兰州大尾羊pparg基因的克隆和原核表达载体的构建方法
【专利摘要】本发明通过设计克隆PPARG基因全长cDNA的PCR引物，通过RACE技术，从绵羊尾部脂肪组织克隆绵羊PPARG基因全长cDNA，确定绵羊PPARG基因编码区cDNA序列。将目的基因定向克隆于pET32a原核表达载体中，获得pET32a（+）-PPARG重组原核表达载体，诱导表达重组PPARG蛋白。本发明生产的重组PPARG蛋白，用于绵羊前体脂肪细胞的诱导分化，为兰州大尾羊等地方绵羊遗传资源的保护和肉羊育种中优良性状的利用提供参考，具有重要的实践价值。
【专利说明】兰州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一种兰州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表达载体的构建方法。
【背景技术】
[0002]过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activatedreceptor, PPAR)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，主要表达于免疫系统和脂肪组织，是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物作用的靶分子，与机体免疫、胰岛素抵抗、脂肪细胞分化关系密切。PPAR按结构分为α、β、Y三种类型，PPARG基因(Y型)是脂肪细胞分化的主要候选基因。
[0003]1990年Issemann等首先发现这种脂肪酸样化合物，因其能被过氧化物酶体增殖剂(peroxisome proliferators, PP)激活而被命名为 PP 激活受体。1997 年,Lehmann MJ等研究发现，PPARG在脂肪、巨噬细胞、肝、肾、肺、直肠中均有表达。哺乳动物中，PPARG在脂肪组织中表达量最高，其次为肝脏和肌肉。
[0004]以往的研究认为脂肪细胞数量在动物出生时就已固定不变，脂肪沉积只是其体积肥大的过程。但目前研究表明脂肪细胞的分化贯穿于机体的整个生命过程，表现在两个方面，一方面是正常脂肪细胞的更新，另一方面是机体需要储备更多能量时导致脂肪细胞的分化。Chuang S 石开究表明，ERK (extra-cellular signal regulated protein kinase)信号通路可以诱导白细胞介素表达，使其下游PPARG被磷酸化，导致PPARG下游生脂相关的靶基因表达水平降低，从而抑制了脂肪细胞分化。2011年，Pachakkil研究表明，香草精通过激活ERK通路，上调了前体脂肪细胞中PPARG基因的表达，增加了细胞葡萄糖的摄取量，促进了脂肪细胞分化。所以，PPARG基因是脂肪代谢过程中，尤其是在脂肪细胞分化过程中起重要作用。
[0005]兰州大尾羊是清朝同治年间由陕西大荔一带引进的同羊与兰州当地蒙古羊杂交选育而成的地方绵羊品种，具有耐粗饲、抗病能力强、饲料利用率高、适应性强、肉质鲜美等优点的优良地方绵羊品种，因其尾部脂肪过度沉积，导致尾大、脂肪充实而得名，其尾部脂肪细胞分化与其它绵羊差异显著，但是，国内外目前对于兰州大尾羊脂肪细胞分化相关基因的研究甚少，PPARG基因研究未见报道。
[0006]因此，本发明利用RACE技术获得兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA序列，进一步构建原核表达载体，获得重组PPARG蛋白，进一步研究PPARG基因的结构和功能，以及对绵羊脂肪细胞分化过程中的作用。
【发明内容】
[0007]本发明提供兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA序列，并构建原核表达载体获得重组PPARG蛋白，研究它的结构与功能以及对绵羊脂肪细胞分化过程中的作用。
[0008]兰州大尾羊PPARG基因是一种调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，与脂肪细胞分化密切相关的基因，其cDNA序列全长1774bp，其⑶S区片段长1428bp，编码475个氨基酸，首次提供绵羊编码区两侧翼，分别具有5’ -UTR131bp (l_131nt)和3’ -UTR214bp (1560_1774nt)。
[0009]本发明进一步提供构建绵羊PPARG基因原核表达载体并获得重组PPARG蛋白的方法。
[0010]更具体的，本发明提供一种兰州大尾羊PPARG基因的全长CDNA，如SEQ ID NO:7所
/Jn ο
[0011]更具体的，本发明提供一种兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的编码蛋白，如SEQID NO:8 所示。
[0012]更具体的，本发明提供一种表达载体，包含上述的兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA。
[0013]更具体的，本发明提供兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的用途，用于绵羊前体脂肪细胞的诱导分化。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:PPARG基因5’ -RACE片段、3’ -RACE片段和CDS片段扩增产物电泳图
[0015]Ml.DL2000DNAmarker;M2.1500bp DNAmarker; 1.5，-RACE cDNA 片段.,2.3，-RACEcDNA片段.；3.CDS片段.[0016]图2PPARG基因同源性分析和系统发育树
[0017]左图:PPARG基因同`源性分析结果；右图=PPARG基因系统发育树
[0018]图3兰州大尾羊与其他物种PPARG基因序列间多序列对位排列
[0019]黑色部分表示氨基酸序列完全相同；红色部分表示有一个以上氨基酸序列不同。
[0020]图4重组质粒pET_32a ( + ) -PPARG的酶切鉴定
