离液剂。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述药剂是能竞争性地结合所述丝氨酸蛋白酶 的STI的竞争剂。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述竞争剂选自苯甲脒、对氨基苯甲脒、精氨酸、小 分子fXa抑制剂、肽类fXa抑制剂和肽模拟物类fXa抑制剂。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述竞争剂是精氨酸。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是包含SEQIDNO: 1或2的氨 基酸序列的多肽，或与SEQIDNO: 1或2具有至少约80%序列同一性、缺失至少一部分Gla 域且在活性位点上具有突变的多肽。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶包含SEQIDNO: 2的氨基酸序 列，或与SEQIDNO: 2具有至少约95%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位点 上具有突变的多肽。
8. 如权利要求6所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶包含SEQIDNO: 2的氨基酸序 列。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH值为约4. 5至约 10. 5。
10. 如权利要求9所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH值为约5. 0。
11. 如权利要求9所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH值为约7. 4。
12. 如权利要求5所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约250mM精氨酸至约1000mM 精氨酸。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包含约500mM精氨酸。
14. 如权利要求13所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH值为约5. 0。
15. 如权利要求1至14中任一项所述的方法，其还包括利用离子交换柱对所述经过洗 脱的丝氨酸蛋白酶进行纯化。
16. 如权利要求1至15中任一项所述的方法，其还包括在洗脱所述丝氨酸蛋白酶之前， 用包含盐且处于中性pH值下的洗涤缓冲液来洗涤所述色谱仪。
17. -种经过纯化的丝氨酸蛋白酶，其是由如权利要求1至16中任一项所述的方法制 备。
18. -种试剂盒，其包括： 基于大豆胰蛋白酶抑制剂（STI)的亲和力色谱仪，和 包含能破坏所述STI与丝氨酸蛋白酶之间的相互作用的竞争剂的洗脱缓冲液。
19. 如权利要求18所述的试剂盒，其中所述洗脱缓冲液还包含精氨酸。
20. 如权利要求18所述的试剂盒，其中所述洗脱缓冲液的pH值为约4. 5至约10. 5。
21. 如权利要求19所述的试剂盒，其中所述洗脱缓冲液包含约250mM精氨酸至约1000 mM精氨酸。
22.如权利要求18至21中任一项所述的试剂盒，其还包含洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲 液包含处于中性pH值下的约250mMNaCl。
【文档编号】C07K1/22GK104379594SQ201380033420
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年6月12日 优先权日:2012年6月14日
【发明者】卢根民, 乌马·辛哈 申请人:博尔托拉制药公司