一种化合物及其应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种式(i)所示的化合物及其制备方法，所述的化合物可以作为荧光探针，应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测方法中；本发明利用荧光共振能量转移原理，以四苯基乙烯衍生物和5(6)-羧基荧光素作为FRET体系的供受体，设计合成出了以磷酸基团作为识别基团的“OFF-ON”FRET探针；所述荧光探针的制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且该探针对碱性磷酸酶具有高度的专一性；本发明荧光探针在应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测时，与以前所用的检测碱性磷酸酶活性的基本方法相比，其精确度和灵敏度都有很大的提高；
【专利说明】一种化合物及其应用于碱性磷酸酶活性的荧光检测方法 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新化合物，所述的化合物可以作为FRET荧光探针，应用于碱性磷 酸酶活性的荧光检测方法中。 (二）
【背景技术】
[0002] 碱性磷酸酶可来源于不同哺乳动物的骨、肝、胎盘和肠道，作为常见的分析酶，能 催化水解多样的磷酸化合物并且具有底物特异性。在临床诊断上碱性磷酸酶可作为一个重 要的生物指标，在很多疾病中如骨骼疾病，肝脏功能障碍，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，白血 病和糖尿病等中均可通过检测碱性磷酸酶的异常水平来进行初步诊断。目前已经出现了很 多方法用于该碱性磷酸酶检测，荧光检测法因其快速，敏感的传导信号而备受欢迎。
[0003] 荧光共振能量转移（FRET)已广泛应用于离子、小分子、生物大分子活性的检测。 FRET分子较于其他荧光探针而言，有以下两个优点：（1)能实现更大的斯托克斯位移，从而 减少诸如背景信号的干扰；（2)能够进行比率检测，即随着反应体系的变化两个荧光团的 发射强度或着吸收强度的比值也会跟着变化，而且随着强度比值的变化可以提高动态响应 的范围，建立内标，削弱其他因素的干扰。目前，已经报道的荧光探针大多数是以荧光强度 的变化作为响应信号，虽然都能用于检测碱性磷酸酶，但是这些探针无法排除因其他酶与 四苯乙烯（TPE)类化合物聚集而导致的荧光误差而且单信号近紫外荧光探针在细胞内的 荧光成像对细胞有损害，而基于TPE的FRET探针可通过增加斯托克斯位移解决该类问题。
[0004] 5 ￠)-羧基荧光素的发射波长处于可见光区，可以大大减少背景荧光（近紫外区） 对检测结果的干扰，而且它还是一种能同生物活性物质相键合的荧光染料。而四苯基乙烯 也是生物化学中新兴的一种荧光染料，它虽然摩尔消光系数和量子产率高，而且也在生物 大分子检测领域具有重要的应用，但是它却存在背景高、非特异性结合的缺点，那么FRET 可以很好的解决这一误差，排除其他因素的影响。根据报道，5 (6)-羧基荧光素的激发波长 与TPEs的发射波长有重叠，因此通过合适的连接臂，可以构建出荧光素-TPEs的FRET体 系。
[0005] 因此，设计荧光素-TPEs的FRET探针来检测碱性磷酸酶是一种更为灵敏、有效的 方法。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种化合物，所述的化合物可作为荧光探针应用于碱性磷酸 酶活性的荧光检测，作为荧光探针的化合物是一种新化合物，并且其制备方法简单，检测的 精确度、准确度高，检测速度快。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：
[0008] 本发明提供了一种如式⑴所示的化合物：
[0009]
【权利要求】
1. 一种如式（i)所示的化合物：
2. -种如式（i)所示的化合物的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括如下步 骤： (a) 如式（C)所示的甲基二苯甲酮反应得到式（D)所示的1，2-二苯基-1，2-二对甲苯 乙烯； (b) 步骤（a)得到的式（D)所示的1，2-二苯基-1，2-二对甲苯乙烯与N-溴代丁二酰 亚胺进行取代反应得到式（E)所示的1-(4-溴甲基苯）-2-对甲苯基-1，2-二苯基乙烯； (c) 步骤（b)得到的式（E)所示的1-(4-溴甲基苯）-2-对甲苯基-1，2-二苯基乙烯 与叠氮化钠作用，反应得到式（F)所示的1-(4-叠氮甲基苯）-2-对甲苯基-1，2-二苯基乙 烯； (d) 步骤（c)得到的式（F)所示的1-(4-叠氮甲基苯）-2-对甲苯基-1，2-二苯基乙烯 与三苯基磷进行还原反应得到式（G)所示的化合物（4-(1，2-二苯基-2-(对甲苯基）乙烯 基）苯基）甲胺； (e) 如式（A)所示的偏苯三酸酐和间苯二酚反应，得到式（B)所示的5(6)-羧基荧光 素； (f) 有机溶剂中，步骤（e)得到的式（B)所示的5(6)-羧基荧光素与步骤（d)得到的 式（G)所示化合物在酰化条件下，反应得到式（H)所示的化合物2-(6-羟基-3氧-3H-氧 杂蒽-9-基）-4(5)-((4-(1,2-二苯基-2-(对甲苯基）乙烯基）苯甲基）氨基甲酰基）苯 甲酸； (g) 步骤（f)得到的式（H)所示的化合物与氯磷酸二乙酯进行酯化反应得到式（I) 所示的化合物2-(3, 6-二磷酸二乙酯氧基-9H-氧杂蒽-9-基）-4(5)-((4-(1,2-二苯 基-2-(对甲苯基）乙烯基）苯甲基）氨基甲酰基）苯甲酸； (h) 式（I)所示的化合物在三甲基碘硅烷作用下得到式（i)所示的2-(3, 6-二磷酸氧 基-9H-氧杂蒽-9-基）-4(5)-((4-(1, 2-二苯基-2-(对甲苯基）乙烯基）苯甲基）氨基 甲酰基）苯甲酸；
