人源化的抗-cxcr5抗体、其衍生物及它们的应用的制作方法

人源化的抗-cxcr5抗体、其衍生物及它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及与CXCR5特异性结合并能例如抑制CXCR5功能的人源化抗体。本发明还包括该抗体治疗或预防与CXCR5相关的疾病或障碍的用途。
【专利说明】人源化的抗-CXCR5抗体、其衍生物及它们的应用
[0001]本申请为2008年8月27日提交的、发明名称为“人源化的抗-CXCR5抗体、其衍生物及它们的应用”的PCT申请PCT/US2008/074381的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年4月27日，申请号为200880113572.3。
发明领域
[0002]本发明涉及抗CXCR5的抗体及其在改善、治疗或预防哺乳动物包括人类的疾病或障碍中的用途，这些疾病或障碍源自不适宜的CXCR5活性或代谢或者例如病原体对CXCR5活性或代谢的不恰当或不正常的使用。目的抗体可阻断配体例如CXCL13与其受体例如CXCR5的结合。本发明还披露了含有目的抗体及其衍生物的预防、免疫治疗和诊断组合物，以及它们在预防或治疗哺乳动物包括人类的疾病的方法中的用途，这些疾病是由CXCR5+细胞例如B淋巴细胞的不适宜的代谢和/或活性引起的。这类疾病包括由炎症引起或以炎症为特征的自身免疫缺陷和疾病，例如其中CXCR5发生上调的类风湿性关节炎(RA)。
[0003]发明背景
[0004]CXCR5也被称为伯基特淋巴瘤受体(BLRl)、CD185、MDR15和MGC117347。它是G蛋白偶联受体，也是CXC趋化因子受体家族的成员。其中一个配体是BLC，也称为CXCL13，它是B细胞的化学引诱物。
[0005]未加工的CXCR5前体长度为372个氨基酸，分子量为42KD。
[0006]CXCR5参与了 B细胞在特定解剖间隔内的迁移和定位。基因敲除的小鼠缺乏外周淋巴结，具有较少的派伊尔斑和降低的B细胞水平。
[0007]发明概沭
[0008]本发明提供了特异结合CXCR5的新的人源化和人抗体以及它们的片段和衍生物。一部分所述抗体及其CXCR5结合片段经改造可防止链内二硫键的形成，从而产生在体内生产和使用过程中稳定的分子。其它目的抗体经改造可使与FeR的结合最小化。某些令人感兴趣的CXCR5抗体与CXCL13竞争结合CXCR5。其它抗体降低CXCR5活性。
[0009]本发明包括所述抗体的可变重链和轻链的氨基酸序列及其对应的核酸序列。
[0010]本发明的另一实施方案包括所述抗体的互补决定区(OTR)序列，以得到包括一个或多个CDR区域或源自CDR的区域的结合分子，它们保留了母体分子结合CXCR5的能力，其中CDR得自母体分子。
[0011]目的抗体可以是防止CXCL13或其它配体结合到CXCR5+细胞例如B细胞的抗体。
[0012]本发明的另一实施方案包括携带有本发明所述抗体序列的细胞系和载体。
[0013]本发明的另一实施方案是所述抗体在制备用于治疗与CXCR5功能和代谢有关的疾病和障碍 的药物或组合物中的用途。
[0014]本发明的另一实施方案是这些抗体在治疗与非典型或异常的CXCR5生物学和功能相关的障碍中的用途。
[0015]本文还叙述了其它特点和优点，将在以下的发明详述中显现。
[0016]发明详沭[0017]本发明不局限于本文所述的具体方法学、实验方案、细胞系、载体或试剂，这是因为它们可发生变动，而不偏离本发明的精神和范围。而且，本文所使用的术语仅为了举例说明具体实施方案的目的，并非意在限制本发明的范围。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩略词的含义与本发明领域普通技术人员通常理解的含义相同。实施本发明时可使用任何与本文所述类似或等同的方法和材料，本文仅叙述了示例性的方法、设备和材料。
[0018]出于叙述和披露可能与本发明一同使用和可能在本发明中使用的所报道的蛋白质、酶、载体、宿主细胞和方法学的目的，本文所提及的所有专利和出版物都整体引入本文作为参考。但是，本文任何部分都不能理解为承认以下观点:由于先前的发明而使本发明无权声称早于这些披露内容。
[0019]在教导制备和使用CXCR5相关的方法和目的产物之前，提供了一些术语和短语的下列非限制性定义来指导技术人员。
[0020]“CXCR5”涉及在淋巴细胞、尤其是B细胞、特别是原初B细胞中天然存在的已知分子；涉及从这些细胞分离出的分子；涉及使用已知材料和方法并使用编码CXCR5的核酸经重组制备的分子；以及涉及CXCR5的某些部分，例如胞外(EC)结构域，其保留了与实施本发明有关的特点和性质，例如结合CXCL13。可溶的CXCR5分子可基本上由CXCR5的EC区域组成，一般包括该分子的前60个氨基酸，即CXCR5的氨基末端部分。
[0021]CXCR5是非混杂受体。CXCL13是CXCR5的配体，在基底细胞例如滤泡树突状细胞和淋巴组织中为组成型表达。CXCL13特异吸引B细胞和一个T细胞的小亚组(其称为B辅助性滤泡T细胞(TFH))。考虑到免疫系统中的T细胞和B细胞群体之间有许多互相作用，这点可能并不出人意料。而且，活化的T细胞诱导或上调CXCR5表达。已发现淋巴细胞浸润到三级异位生发中心(GC)与预先具有这类非典型的淋巴结样结构的某些疾病的病情加重和耐受崩溃紧密相关。使用体内鼠模型，例如CXCR5-/-和CXCL13-/-小鼠，受体或配体的缺失导致GC精细结构由于T细胞和B细胞定位改变和可能的互相作用而发生变化。这些小鼠还可受到保护，防止发生严重的胶原诱导的关节炎(CIA)。由于CXCR5选择性地在与RA发病相关的成熟B细胞上表达，阻断该受体可调节受累个体的致关节炎的反应。使用生物制品(即抗TNFa和抗CD20抗体，利妥昔单抗)治疗类风湿性关节炎已表现为临床有效，具体而言，接受B细胞导向疗法的患者的临床体征和症状表现出长期改善。选择性地靶向于仅在成熟B细胞和B辅助性T细胞上表达的CXCR5，不会影响B细胞的发育或使患者免疫力受损。与利妥昔单抗不同的是，本发明抗体是不介导细胞毒性的中和抗体。
[0022]“CXCR5疾病”是一种疾病、障碍、症状、异常等，其特征或诱因是CXCL13或其它CXCR5的配体过表达或水平升高、B细胞水平升高、B细胞活性水平升高、CXCR5水平升高或CXCR5代谢或活性异常。
[0023]所谓“B细胞活性”是指高于正常B细胞水平，其可以是局部的，或是某种生物现象或B细胞功能的表现，例如抗体表达、Bruton酪氨酸激酶的存在或活性、CD19的表达或存在、B细胞活化因子的表达或存在等。
[0024]就抗体链多肽序列而言，短语“基本相同”可理解为具有与参照多肽序列至少70^^80^^90^^95%或更多的序列同一性的抗体链。就核酸序列而言，该术语可理解为具有与参照核酸序列至少85 %、90 %、95 %、97 %或更高的序列同一性的核苷酸序列。[0025]术语“同一性”或“同源性”是指将候选序列中核苷酸碱基或氨基酸残基与相应序列进行比较，经序列比对和引入间隔(若有必要的话)以实现整段序列的最大相同百分数并且不把任何保守性取代视为序列同一性的一部分后，二者碱基或残基相同的比例。无论N端或C端延伸或插入均不应理解为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序均可获得，并为本领域所熟知。可使用序列分析软件测定序列同一性。
[0026]短语和术语抗体或抗原的“功能片段、变异体、衍生物或类似物”等以及它们的形式是具有与全长的目的抗体或抗原的生物活性性质相同的化合物或分子。例如，抗CXCR5抗体的功能片段或类似物是可结合CXCR5分子的片段或类似物，或是可防止或大幅降低配体例如CXCL13或激动性或拮抗性抗体结合CXCR5的能力的片段或类似物。一个实例是scFv分子。就CXCR5而言，其变异体或衍生物是与天然存在的CXCR5不同的分子，但却可用于本发明的目的，例如尽管与野生型CXCR5不相同，但可用作诱导产生选择性结合野生型CXCR5的抗体的免疫原。
[0027]“取代型”变异体是一段天然序列中至少一个氨基酸残基被除去并被一个不同的氨基酸插入其相同位置的变异体。所述取代可为单个的，其中该分子中仅有一个氨基酸被取代；或可为多个的，其中该相同分子有两个或更多的氨基酸被取代。多个取代可位于连续的位点。同样，一个氨基酸可被多个残基取代，其中该变异体包括取代和插入。“插入型”变异体是一个或多个氨基酸被插入到紧邻一段天然序列某个特定位置处的氨基酸的变异体。紧邻的氨基酸是指与该氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。“删除型”变异体是天然氨基酸序列中一个或多个氨基酸被除去的变异体。通常，删除型变异体在其分子的特定区域内有一个或两个氨基 酸被删除。
[0028]术语“抗体”被用于最宽泛的含义，具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、携带一个或多个CDR或源自CDR序列的抗体片段或合成多肽，只要这些多肽表现出所需的生物活性。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。一般情况下，抗体被认为是具有确定或公认的特异性的Ig。因此，尽管抗体表现出与特异靶点的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏靶点特异性的抗体样分子。本发明所述抗体可为任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)、或亚类(例如IgGp IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA1UgA2等)的抗体(“类型”和“种类”、以及“亚型”和“亚类”在本文中可互换使用)。天然或野生型(即得自未经人工操作的群体成员)抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条重链的一端具有一个可变区(Vh)，随后是一系列恒定区。每条轻链的一端具有一个可变区(VJ，另一端具有一个恒定区。所谓“未经人工操作”是指未经处理以含有或表达外源抗原结合分子。野生型可指一个群体中最普遍的等位基因或种类，或指得自未经操作的动物的抗体，后者是与得自某种形式的操作的等位基因或多态性或变异体或衍生物相比较而言，所述操作是例如诱变、使用重组方法等来改变该抗原结合分子的氨基酸。
[0029]正如本文所使用，“抗CXCR5抗体”是指可特异结合本文所定义的人CXCR5的抗体或衍生自这些抗体的多肽(衍生物)，其包括但不限于抑制或实质降低CXCR5与其配体的结合或抑制CXCR5活性的分子。