[0021]ΜΙ.λ-Hind III digest; 1.pDM_19T (+)-PPARG; 2.pDM_19T (+)-PPARG-HindIII /Xho I ; 3.pET-32a ( + )-PPARG-Hind III /Xho I ; 4.pET32a-Hind III /Xho I ;M2.DL2, OOODNAMarker
[0022]图5重组菌株pET_32a ( + ) -PPARG表达产物的SDS-PAGE分析
[0023]Ml.蛋白质相对分子质量标准；1.pET_32a全细胞；2.pET_32a上清；3.pET_32a沉淀；4.pET-32a (+) -PPARG 全细胞；5.pET_32a ( + )-PPARG 上清；6.pET_32a (+) -PPARG 沉淀.[0024]图6MTT比色法绘制生长曲线
【具体实施方式】
[0025]实施例1PPARG基因克隆
[0026]按照SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 要求，设计克隆 PPARG 基因全长cDNA 的嵌套 PCR 引物 GSPl (SEQ ID NO:1)、NGSPl (SEQ ID NO:2)、GSP2 (SEQ ID NO:3)和NGSP2 (SEQ ID NO:4)，确定绵羊PPARG基因编码区序列，设计克隆绵羊PPARG编码区的PCR引物，上游引物 CDSl (SEQ ID NO:5)，下游引物 CDS2(SEQ ID NO:6);
[0027]将克隆PPARG基因全长cDNA克隆于pET32a原核表达载体中，获得pET32a_PPARG重组载体并转入BL21感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达，获得PPARG基因原核表达系统，生产重组PPARG蛋白，通过SDS-PAGE方法鉴定重组蛋白表达。
[0028](I)实验材料:选购正在育肥的6月龄兰州大尾羊(羯羊)I只，颈静脉放血后，快速切取尾部脂肪组织，切成小块，用锡箔纸包裹后液氮速冻后带回实验室，80°C保存备用。
[0029](2)实验过程:
[0030]脂肪组织总RNA的提取
[0031]由于脂肪组织含有大量油脂，RNA丰度低的特点，对RNAiso Plus试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)说明书关于脂肪组织中总RNA的提取部分操作进行了改进和完善，具体步骤如下:
[0032]①组织研磨:将超低温冻结的150~200mg脂肪组织块直接放入预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。
[0033]②研磨成的粉末组织转移至离心管中，然后加入适量的RNAiso Plus (约2ml)中，把离心管置于冰浴中进行混匀，直至均浆液呈无颗粒透明状。
[0034]③冰上静置5min，4°C 12，000r/min离心10min，除去上层油脂，取中间层匀浆液转移至新的离心管中，切勿吸取沉淀。
[0035]④在离心管中加入氯仿(约1/5的RNAiso Plus，即400 μ I )，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s(氯仿沸点低，易挥发，震荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液充分乳化(无分相现象)后，在冰上静置IOmin。
[0036]⑤12，OOOr/minfC 离心 15min。
[0037]⑥从离心机中小心取出离心管，此时均浆液分为三层，即:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。
[0038]⑦向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在冰上静置15min。
[0039]⑧12，000r/min4°C离心10min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
[0040]⑨弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇Iml (切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，8，000r/min4°C离心5min后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐
离子含量，应尽量除净乙醇)。
[0041]⑩室温干燥沉淀5min左右(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解)，加入适量的RNAase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0042](3 ) cDNA 第一链合成
[0043]cDNA第一条链的合成根据SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(clonetech公司)说明书进行操作。操作步骤如下:
[0044]①为了所有的5'和3' race cDNA合成反应,准备足够的下列Buffer Mix,并加额外的I反应以确保足够的量。每次的cDNA合成反应总体积为10 μ I。混合以下试剂，短暂地离心混匀，然后直到⑦都放于冰上。
[0045]
【权利要求】
1.一种兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA，如SEQ ID NO:7所示。
2.权利要求1所述的兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的编码蛋白，如SEQID N0:8所/Jn ο
3.一种表达载体，包含权利要求1所述的兰州大尾羊PPARG基因的全长cDNA。
4.权利要求1所述的兰州大尾羊PPARG基因全长cDNA的用途，用于绵羊前体脂肪细胞的诱导分化。·
【文档编号】C07K14/47GK103849626SQ201410060174
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】徐红伟, 臧荣鑫, 杨具田, 蔡勇, 柏家林, 曹忻, 金方圆, 达小强 申请人:西北民族大学