3.如权利要求2所述的式（i)所示化合物的制备方法，其特征在于所述的制备方法包 括如下步骤： (a) 如式（C)所示的甲基二苯甲酮于四氢呋喃溶剂中，在11(：14和锌粉催化下回流反应 8?10小时，反应结束后即得到式⑶所示的1，2-二苯基-1，2-二对甲苯乙烯； (b) 步骤（a)得到的式⑶所示的1，2-二苯基-1，2-二对甲苯乙烯与N-溴代丁二 酰亚胺在CC14溶剂中回流进行取代反应，反应结束后反应液分离处理得到式（E)所示的 1 _(4_溴甲基苯）-2_对甲苯基-1，2-二苯基乙烯； (c) 步骤（b)得到的式（E)所示的1-(4-溴甲基苯）-2-对甲苯基-1，2-二苯基乙烯 在DMSO中与叠氮化钠作用，常温反应得到式（F)所示的1-(4-叠氮甲基苯）-2-对甲苯 基-1,2-二苯基乙烯； (d) 步骤（c)得到的式（F)所示的1-(4-叠氮甲基苯）-2-对甲苯基-1，2-二苯基乙 烯与三苯基磷进行还原反应，以THF为溶剂，回流反应10小时得到式（G)所示的化合物 (4-(1，2-二苯基-2-(对甲苯基）乙烯基）苯基）甲胺； (e) 如式（A)所示的偏苯三酸酐和间苯二酚在甲磺酸溶液中回流反应，反应结束后反 应液倒入碎冰中析出固体，过滤，取滤饼得到式（B)所示的5 (6)-羧基荧光素； (f) 在DMF有机溶剂中，步骤（e)得到的式⑶所示的5(6)-羧基荧光素与步骤（d)得 到的式（G)所示化合物在HOBt、EDC.HCl、三乙胺条件下，反应过夜后，往反应液中加入水后 过滤，取滤饼得到式（H)所示的化合物； (g) 步骤（f)得到的式（H)所示的化合物与氯磷酸二乙酯在吡啶溶液中进行酯化反应， 反应结束后，反应液中加入水后过滤，取滤饼得到式（I)所示的化合物； (h) 式（I)所示的化合物在三甲基碘硅烷作用下脱酯，反应结束后反应液分离处理得 到式⑴所示的化合物。
4. 如权利要求1所述的式（i)所示的化合物作为荧光探针，应用于碱性磷酸酶活性的 荧光检测。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测的方法 为：以式（i)所示的化合物作为荧光探针，碱性磷酸酶水解荧光探针形成FRET荧光物质，测 定荧光强度变化从而获得碱性磷酸酶活性强度。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测的方 法为：先将待测碱性磷酸酶样品溶于浓度50mM，pH值为8. 4的硼酸缓冲液中得到浓度为 22. 5mg/mL待测碱性磷酸酶的样品溶液，然后将待测碱性磷酸酶的样品溶液按体积比1:15 加入pH值为8. 4的硼酸缓冲液中，接着加入荧光探针的DMSO溶液，得到反应液，将所述的 反应液立即加入96孔筛板中，在λ ex/λ em = 350/530nm的条件下观测荧光强度变化，获 得碱性磷酸酶活性强度数据；所述方法中加入荧光探针的DMSO溶液的量要使反应液中荧 光探针的终浓度为〇· 01?200 μ mol/L。
7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测的方法 为：在微量离心管中，先将待测碱性磷酸酶样品用浓度50mM，pH值为8. 4的硼酸缓冲液溶 解，得到待测碱性磷酸酶的样品溶液，然后将待测碱性磷酸酶的样品溶液按体积比1:15加 入浓度50mM、pH值为8. 4的硼酸缓冲液中，接着加入浓度7. 5mM的荧光探针的DMSO溶液， 得到荧光探针的终浓度为0. 01?200 μ mol/L的反应液，在37°C下，所述反应液立即在96 孔筛板中用酶标仪检测荧光强度，分析荧光强度与时间的关系后获得碱性磷酸酶活性强度 数据。
8. 如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法按照 如下步骤进行：在微量离心管中，先将待测碱性磷酸酶样品用浓度50mM，pH值为8. 4的硼酸 缓冲液溶解，得到浓度为22. 5mg/mL待测碱性磷酸酶的样品溶液，然后取10体积份所述的 待测碱性磷酸酶的样品溶液放入139体积份浓度50mM，pH值为8. 4的硼酸缓冲液中，接着 加入1体积份浓度为7. 5mM化合物（i)的DMSO溶液，在96孔筛板中用酶标仪检测荧光强 度，分析荧光强度与时间的关系后获得碱性磷酸酶活性强度数据。
【文档编号】C07F9/655GK104109176SQ201410250272
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】朱勍, 李雪峰 申请人:浙江工业大学