[0030]就抗体的可变区而言，术语“可变”是指抗体之间有广泛序列差异的相关分子的某些部分，且被用于特异抗体对其特异靶点的特异性识别和结合。但是，变异性在抗体的整个可变区内不是均匀分布的。变异性集中在被称为互补决定区(CDR;即CDR1、CDR2和CDR3)或高变区的三个区段，它们均位于轻链和重链的可变区内。可变区内保守程度更高的部分被称为框架(FR)区或框架序列。天然重链和轻链的每个可变区均包括四个FR区，它们主要采用折叠构型，通过三个⑶R连接起来，⑶R形成环连接折叠结构，并在某些情况下形成部分的β_折叠结构。每条链的CDR通常被FR区或来自其它链的CDR维系在一起，促进抗体的祀点结合位点(表位或决定簇)形成(参看Kabat等人Sequences of Proteinsof Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987))。正如本文所使用，免疫球蛋白氨基酸的编号是依据Kabat等的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统而进行的，除非另有说明。一个CDR可具有特异结合同源表位的能力。
[0031]术语“抗体片段”是指完整或全长链或抗体的一部分，一般是靶点结合区域或可变区域。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段。“功能片段”或“抗CXCR5抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段”含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab，)2。“Fv”片段由一条重链的可变区和一条轻链的可变区通过非共价结合方式而形成的二聚体(Vh-' 二聚体)组成。在该构型中 ，每个可变区的三个CDR互相作用，以确定Vh-' 二聚体表面上的靶点结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个CDR共同赋予完整抗体的靶点结合特异性。但是，即使是单个可变区(或仅包括3个特异识别某靶点的CDR的Fv的一半)，仍可具有识别和结合靶点的能力。
[0032]“单链Fv”、“sFv”或“ scAb”抗体片段包括抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域位于单条多肽链上。一般而言，所述Fv多肽还包括一段位于Vh和\区域之间的多肽连接体，其通常为柔性分子，可使sFv形成适合于靶点结合的所需结构。
[0033]术语“双价抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段可包括与同一多肽链的一个轻链可变区连接的一个重链可变区(Vh)。通过使用一条过短的连接体使得同一条链上的两个可变区无法配对，所述双价抗体区域被迫与另一条链的结合区域配对，生成两个抗原结合位点。
[0034]Fab片段含有轻链的可变区和恒定区以及重链的第一个恒定区(Cm)。Fab，片段与Fab片段的不同之处在于前者在Cm区域的羧基端加入数个残基，以包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。通过裂解位于F(ab，)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键，可生成Fab，片段。对抗体另外进行酶处理和化学处理可生成其它目的功能片段。
[0035]本文所使用的术语“单克隆抗体”是指得自基本同源的抗体群的抗体，即组成该群体的各个抗体除可能有少量天然突变外，均是相同的。
[0036]本文的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与源自某特定物种或属于某特定抗体种类或亚类(类型或亚型)的相应序列相同或同源，其中所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体以及所述抗体片段的相应序列相同或同源，只要这些抗体片段表现出结合CXCR5或影响CXCR5活性或代谢的所需生物活性即可(美国专利 4，816，567 ;Morrison等的Proc Natl Acad Sci USA81:6851 (1984))。因此，来自同一类别抗体的CDR可移植到不同种类或亚类抗体的FR中。[0037]单克隆抗体是高度特异性的抗体，它们识别单个靶位点、表位或决定簇。而且，与通常包括针对抗原的不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同的是，每个单克隆抗体针对靶点上的单个决定簇。除其特异性以外，单克隆抗体在宿主细胞内的合成是有利的，不受其它免疫球蛋白的污染，并提供了克隆编码其抗体链的相关基因和mRNA。修饰语“单克隆”指得自基本同质抗体群的抗体的性质，其不应理解为需要通过任何特定方法产生所述抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可从噬菌体抗体库通过使用众所周知的技术分离或从多克隆制品纯化。本发明使用的亲代单克隆抗体可通过Kohler等人在Nature256:495(1975)中所述的杂交瘤方法制备，或通过本领域内众所周知的重组方法制备。
[0038]非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的片段(例如抗体的Fv、Fab, Fab-、F(ab，)2或其它靶点结合序列)，与人抗体相比，其含有源自非人类的免疫球蛋白序列。一般而言，所述人源化抗体基本包括一个、通常为两个的所有可变区，其中所有或基本上所有CDR区域对应于非人类免疫球蛋白的CDR区域，以及所有或基本上所有FR区域是人类免疫球蛋白模板序列的FR区域。所述人源化抗体还可包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(F。)，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的恒定区。一般而言，目的是拥有在人体内免疫原性最低的抗体分子。因此，有可能一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸也可被更换成在人类宿主体内免疫原性更低的氨基酸，但基本不降低所述一个或多个CDR对CXCR5或CXCL13的特异结合功能。或者，FR可为非人类的，但免疫原性最强的氨基酸被替换为免疫原性较低的氨基酸。但是，上文所讨论的CDR移植并非是获得人源化抗体的唯一途径。例如，仅修饰CDR区域可能不够充分，因为框架区残基参与决定CDR环的三维结构以及抗体与其配体的总亲和力的情况并不少见。因此，可实施任何方法，以使非人类亲代抗体分子被修饰为对人免疫原性更低的抗体分子，而且并非总是需要与人抗体的总序列相同。因此，也可通过例如仅取代数个残基实现人源化，尤其是取代暴露在抗体分子外且没有被包埋在该分子内部从而不易接近宿主免疫系统的残基。本文在取代抗体分子上的“活动”或“柔性”残基方面教导了该方法，其目标是降低或减少所形成分子的免疫原性，却不破坏所述抗体对其表位或决定簇的特异性。例如参见 Studnicka 等的 Prot Eng7 (6) 805-814，1994 ；Mol Imm44:1986-1988, 2007 ；Sims 等的 JImmunol 151:2296 (1993) ;Chothia 等的 J Mol Bioll96:901 (1987) ;Carter 等的 Proc NatlAcad Sci USA89:4285 (1992) ;Presta 等的 J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 和美国专利 5，869，619。
[0039]适应性免疫反应具有两个主要方面:T淋巴细胞的细胞免疫反应和分泌抗体的B淋巴细胞的体液免疫反应。B细胞的表位可以是线性、连续氨基酸或可以是构象的(ProteinScience (2005) 14，246)。相反，T细胞表位是短小的线性肽，它们是主要组织相容性复合物(MHC)蛋白或人白细胞抗原(HLA)I类或II类分子所呈递的抗原蛋白的切割产物。表位呈递取决于MHC-肽结合和T细胞受体(TCR)互相作用。MHC蛋白为高度多态性的，每个MHC蛋白可结合有限数量的肽。因此，宿主体内的MHC等位基因的特定组合限制了感染过程中可能被识别的表位。
[0040]通过⑶8和⑶4蛋白表达可区分两种基本类型的T细胞，⑶8和⑶4蛋白决定T细胞是否识别分别由I类或II类分子所呈递的表位。CD4+T表位被抗原呈现细胞包裹到膜结合囊泡内后进行加工，其中抗原被蛋白酶降解成结合MHC II类蛋白的肽片段。相反，CD8+T细胞一般识别被免疫蛋白酶体在细胞溶质中切割成短肽的病毒抗原或细胞内表达的自身抗原和蛋白质。切割后，肽被与抗原加工相关的转运蛋白(TAP)移位至内质网，以结合到HLA I抗原上。CD4+T(辅助性)细胞表位是驱动针对蛋白抗原的T细胞依赖免疫反应的关键。
[0041]目的人源化方法基于所述抗体的分子柔性在免疫识别中的影响。蛋白质柔性与蛋白分子的分子运动有关。蛋白质柔性是整个蛋白、部分蛋白或单个氨基酸残基采取构象集合的能力，其中该构象集合中每个构象各自显著不同。有关蛋白质柔性的信息可从蛋白质X射线结晶学实验(参见例如Kundu等的2002，Biophys J83:723 - 732.)、核磁共振实验(参见例如 Freedberg 等的 J Am Chem Socl998, 120(31):7916-7923)或进行分子动力学(MD)模拟而获得。在计算机上进行蛋白质的MD模拟，可通过计算原子之间的物理互相作用测定所有蛋白质原子在一段时间内的运动。MD模拟的输出是所研究蛋白在模拟时间段内的轨迹。该轨迹是蛋白质构象或称瞬间运动图的集合，蛋白质构象在模拟期间例如每隔I皮秒(ps)内定期采样。通过分析瞬间运动图的集合，人们能够定量分析蛋白质氨基酸残基的柔性。因此，就含有柔性残基的多肽而言，柔性残基是采取不同构象集合的残基。MD方法为本领域所公知，参见例如Brooks等的“Proteins: A Theoretical Perspectiveof Dynamics, Structure and Thermodynamics” (Wiley, New York, 1988)。数种软件可进行 MD 模拟，例如 Amber (参见 Case 等的(2005) J Comp Chem26:1668-1688), Charmm(参见Brooks 等的(1983) J Comp Chem4:187-217 ;和 MacKerell 等的(1998) “The Encyclopediaof Computational ChemistryjVol .1:271-177，Schleyer 等的 eds.Chichester: John Wiley& Sons)或 Impact (参见 Rizzo 等的 J AmChem Soc ；2000 ; 122 (51):12898-12900)。
[0042]大多数蛋白质复合物共享相对较大和较平的被包埋表面，已表明结合伴侣的柔性提供了其弹性的来源，使其能够适应彼此的构象(Structure (2000) 8，R137-R142)。因此，已表明“诱导契合”的实例在蛋白质-蛋白质的界面起了主要作用。此外，稳定增长的数据表明蛋白质实际上结合各种形状、大小和组成的配体(Protein Science (2002) 11:184-187),且构象多样性似乎是识别不同伴侣能力的基本组分(Science (2003) 299，1362-1367)。柔性残基参与了蛋白质-蛋白质伴侣的结合(Structure (2006) 14，683-693)。
[0043]柔性残基可采取许多构象，它们提供了互相作用区域的集合，其有可能被记忆B细胞识别并触发免疫原性反应。因此，可通过修饰许多来自框架区的残基使抗体人源化，使得构象集合和被修饰抗体所展示的识别区域集合尽可能类似于人抗体所采取的构象集合和识别区域集合。
[0044]这一点可通过以下列方法修饰有限数目的残基而实现:(I)构建母体mAb的同源模型，进行MD模拟；(2)分析柔性残基和鉴定非人抗体分子最灵活的残基，以及鉴定有可能是异质性或降解反应来源的残基或基序；(3)鉴定展示出与亲代抗体最相似的识别区域集合的人抗体；(4)测定待突变的柔性残基，可能是异质性和降解来源的残基或基序也进行突变；(5)检查是否存在已知的T细胞或B细胞表位。采用本文所述的MD计算，使用内含的溶剂模型，可发现柔性残基，该溶剂模型描述了水溶剂与蛋白质原子在模拟期间内的互相作用。
[0045]一旦在轻链和重链的可变区内鉴定出一组柔性残基，就鉴定出与目的抗体高度类似的一组人重链和轻链可变区域框架。例如可使用BLAST在抗体人生殖细胞系序列的数据库中检索柔性残基来进行上述鉴定。还可通过比较母体mAb与生殖细胞系经典结构库的动力学，进行上述鉴定。检索时排除CDR残基和邻近残基，以确保保留对于抗原的高度亲和力。
[0046]因此，对目的抗体的分子动力学轨迹与生殖细胞系抗体结构库的轨迹进行比较。将16D7与49个生殖细胞系结构的库进行比较。每个抗体所留下的分子动力学轨迹是分子动力学计算机仿真过程中的分子动力学计算结果的集合，其中例如使用约10个不同的构象作为不同的起点，并且对于每个起点进行约10次的分子动力学模拟。通过系统合并7个最常见的人轻链(νκ Uvk 2、ν κ 3、ν κ 4、ν λ Uvl λ 2和ν λ 3)和7个最常见的重链(vhla、vhlb、vh2、vh3、vh4、vh5和vh6)，构建人抗体生殖细胞系的49 3D同源模型(Nucleic AcidsResearch, 2005, Vol.33，Database issue D593-D597)。随后将 16D7 的柔性残基更换为其轨迹与目的抗体最为接近的生殖细胞系结构的相应残基。
[0047]随后取代柔性残基。当几个人类残基表现出类似同源性时，通过可能影响人源化抗体的溶液行为的残基性质来操作该选择。例如，暴露的柔性环上优选极性残基，而不是疏水残基。对可能为不稳定性和异质性来源的残基进行突变，如果在CDR上也发现了它们的话。这些残基包括暴露的甲硫氨酸，因为亚砜可由氧自由基、对酸敏感的键例如Asp-Pro 二肽的键的蛋白水解而形成(Drug Dev Res (2004) 61:137-154);位于暴露的天冬酰胺残基和随后的小氨基酸例如Gly、Ser, Ala、His、Asn或Cys处的脱酰胺作用位点(JChromatog (2006) 837:35-43)和N-糖基化位点例如Asn-X-Ser/Thr位点。一般情况下，暴露的甲硫氨酸会被Leu所取代，暴露的天冬酰胺会被谷氨酰胺或天冬氨酸所取代，或更换其后续残基。对于糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)而言,可更换Asn或Ser/Thr残基。 [0048]检查形成的复合序列是否存在已知的B细胞或线性T细胞表位。例如使用披露的Immune Epitope Data Base(IEDB)进行检索(PLos Biol (2005) 3 (3) e91)。如果在该复合序列中发现已知表位，则检索和取代另一组人序列。
[0049]与美国专利5，639，641的表面重塑方法不同的是，该方法探讨了 B细胞介导和T细胞介导的免疫原性反应。该方法还避免了有时使用CDR移植可观察到的活性丢失问题(美国专利5，530, 101)。此外,在设计和选择过程中还考虑了稳定性和溶解度的问题,从而形成具有低免疫原性、高抗原亲和力和改善的生物物理性质的优化抗体。
[0050]例如美国专利5，639，641披露了用于表面重塑抗体的策略和方法以及降低抗体在不同宿主体内免疫原性的其它方法。简而言之，在一种优选方法中，(I)生成抗体重链和轻链的可变区库的位置比对，得到重链和轻链可变区框架表面暴露的位置，其中所有可变区域的比对位置至少约98%是相同的；(2)确定一组重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基，用于非人类例如啮齿动物抗体(或其抗体片段)；(3)鉴定一组与所述啮齿动物抗体表面暴露的氨基酸残基最为一致的重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基；以及(4)将步骤(2)所确定的一组重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸替换为步骤(3)所鉴定的一组重链和轻链可变区框架表面暴露的氨基酸残基，除了距离所述啮齿动物抗体CDR的任何残基的任何原子5人以内的氨基酸残基以外，以生成保留结合特异性的人源化的例如啮齿动物抗体。
[0051 ] 抗体可利用许多其它技术例如CDR移植(ΕΡ0 O 239 400 ;W091/09967和美国专利 5，530，101 以及 5，585，089)、镶饰或表面重塑(EPO O 592106 ；ΕΡ0 O 519596 ；Padlan, 1991，Molec Imm28 (4/5):489-498 ；Studnicka 等的 1994, Prot Eng7 (6):805-814和Roguska等的1994, PNAS91:969-973)和链改组(美国专利5，565，332)进行人源化。人抗体可通过许多本领域已知的方法进行制备，包括但不限于噬菌体展示方法(参见美国专利 4，444，887，4，716，111，5，545，806 和 5，814，318 和 WO 98/46645, WO 98/50433, WO98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096, WO 96/33735 和 WO 91/10741)、使用转基因动物例如啮齿类，以及使用嵌合细胞等。
[0052]“抗体同源物”或“同源物”是指本文所教导的特异结合CXCR5的任何分子。因此，抗体同源物包括不论修饰与否的天然或重组抗体、抗体的部分，所述的部分保留了目的生物性质如结合CXCR5，例如Fab或Fv分子、单链抗体以及携带一个或多个CDR区域的多肽等。所述同源物的氨基酸序列无需与天然存在的抗体氨基酸序列相同，但可通过改变或修饰以携带取代的氨基酸、插入的氨基酸、删除的氨基酸、除蛋白质上正常存在的20种氨基酸以外的氨基酸等，以获得具有增强的或其它有利性质的多肽。
[0053]具有同源序列的抗体是其氨基酸序列与本发明的CXCR5抗体的氨基酸序列具有序列同源性的抗体。优选地，同源性位于本发明抗体的可变区域的氨基酸序列。应用于本文氨基酸序列的“序列同源性”定义为通过例如根据Pearson & Lipman, Proc Natl Acad SciUSA85，2444-2448 (1988)的FASTA检索方法测定的与其它氨基酸序列具有至少约90 %、91%、92%、93%、94%或更多的序列同源性，更优选为至少约95 %、96 %、97 %、98 %或
99%的序列同源性的序列。
[0054]嵌合抗体是具 有不同部分的抗体，其源自不同来源例如不同抗体、不同种类的抗体、不同动物物种，例如具有一个源自鼠单克隆抗体的可变区以及一个配对的人免疫球蛋白恒定区的抗体等。因此，人源化抗体是一种嵌合抗体。用于生产嵌合抗体的方法为本领域所知晓，参见例如 Morrison, 1985，Science229:1202 ；0i 等人，1986, BioTechniques4:214 ；Gillies 等的 1989，J Immunol Methodsl25:191-202 和美国专利 5，807，715，4，816，567 和4，816，397。
[0055]人工抗体包括单链抗体、scFv片段、嵌合抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体和分子识别单位(mru)(参见 Winter & Milstein 的综述,1991, Nature349:293-299 ；和Hudson, 1999, Curr Opin Immll: 548-557),其中每种均具有抗原结合或表位结合能力。在单链^片段(ScFv)中，抗体的乂11和'区域通过柔性肽连接起来。一般情况下，所述连接体是约为15个氨基酸的肽。如果该连接体小得多，例如5个氨基酸，则形成双价抗体，其为双价的scFv 二聚体。如果该连接体被减少到不到3个氨基酸残基，则形成三聚体和四聚体结构，它们分别被称为三价抗体和四价抗体。抗体的最小结合单元可以是单个CDR，一般为重链的CDR2或CDR3，其具有足够的特异识别和结合能力，但也可以是CDR序列的任意组合，这可通过本文所教导的实施方法进行确定。这种片段被称为分子识别单位或mru。几个该类mru可通过短的连接肽连接到一起,从而形成具有高于单个mru的亲和力的人工结合蛋白。
[0056]目的抗体的功能等效物也包括在本发明的范围内。术语“功能等效物”包括具有同源系列的抗体、抗体同源物、嵌合抗体、人工抗体和修饰抗体，例如其中每个功能等效物通过其结合CXCR5的能力、抑制CXCR5信号转导的能力或功能、或抑制CXCL13和其它配体结合到CXCR5的能力来定义。技术人员能够理解，名为“抗体片段”的一组分子与名为“功能等效物，，的一组分子有重叠。制备保留CXCR5结合能力的功能等效物的方法为本领域技术人员公知，并在例如 WO 93/21319，EPO Ser.N0.239，400，WO 89/09622，EPO Ser.N0.338，745和 EPO Ser.N0.332，424 中披露。
[0057]本申请的功能等效物还包括修饰抗体，例如被任何类型的分子经共价连接而修饰的抗体。例如，修饰抗体包括经过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、脱酰胺化、磷酸化、酰胺化、被已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白裂解、连接到细胞配体、连接到毒素或细胞毒性部分或其它蛋白等修饰的抗体。共价连接无需生成不产生抗独特型反应的抗体。所述修饰可通过已知技术实现，其包括但不限于特异化学切割、乙酰化、甲酰化、代谢合成等。此外，被修饰的抗体可含有一个或多个非经典的氨基酸。
[0058]本领域技术人员可利用许多技术来实现结合亲和力的优化。一般情况下，这些技术包括对目的位置处的各种氨基酸残基进行替代、随后筛选分析突变多肽对同源抗原或表位的结合亲和力。
[0059]一旦抗体被鉴定和分离，通常可用来生成变异抗体或突变体或突变蛋白质，其中例如所述抗体的一个或多个高变区的一个或多个氨基酸残基被改变。或者，或此外，可向抗体引入框架区残基的一个或多个变动(例如取代)，而这些变动导致抗体突变体对CXCR5的结合亲和力升高。可被修饰的框架区残基的实例包括非共价直接结合抗原的残基(Amit等的Science233:747-753 (1986));影响CDR构象或与其互相作用的残基(Chothia等的JMol Biol 196:901-917 (1987));和/或参与VfV11界面的残基(EP239400)。在某些实施方案中，一个或多个这类框架区残基的修饰导致抗体与同源抗原的结合亲和力增加。例如，在本发明的该实施方案中可改变约I个到约5个框架区残基。有时，这足以产生适合用于临床前试验的抗体突变体， 即使其中没有改变任何一个高变区的残基。但在正常情况下，抗体突变体可包括一个或多个高变区变动。也可改变恒定区以获得理想的或更加理想的效应物性质。
[0060]被变动的高变区残基可随机改变，尤其是当亲代抗体的初始结合亲和力可使随机产生的抗体突变体容易在本文所教导的检测中对结合改变进行筛选时。
[0061]一种获得抗体突变体例如⑶R突变体的方法是”丙氨酸扫描诱变”(Cunningham& Wells, Science244:1081-1085 (1989)和 Cunningham & Wells, Proc Nat Acad SciUSA84:6434-6437 (1991))。一个或多个高变区残基被丙氨酸或聚丙氨酸残基替代。对所述替代表现出功能敏感性的这些高变区残基随后通过在替代位点引入进一步的或其它突变而改进。因此，尽管事先确定了引入氨基酸序列变动的位点，但突变本身的性质无需事先确定。根据被扫描残基的所需性质，可尝试使用其它氨基酸进行类似替代。
[0062]一种鉴定待修饰氨基酸残基的更为系统的方法包括鉴定参与结合CXCR5的高变区残基和很少或不参与CXCR5结合的高变区残基。进行非结合高变区残基的丙氨酸扫描，其中检测每个ala突变体对CXCR5的结合是否增强。在另一实施方案中，选择明显参与CXCR5结合的这些残基进行修饰。修饰可包括删除残基或在目的残基旁插入一个或多个残基。但是，正常情况下，修饰包括以另一个氨基酸取代该残基。保守性取代可以是第一取代。如果该取代导致生物活性发生变化(例如结合亲和力)，那么可进行另一次保守取代以确定是否得到更多实质性变化。
[0063]通过选择其性质与正常情况下位于某位点处的氨基酸有更多实质差异的氨基酸，可对抗体范围和生物性质的呈现进行更为实质性的修饰。因此，可进行该取代并同时维持:(a)取代区域的多肽骨架结构，例如折叠或螺旋构象；(b)该分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(C)侧链的体积。
[0064]例如，根据常见侧链性质，天然存在的氨基酸可分为以下几组:
[0065](I)疏水:甲硫氨酸(M或met)、丙氨酸(A或ala)、缬氨酸(V或val)、亮氨酸(L或leu)和异亮氨酸(I或ile)；
[0066](2)中性、亲水:半胱氨酸(C或cys)、丝氨酸(S或ser)、苏氨酸(T或thr)、天冬酰胺(N或asn)和谷氨酰胺(Q或gin)；
[0067](3)酸性:天冬氨酸(D或asp)和谷氨酸(E或glu)；
[0068](4)碱性:组氨酸(H或his)、赖氨酸(K或Iys)和精氨酸(R或arg)；
[0069](5)影响链取向的残基:甘氨酸(G或gly)和脯氨酸(P或pro)，以及
[0070](6)芳香族:色氨酸(W或trp)、酪氨酸(Y或tyr)苯丙氨酸(F或phe)。
[0071]非保守取代需要以来自另一组的氨基酸来调换某氨基酸。保守性取代需要以来自组内的另一氨基酸来调换某氨基酸。
[0072]优选的氨基酸取代包括下列氨基酸取代:(I)降低对蛋白水解的敏感性，⑵降低对氧化的敏感性，(3)改变结合亲和力，以及(4)赋予或修饰这些类似物的其它生理-化学或功能性质。类似物可包括除天然存在肽序列以外的一段序列的各种突变蛋白质。例如，可对天然存在的序列(优选在形成分子间接触的区域以外的多肽部分)进行单个或多个氨基酸的取代(优选为保守性氨基酸取代)。除R基团或侧链的大小或构象的改变以外，保守性氨基酸取代不应当实质性改变母体序列的结构特征(例如氨基酸取代不应当打断母体序列中的螺旋，或破坏表现母体序列特征的其它类型的二级结构)(Proteins, Structures andMolecular Principles, Creighton,编辑，W.H.Freeman and Company, New York (1984))；Introduction to Protein Structure (Branden & Tooze,编辑,Garland Publishing, NewYork, N.Y.(1991));以及 Thornton 等的 Nature354:105 (1991)。
[0073]通常情况下，生物学性质改善的抗体突变体具有与母体的抗人CXCR5抗体的重链或轻链可变区的氨基酸序列至少75%的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列，和至少80%、至少85%、至少90%以及通常为至少95%的同一1丨生。就亲代抗体序列而言，同一'丨生或相似性在本文中定义为经比对序列和引入间隔(若有必要的话)以实现最大程度的序列同一性后，候选序列的氨基酸残基与亲代抗体的残基相同(即，相同残基)或类似(即，根据相同侧链性质而来自同一组的氨基酸残基，参见上文)的百分比。
[0074]或者，通过重链和轻链的FR或⑶R区域或抗CXCR5抗体的F。区域的系统突变，可生成抗体突变体。生成抗体突变体的另一种方法包括使用噬菌体展示进行亲和力成熟(Hawkins 等的 J Mol Biol254:889-896 (1992)和 Lowman 等的 Biochemistry30 (45):10832-10838(1991))。已知噬菌体外壳蛋白融合(Smith, Science228:1315 (1985) ；Scott& Smith, Science249:386 (1990) ；Cwirla 等的 Proc Natl Acad Sci USA8:309 (1990)；Devlin 等的 Science249:404 (1990) ；ffells & Lowman, Curr Opin Struct Biol2:597 (1992)和美国专利5，223, 409)可用于将所展示的蛋白或肽的表现型与编码它们的噬菌体颗粒的基因型联系在一起。抗体的Fab区域也被展示在卩遼菌体上(McCafferty等的Nature348:552 (1990) ；Barbas 等的 Proc Natl Acad Sci USA88:7978 (1991);和 Garrard 等的 Biotechnol9:1373 (1991))ο
[0075]单价噬菌体展示由一组作为噬菌体外壳蛋白融合体而被展示于噬菌体颗粒上的蛋白变异体组成(Bass等的Proteins8:309(1990)。以前已通过连续应用诱变、单价卩遼菌体展示和功能分析(Lowman & Wells, JMol Biol234:564 578(1993);美国专利5，534，617)，例如通过集中分析抗体的 CDR 区域(Barbas 等的 Proc Natl Acad Sci USA91:3809 (1994) ；andYang等的J Mol Biol254:392 (1995))，实现了亲和力成熟或各种蛋白平衡结合亲和力的提闻。
[0076]可在噬菌体颗粒上构建许多(例如IO6或更多)在序列特定位置上有差异的蛋白变异体的库，其中每个噬菌体颗粒含有编码特定蛋白变异体的DNA。使用固定抗原进行多次亲和纯化后，分离单个噬菌体克隆，并从DNA推断出所展示蛋白的氨基酸序列。
[0077]制备抗体突变体后，可依据本文教导测定该分子相对于亲代抗体的生物活性。正如上文指出，该过程涉及测定抗体的结合亲和力和/或其它生物活性或物理性质。在本发明的一个优选实施方案中，制备一组抗体突变体，筛选其对抗原的结合亲和力。任选地可对选自筛选的一个或多个抗体突变体另外进行一次或多次生物活性测定，以验证抗体突变体具有新的或改进的性质。在一个优选实施方案中，所述抗体突变体保留了与亲代抗体类似的或更好/更高的结合CXCR5的结合能力。 [0078]通常，根据抗体的预期用途，可对所选择的抗体突变体进行进一步修饰。这类修饰可包括进一步改变氨基酸序列、与异源的多肽融合和/或共价修饰。例如，一般可使用丝氨酸取代未参与维持抗体突变体适宜构象的半胱氨酸残基，以改善该分子的氧化稳定性和防止异常的交联。相反，可向抗体中加入半胱氨酸以提高稳定性(尤其当该抗体是抗体片段例如Fv片段时)。
[0079]另一类型的抗体突变体具有改变的糖基化类型。可通过删除抗体上的一个或多个碳水化合物部分和/或加入一个或多个抗体上没有的糖基化位点来实现。抗体的糖基化一般为N-连接到Asn或O-连接到Ser或Thr。三肽序列天冬酰胺_X_丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化合物部分经酶促连接到天冬酰胺侧链的常见识别序列，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。例如，将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、果糖或木糖连接到羟基氨基酸，大多数为丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向原始抗体的序列加入或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基可增加O-连接糖基化的概率。
[0080]可能需要修饰本发明所述抗体的效应物功能，以增强抗体的效力。例如，可在F。区引入半胱氨酸残基，从而在该区域形成链间二硫键。由此产生的同型二聚抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体-介导的细胞杀伤以及抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)，参见 Caron 等的 J Exp Medl76:1191-1195 (1992)和 Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993)。或者，可改造具有两个F。区的抗体，因而该抗体可具有增强的补体裂解和ADCC能力，参见Stevenson 等的 Ant1-Cancer Drug Design3:219230 (1989)。
[0081]抗体的共价修饰涵盖在本发明的范围内。可通过化学合成或通过抗体的酶切割或化学切割(如果可行的话)实现这一点。通过抗体的靶向氨基酸与有机衍生试剂发生反应，可向抗体分子引入抗体的其它类型的共价修饰，其中有机衍生试剂可与所选侧链或与N端或C端残基反应。
[0082]半胱氨酰残基可与α -卤代乙酸酯(以及相应的胺)例如氯乙酸或氯乙酰胺发生反应，生成羧甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基还可通过例如与溴三氟丙酮、α -溴-β - (5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡唳二硫化物、对氯萊苯甲酸盐、2-氯萊-4-硝基苯酌 或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3- 二唑反应进行衍生化。
[0083]组氨酰残基可通过与焦碳酸二乙酯在ρΗ5.5-7.0下反应进行衍生化。还可使用对-溴苯甲酰基溴，该反应优选在ΡΗ6.0的0.1M 二甲胂酸钠中进行。
[0084]赖氨酰和α末端残基可与琥珀酸或其它羧酸酐发生反应，以逆转残基的电荷。用于衍生化含有α-氨基的残基的其它适宜试剂包括亚氨酸酯例如甲基吡啶亚氨酸甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲和2，4-戊二酮，氨基酸可被转氨酶以乙醛酸催化。
[0085]可通过与一种或多种常规试剂例如苯甲酰甲醛、2，3- 丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮反应来修饰精氨酰残基。精氨酸残基的衍生化通常需要碱性反应条件。而且，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸的ε-氨基发生反应。
[0086]可使用芳香族重氮化合物或四硝基甲烷进行酪氨酰残基的特异修饰。例如，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别形成O-乙酰酪氨酰类和3-硝基衍生物。使用125I或131I可碘化酪氨酰残基以制备用于放射免疫分析的标记蛋白。
[0087]通过与碳二亚胺(R-N = C = C-R’)反应，羧基侧链基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)可被修饰，其中R和R’可为不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮错-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，天冬氨酰和谷氨酰残
基通过与铵离子反应可 被转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
[0088]谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基常在中性或碱性条件下被脱酰胺，分别生成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基脱去酰胺的形式落在本发明的范围以内。
[0089]其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(Creighton, Proteins: Structure andMolecular Properties, ff.H.Freeman & C0., San Francisco, pp.79-86 (1983))、N 端氨基的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。
[0090]另一类型的共价修饰涉及通过化学方式或酶催化方式将配糖体偶联到抗体上。这些方法不需要在具有N-连接或O-连接的糖基化能力的宿主细胞内产生抗体。根据所使用的偶联方法，糖可被连接到:(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，例如半胱氨酸的巯基；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(e)芳香残基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸残基；或(f)谷氨酰胺的酰氨基。WO 87/05330和Aplin &ffriston, CRC Crit Rev Biochem, pp.259-306(1981)叙述了这类方法。
[0091]可通过化学或酶催化方式除去位于抗体上的任何碳水化合物部分。例如化学去糖基化需要抗体与化合物三氟甲磺酸或等效的化合物接触，从而导致除连接糖基(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)以外的多数或全部糖基的切割，并保持抗体的完整性。例如 Hakimuddin 等的 Arch Biochem Biophys259:52 (1987)和 Edge 等的Anal Biochemll8:131 (1981)叙述了化学去糖基化。可通过例如Thotakura等的MethEnzymol 138:350(1987)所述的许多内切糖苷酶和外切糖苷酶中的任何一种实现抗体上碳水化合物部分的酶催化切割。[0092]另一类型的抗体共价修饰包括依据美国专利4，640, 835,4, 496，689,4, 301, 144、4，670，417,4, 791，192或4，179，337所述相同的方式，将该抗体连接到许多非蛋白质聚合
物例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯类的一种。
[0093]获得突变体或突变蛋白质的另一种优选技术是通过噬菌体展示进行亲和力成熟(Hawkins 等的 J Mol Biol254:889-896 (1992)和 Lowman 等的 Biochemistry30 (45): 10832-10838 (1991))。简而言之，突变几个高变区位点(例如6_7个位点)，得到每个位点所有可能的氨基酸取代。依此得到的抗体突变体作为噬菌体颗粒上的融合蛋白以单价形式展示于噬菌体颗粒上。表达各种突变体的噬菌体可经历多轮结合选择，随后对展示出高亲和力的突变体进行分离和测序。
[0094]选择新结合多肽的方法可使用结构相关多肽的库。通过诱变产生与例如噬菌体外壳蛋白融合的结构相关多肽的库，并将其展示在颗粒表面。随后这些颗粒与靶分子接触。将对靶分子具有最高亲和力的颗粒从低亲和力的颗粒中分离出来。随后通过感染适宜的细菌宿主来扩增高亲和力的结合颗粒，并重复竞争性结合步骤。重复该过程，直至得到所需亲和力的多肽。
[0095]或者，还可使用多价卩遼菌体(McCafferty等(1990) Nature348:552-554和Clackson等的(1991)Nature352:624-628)来表达随机点突变(例如通过使用易错DNA聚合酶生成的)，以生成噬菌体抗体片段的库，并随后筛选该库对CXCR5的亲和力(Hawkins等(1992) JMol Biol254:88 9-896)。
[0096]优选情况下，在亲和力成熟过程中，可复制的表达载体处于转录调节元件的严密调控下，调节培养条件使得展示一个以上融合蛋白拷贝的颗粒的量或数目小于约I %。同样在优选情况下，展示一个以上融合蛋白拷贝的颗粒的量小于展示单拷贝融合蛋白的颗粒的量的10%。优选该量小于20%。
[0097]通过互换不同抗体链的框架区内或源自多个抗体的复合FR的不同⑶R，可产生功能等效物。因此对于一组特定的⑶R而言，通过取代不同的重链例如IgG1+ ,IgMagA1^2或IgD，不同种类的抗体有可能生成不同的CXCR5抗体类型和亚型。与之类似，通过将一组特定CDR植入整个合成的框架区内，可产生位于本发明范围内的人工抗体。
[0098]例如，从效应物功能下降的IgG4分子可得到携带可变区或一个或多个目的⑶R的适宜框架区和F。部分。
[0099]在其它实施方案中，为了增强结合CXCR5的目的分子的性质，可对携带目的分子抗原结合部分的分子框架部分和/或F。部分进行某些修饰。例如，可进行氨基酸取代以增强或降低目的性质。因此，在IgG4分子中已知可影响功能的位点例如铰链区以及影响效应物功能或影响F。结合的区域的取代适合于进行修饰。可使用Kabat编号在氨基酸 225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255 等处或它们的组合对 IgG4 分子进行取代，以获得所需性质。例如，使用脯氨酸取代丝氨酸241可稳定分子的三级和四级结构(Mol Imm30⑴105-108，1993)，使用谷氨酸取代亮氨酸248可削弱效应物功能(JImml64 (4) 1925-1033，2000 ；以及 Clin Imm98 (2) 164-174，2001)。
[0100]另一有利性质是获得结合CXCR5但例如却不损耗B细胞的抗体衍生物。这在患者的抗体生成没有受损时是有利的。使用该试剂处理还便于使用联合疗法，其中针对某一特定适应症的第二药物作用于B细胞以外的水平。例如可以是在T细胞水平。
[0101]因此，例如处理16D7-HC1-LC3以包含两个取代S241P和L248E。脯氨酸和谷氨酸残基赋予结合CXCR5且携带IgG4框架区的目的分子的所需性质，例如稳定性和降低的效应物功能。
[0102]本发明的抗体片段和功能等效物包括其特异结合CXCR5的程度可检测的分子。可检测程度的结合包括目的抗体的结合能力为至少10-100%范围内的所有值，优选为至少50%、60%或70%，更优选为至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。具有大于目的抗体
100%亲和力的等效物也包括在内。
[0103]一般而言⑶R对于表位识别和抗体结合是重要的。但是，可对组成⑶R的残基进行变动，而不干扰抗体识别和结合同源表位的能力。例如，可进行不影响表位识别但却增加抗体对表位的结合亲和力的变动。基于对主要抗体序列的了解，几项研究调查了向抗体序列多个位点引入一个或多个氨基酸变动后对抗体性质的作用，例如结合和表达水平(Yang等的 1995，JMol Biol254:392-403 ;Rader 等的 1998, Proc Natl Acad Sci USA95:8910-8915 ；和 Vaughan 等的 1998, Nature Biotechnologyl6, 535-539)。
[0104]因此，使用方法例如寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组或大肠杆菌的突变株来改变重链和轻链基因的CDR1、CDR2或CDR3或框架区的序列，可生成目的抗体的等效物(Vaughan等的1998，Nat Biotechl6:535-539 ；和Adey等的1996, Chap.16, pp.277-291，in Phage Display of Peptides and Proteins, eds.Kay 等，Academic Press)。改变主要抗体核酸序列的方法可导致抗体的亲和力提高(Gram等的 1992，Proc Natl Acad Sci USA89:3576-3580 ；Boder 等的 2000，Proc Natl Acad SciUSA97:10701-10705 ；D avies & Riechmann, 1996, Tmmunotech2:169-179 ；Thompson 等的1996，JMol Biol256:77-88 ;Short等的2002，J Biol Chem277:16365-16370 JPFurukawa等的 2001，J Biol Chem276:27622-27628)。
[0105]通过例如选择历经多轮选择的多个氨基酸变化，可使用重复循环的“多肽选择”以选择越来越高的亲和力结合。第一轮选择后可对配体的其它区域或氨基酸进行其它轮次的选择，其中第一轮选择涉及对配体或抗体多肽的首个氨基酸区域进行选择。重复多轮选择，直到实现所需的亲和力性质。
[0106]改良抗体还包括具有改良特征的抗体,它们通过动物免疫、杂交瘤形成和选择具有特异特征的抗体等标准技术制备。
[0107]“拮抗剂”是指抑制靶点分子一种或多种生物活性(例如通过CXCR5的信号转导)的分子。拮抗剂通过灭活或杀灭被配体活化的细胞和/或干扰受体或配体活化(例如酪氨酸激酶活化)或干扰配体结合到受体后的信号转导，可干扰受体结合到配体，并且反之亦然。所述拮抗剂可完全阻断受体-配体的互相作用，或实质降低这种互相作用。出于本发明的目的，拮抗剂的所有干扰位点均被视为等价的。因此，包括在本发明范围内的拮抗剂是:结合CXCR5、CXCL13、或CXCR5的其它配体、或CXCR5与其配体例如CXCL13的复合物的拮抗剂(例如中和抗体)；拮抗CXCR5和配体例如CXCL13的互相作用的CXCR5或CXCL13的氨基酸序列的变异体或衍生物；任选地与异源分子例如免疫球蛋白区域(例如免疫粘附素)融合的可溶性CXCR5 ;包含CXCR5与另一受体或生物分子的复合物；结合CXCR5的合成或天然序列肽等。[0108]“激动剂”是指包括能激活CXCR5 —种或多种生物活性的蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段、缀合物、大分子、小分子等的化合物。激动剂可作为被配体活化的细胞的分裂原和/或在配体结合到受体后干扰细胞失活或信号转导抑制，从而与受体对配体的结合发生互相作用，反之亦然。出于本发明的目的，激动剂的所有干扰位点均被视为等价的。因此，包括在本发明范围内的激动剂是:结合CXCR5、CXCL13、或CXCR5的其它配体、或CXCR5与其配体例如CXCL13的复合物的激动剂；促进CXCR5和配体例如CXCL13互相作用的CXCR5或CXCL13氨基酸序列的变异体或衍生物；任选地与异源分子例如免疫球蛋白区域(例如免疫粘附素)融合的可溶性CXCR5 ;包含CXCR5与另一受体或生物分子的复合物；结合CXCR5的合成或天然序列肽等。激动剂一般是直接激活CXCR5进行例如信号转导的实体。
[0109]术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”包括它们的后代。还应理解，由于有意或无意的突变，所有的后代不一定精确相同，例如DNA含量。包括具有相同目的功能或生物性质的各种后代，其中目的功能或生物性质用于筛选原始细胞。本发明所使用的“宿主细胞”一般是选择用于设计的原核或真核宿主。
[0110]使用核酸“转化”细胞生物体、细胞或细胞系是指向靶细胞引入一段核酸，使得该核酸作为染色体外的元件或经染色体整合后可进行复制，以及任选地进行表达。使用核酸“转染”细胞或生物体是指细胞或生物体吸收该核酸，例如表达载体，而不论是否有任何编码序列实际上被表达。术语“转染的宿主细胞”和“转化的”是指引入了一段核酸的细胞。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌的各种菌株。典型的真核宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞或来源于人的细胞。被引入的核酸序列可来自与宿主细胞相同或不同的物种，或者可为杂交核酸序列，其含有一些外源核酸和一些同源核酸。还可通过转导或用源自病毒的组件感染进行转化。
[0111]术语“载体”是指核酸构建体、载体，其含有核酸、转基因、外源基因或目的基因，它们被可操作地连接到适宜的调控序列以便在适宜的宿主内进行转基因的表达。这类调控序列包括例如影响转录的启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码适宜HiRNA核糖体结合位点的序列以及调控转录和翻译终止的序列。载体可为质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦被转化到适宜的宿主体内，载体可独立于宿主的基因组进行复制和发挥功能，或在某些场合下可整合到宿主细胞的基因组中。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体常见的使用形式。但是，本发明意图包括发挥等效载体功能的其它形式的载体，它们已经或正在为本领域所知晓，例如病毒、携带核酸的合成分子、脂质体等。
[0112]就治疗而言，“哺乳动物”是指可被归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜和农场动物、人类以外的灵长类和动物园动物、竞技动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。
[0113]可在本文所述或本领域已知的试验中筛选或使用目的抗体。这类试验通常需要可检测的试剂，例如被标记的试剂。本文所使用的词语“标记”是指可直接或间接结合到分子或蛋白例如抗体上的可检测化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记、颗粒或荧光标记)，或就酶标记而言，可催化底物化合物或组合物发生能被检测的化学变化。
[0114]正如本文所使用，“固相”是指实体或分子例如本发明所述抗体可粘附于其上的非水基质。本文所包括的固相实例包括部分或全部由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮形成的固相。在一些实施方案中，根据语境，所述固相可包括分析板的孔；在其它情况下可用于纯化柱(例如亲和层析柱)。因此，所述固相可以是纸、珠、塑料、芯片等，可由许多材料例如硝化纤维素、琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、硅等制备，还可采取多种构型。
[0115]可溶性CXCR5或其片段例如胞外区域(EC)可用作免疫原，产生目的抗体。可从天然来源获得或分离免疫原，或可通过重组方式制备免疫原。全细胞例如CXCR5+细胞,天然来源的细胞(例如B细胞、B细胞系或癌细胞系)或经重组技术转化(或转染)以表达以及可能过表达CXCR5的细胞，都可用作生产目的抗体的免疫原。同样,可使用本领域已知的携带CXCR5或对应于CXCR5的EC区域的合成肽或截短多肽的膜制备物。
[0116]CXCR5长约60个氨基酸的EC或EC的部分可用作免疫原。可用于制备抗体的其它形式免疫原例如缀合物，是本领域技术人员显而易见的。因此，CXCR5或其部分可被连接到载体分子例如白蛋白或KLH上以用作免疫原。当然，对于表达CXCR5的细胞，EC区域是优选的免疫原或该免疫原的部分。
[0117]依据本领域技术人员熟知的方法或例如参见下文的方法，本领域已知的编码CXCR5的基因或cDNA可被克隆到质粒或其它表达载体中，并在众多表达体系的任意一种中进行表达。由于遗传密码的简并性，进行重组CXCR5或其功能产物的表达时，可使用多个编码CXCR5蛋白或多肽的核苷酸序列。基于可能的密码子选择，例如宿主细胞所优选的密码子，通过选择组合可以变动所述核苷酸序列。依据适用于编码天然CXCR5的核苷酸序列的标准三联体遗传密码， 可进行这些组合，而且可考虑所有这些变动。因此，编码CXCR5的序列可被重新编码，以含有表达目的氨基酸的密码子，但三联体密码子是宿主细胞例如人细胞的基因表达装置所偏爱的密码子。这些多肽中的任意一条可用于免疫动物例如骆驼或其它体系，以产生结合CXCR5的抗体。
[0118]正如上文所提及，在有利时，CXCR5免疫原可表达为融合蛋白，其中CXCR5被连接到融合片段，该融合片段一般是具有一个或多个有利功能的多肽。融合片段通常有助蛋白纯化，例如通过亲和层析分离和纯化融合蛋白，但也可用于增加免疫原性。使用编码连接到CXCR5多肽的羧基端和/或氨基端的蛋白质的融合核酸序列转化重组细胞，经培养该重组细胞可产生融合蛋白。融合片段可包括但不限于免疫球蛋白F。区域、谷胱甘肽-S-转移酶、β -半乳糖苷酶、可结合双价金属离子的多聚组氨酸片段和麦芽糖结合蛋白。
[0119]编码氨基酸序列突变体的核酸分子可通过许多本领域已知的方法进行制备。这些方法包括但不限于对先前制备的目的分子突变体或非突变体进行的寡核苷酸-介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变(参见例如Kunkel，Proc Natl Acad SciUSA82:488(1985)) ο
[0120]本发明抗体或其片段、衍生物或类似物(例如本发明抗体的重链或轻链、本发明的单链抗体或本发明的抗体突变蛋白质)的重组表达包括构建含有编码本文所述的抗体或抗体片段的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码抗体分子的多核苷酸，可通过本领域公知的重组DNA技术产生用于生产所述抗体的载体。构建含有抗体编码序列和适宜的转录和翻译调控信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。
[0121 ] 通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞体内，随后通过常规技术培养被转染的细胞，以产生本发明的抗体或片段。在本发明的一个方面，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞内共表达，以表达本文详述的完整的免疫球蛋白分子。
[0122]可使用许多宿主/表达载体体系来表达本发明的抗体分子。这些表达体系不仅代表可产生和随后纯化目的编码序列的载体，还代表了以适宜核苷酸编码序列转化或转染后可原位表达本发明抗体分子的细胞。细菌细胞例如大肠杆菌和真核细胞常用于重组抗体分子的表达，尤其是用于全长重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞例如CHO细胞与例如携带来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件的载体是抗体的有效表达体系(Foecking 等的 Gene45:101 (1986);和 Cockett 等的 Bio/Technology8:2 (1990))。正如本领域所知，还可使用植物和植物细胞培养、昆虫细胞等来生产目的蛋白。
[0123]此外，选择可调节插入序列表达或以所需的特异方式修饰和加工基因产物的宿主细胞。蛋白产物的这些修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于蛋白功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白质及基因产物翻译后加工和修饰的特有和特异机制。可选择适宜的细胞系或宿主体系，以确保所表达的目的抗体的正确修饰和加工。因此，可使用拥有用于主要转录物适宜加工、基因产物糖基化和磷酸化的细胞装置的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主 细胞包括但不限于CH0、C0S、293、3T3或骨髓瘤细胞。
[0124]稳定表达对于长期高产率生产重组蛋白而言是优选的。例如可改造稳定表达抗体分子的细胞系。除了使用含有病毒复制起点的表达载体，可使用受到适宜表达调控组件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点等)调控并具有选择性标记的DNA转化宿主细胞。引入外源DNA后，可让被改造的细胞在富集培养基上生长I至2天，随后将其转移至选择性培养基上。重组质粒的选择性标记赋予对选择的抗性，使得细胞将质粒稳定整合到其染色体上，并在细胞系中扩增质粒。这些改造的细胞系不仅可用于抗体制备，还可用于筛选和评估直接或间接与抗体分子互相作用的化合物。
[0125]可使用许多选择体系，其包括但不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等的Cellll:223 (1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska等的Proc NatlAcad Sci USA48:202 (1992))、谷氨酸合成酶在蛋氨酸磺酰亚胺的存在下选择(Adv DrugDel Rev58, 671，2006 并参见 Lonza Group Ltd.的网站或文献)以及 tk、hgprt 或 aprt细胞中的腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Lowy等的Cell22:817 (1980))。同样，可使用抗代谢物的抗性作为选择下列基因的基础:dhfr,其赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler等的ProcNatl Acad Sci USA77:357 (1980) ;O，Hare 等的 Proc Natl Acad Sci USA78:1527 (1981))；gpt,其赋予霉酌.酸抗性(Mulligan 等的 Proc Natl Acad Sci USA78:2072 (1981)) ；neo,其赋予氨基糖苷G-418抗性(Wu等的Biotherapy3:87(1991));以及hygro,其赋予潮霉素抗性(Santerre等的Gene30:147 (1984))。可常规应用重组DNA【技术领域】已知的方法来选择所需的重组克隆，这些方法的描述见于例如Ausubel等编辑，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993) ；Kriegler, Gene Transfer andExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990) ；Dracopoli 等的 eds., CurrentProtocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994);和 Colberre-Garapin 等的 J MolBioll50:l(1981)。
[0126]通过载体扩增可增加抗体分子的表达水平(例如参见Bebbington等的DNACloning, Vol.3.Academic Press (1987))。当表达抗体的载体体系中的标记物可扩增时,培养物中抑制剂水平的升高会增加标记物基因的拷贝数目。由于被扩增区域与抗体基因有关联，抗体的产生也会上升(Crouse等人，Mol Cell Biol3:257 (1983))。
[0127]可使用本发明的两种或多种表达载体对宿主细胞进行共转染，例如第一载体编码源自重链的多肽，而第二载体编码源自轻链的多肽。这两个载体可含有相同的选择标记物，这些标记物可使重链和轻链多肽的表达相同。或者，可使用编码并可同时表达重链和轻链多肽的单个载体。在这种情况下，轻链应置于重链之前，以避免产生过多的无毒性的重链(Proudfoot, Nature322:52(1986);和 Kohler, Proc Natl Acad Sci USA77:2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。
[0128]一旦通过动物、化学合成或重组表达产生本发明的抗体分子，可通过本领域已知的任何纯化免疫球蛋白分子的方法，例如层析(例如离子交换、亲和层析等，尤其是经蛋白质A和分子排阻层析后对CXCR5进行亲和层析)、离心、溶解度差异或通过蛋白纯化的任何其它标准技术纯化抗体分子。此外，本发明所述抗体或抗体片段可与本文所述的异源多肽序列或本领域已知的其它多肽序列融合，以便于纯化。
[0129]使用下文实施例所例示的重组CXCR5蛋白来免疫小鼠，生成可产生本发明单克隆抗体的杂交瘤。选择具有良好治疗潜力的所得单克隆，例如防止CXCR5配体结合于CXCR5的单克隆。随后修饰所选择的抗体，以得到有利的性质，例如具有增强的体内稳定性。
[0130]可通过本领域已知的任何适宜方法生成本发明所述抗体。本发明所述抗体可包括多克隆抗体，尽管由于进行抗体修饰以优化其在人体内的使用以及优化抗体本身的使用，但单克隆抗体仍是优选的，这是因其生产和操作特定蛋白方便。制备多克隆抗体的方法为本领域技术人员所知晓(Harlow 等的 Antibodies:a Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press,第 2 版(1988))。 [0131]例如，可将本文所例示的免疫原施用给各种宿主动物，其包括但不限于兔、小鼠、骆驼、大鼠等，以诱导产生含特异识别CXCR5的多克隆抗体的血清。施用免疫原需要一次或多次注射免疫剂和佐剂(若需要的话)。根据宿主物种，可使用各种佐剂来增加免疫反应，其包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物油、凝胶、明矾(氢氧化铝)、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇类(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油状乳液、钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)、二硝基苯酚和可有效使用的人佐剂，例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。可使用的佐剂的其它实例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A,合成的海藻糖双棒霉酹酸酯(trehalose dicorynomycolate)。免疫实验方案为本领域所熟知，它们可通过在所选择的宿主体内引发免疫反应的任何方法进行。因此，在不同的时间段内可设计使用不同的给药途径。
[0132]一般情况下，通过多次皮下或腹腔注射或肌肉注射或静脉注射将免疫原(带有或不带佐剂)注射到哺乳动物体内。免疫原可包括CXCR5多肽、融合蛋白或它们的变异体，它们可由产生或过产生CXCR5的细胞产生。这些细胞可为天然存在的细胞、天然存在的突变体细胞或遗传改造细胞。在某些情况下，可使用表达CXCR5的全细胞。根据多肽的性质(即疏水比例、亲水比例、稳定性、净电荷、等电点等)，CXCR5或其部分可被修饰或结合，以在被免疫动物例如哺乳动物体内产生免疫原性或更强的免疫原性。例如，CXCR5或其部分可与载体结合。所述结合包括将活性化学官能团连接到免疫原和待结合的免疫原性蛋白从而形成共价键的化学缀合，或基于融合蛋白的方法学或本领域技术人员知晓的其它方法。这类载体或免疫原蛋白的实例包括但不限于KLH、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂和混杂的T辅助细胞肽。可使用各种佐剂增加上文所述的免疫反应。
[0133]一旦得到适宜的制剂，有可能通过已知分离技术例如亲和层析、淘选、吸附等从多个抗体中分离出特定的抗体。以这种方式，可获得用于进一步研究(例如测序以获得一个或多个CDR的氨基酸序列)的单个抗体种类。
[0134]本发明所述抗体优选地包括单克隆抗体。可使用例如由Kohler等的Nature256:495 (1975);美国专利 4, 376, 110 ；Harlow 等的 Antibodies: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.(1988)和 Hammerling 等的Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981)描述的杂交瘤技术、重组DNA方法例如制备和使用转染瘤或为技术人员知晓的其它方法制备单克隆抗体。可用于产生单克隆抗体的方法的其它实例包括但不限于人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等的Immunology Today4:72 (1983)；和 Cole 等的 Proc Natl Acad Sci USA80:2026 (1983))和EBV-杂交瘤技术(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96，AlanR.Liss (1985))。这些抗体可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD的任何免疫球蛋白类和其任何亚类的抗体。可在体外或体内培养产生本发明mAb的杂交瘤。
[0135]在杂交瘤模型中，对宿主例如小鼠、人源化小鼠、携带人免疫系统基因的转基因小鼠、仓鼠、兔、大鼠、骆驼或其它任何适宜的宿主动物进行免疫，以引发产生或可产生特异结合CXCR5的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。随后使用适宜的融合剂例如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103 (1986))。 [0136]一般而言，制备产生抗体的杂交瘤时，如果希望细胞为人类来源的，可使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或如果希望细胞为非人类来源的，则可使用脾脏细胞或淋巴结细胞。永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿类、牛或人来源的骨髓瘤细胞。一般使用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。可在适宜的培养基上培养杂交瘤细胞，该培养基优选含有可抑制未融合的永生细胞生长或生存的一种或多种物质。例如，如果母体细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基一般会含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)和防止HGPRT缺陷的细胞生长的物质。
[0137]优选的永生细胞系是有效融合并支持所选择的产生抗体的细胞能稳定高水平表达抗体的细胞系，并且对培养基例如HAT培养基敏感。这些骨髓瘤细胞系中有鼠骨髓瘤系，例如源自可从 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif 获得的MOPC-21和MPC-1l小鼠肿瘤和可从美国典型培养物收藏中心，Manassas, VA获得的SP2/0、FO 或 X63-Ag8-653 细胞。
[0138]还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984)；和 Brodeur 等的 Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp.51-63 (1987))。还可使用小鼠骨髓瘤细胞系 NSO(European Collection of Cell Cultures, Salisbury, ffilshire, UK)。
[0139]另外一种选择是使用电融合而非化学融合来形成杂交瘤。可使用例如EpsteinBarr病毒或其它转化基因而非融合,使B细胞永生化,例如参见Zurawaki等的MonoclonalAntibodies, ed., Kennett 等人,Plenum Press, pp.19-33.(1980)。还可使用表达免疫球蛋白的转基因小鼠和移植有人B淋巴细胞的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。
[0140]分析生长有杂交瘤细胞的培养基是否产生识别CXCR5的单克隆抗体。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定例如放射免疫分析(RIA)、荧光激活细胞分选术(FACS)或酶联免疫吸附分析(ELISA)测定杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。这些技术为本领域已知，并在技术人员的知识范围之内。可通过例如Scatchard分析(Munson等的AnalBiocheml07:220(1980))测定单克隆抗体对CXCR5的结合亲和力。
[0141]鉴定杂交瘤细胞所产生抗体的所需特异性、亲和力和/或活性后，这些克隆可通过有限稀释方法进行亚克隆，并按标准方法进行培养(Goding, MonoclonalAntibodies !Principles and Practice, Academic Press, pp.59-103 (1986)。适宜培养基包括例如达尔伯克改良伊格尔培养基(D-MEM)或RPM1-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可作为腹水肿瘤在动物体内生长。
[0142]亚克隆分泌的单克隆抗体通过常规免疫球蛋白纯化方法例如蛋白质A-琼脂糖、蛋白质G-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中被适宜地分离。
[0143]本领域存在许多用于产生单克隆抗体的方法，因此本发明不局限于它们仅在杂交瘤中的制备。例如,可通过重组DNA方法例如美国专利4，816，567所述的方法制备单克隆抗体。在这种情况下 ，术语“单克隆抗体”是指源自单个真核生物、噬菌体或原核生物克隆的抗体。
[0144]使用常规方法(例如使用可特异结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针或使用可特异结合编码来自人、人源化或其它来源抗体的重链和轻链基因的寡核苷酸探针)，可容易地分离和测序编码本发明所述单克隆抗体的DNA(Innis等的PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications, Academic (1990)和 Sanger 等的 Proc Natl AcadSci74:5463 (1977))。杂交瘤细胞作为这类DNA的来源。分离后，所述DNA可被置于表达载体中，随后表达载体被转染到本身不产生免疫球蛋白的宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、NSO细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组的宿主细胞体内获得单克隆抗体的合成。还可通过例如用人重链和轻链恒定区编码序列替换同源的鼠序列(美国专利 4，816，567 JPMorrison 等的 Proc Natl Acad Sci USA81:6851 (1984))或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列，从而对所述DNA进行修饰。这些非免疫球蛋白多肽可被替换为本发明抗体的恒定区，或可被替换为本发明抗体的一个CXCR5结合位点的可变区，以形成嵌合的二价抗体。
[0145]这些抗体可为单价抗体。用于制备单价抗体的方法为本领域所熟知。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达。重链一般在F。区的任意位点被截短，以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基可被另一氨基酸残基取代或被删除，以防止交联。
[0146]可通过已知技术生成识别特异表位的抗体片段。传统上通过完整抗体的蛋白裂解消化得到这些片段(例如参见 Morimoto 等 J Biochem Biophys Methods24:107 (1992)；和Brennan等Science229:81(1985))。例如，使用酶例如木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab，)2片段)对免疫球蛋白分子进行蛋白切割，可产生本发明的Fab和？(‘)2片段。匕&^片段含有可变区、轻链恒定区和重链的恒定区Chi域。但是可直接通过重组的宿主细胞产生这些片段。例如，这些抗体片段可从抗体噬菌体库分离得到。或者，F(ab，)2-SH片段可直接从大肠杆菌中回收并通过化学方式偶联形成F(ab’)2片段(Carter等的Bio/TechnologylO: 163 (1992))。根据另一方法，F(ab, )2片段可直接从重组的宿主细胞培养物中分离得到。产生抗体片段的其它技术对于本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(Fv) (WO 93/16185)。
[0147]对于某些用途、包括人体内使用抗体和体外检测试验而言，可优选使用嵌合的人源化或人抗体。产生嵌合抗体的方法为本领域所知晓，例如参见Morrison, Science229:1202 (1985) ；0i 等的 BioTechniques4:214 (1986) ；Gillies 等的 JImmunol Methodsl25:191 (1989);和美国专利 5，807，715 ；4, 816，567 以及 4，816397。
[0148]人源化抗体源自在非人类物种体内生成的可结合CXCR5的抗体分子，其中来自结合CXCR5的抗体的一个或多个CDR被插入到来自人免疫球蛋白分子的FR区。使用许多本领域已知的技术例如CDR移植(EP0239，400 ；W0 91/09967 ;和美国专利 5，225，539 ;5，530，101 ;以及 5，585，089)、镶饰或表面重塑(ΕΡ0 592，106 ；ΕΡ0519, 596 ；Padlan,Molecular Immunology28:489(1991) ；Studnicka 等的 ProteinEngineering?: 805 (1994);和 Roguska 等的 Proc Natl Acad Sci USA91:969 (1994))以及链改组(美国专利5，565，332)，可将抗体人源化。
[0149]人源化抗体具有一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。这些非人类的氨基酸残基通常被称作“导入”残基，它们一般取自“导入”的可变区。依据Winter及其同事等人的方法(Jones 等的 Nature321:522 (1986) ;Riechmann 等的 Nature332:323 (1988)和Verhoeyen等的Science239:1534 (1988))，通过以非人类的Q)R或⑶R序列的部分替换人抗体的相应序列，可基本上完成人源化。因此，这些”人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4，816，567)，其中实质上小于完整的人可变区的序列已被来自非人类物种的相应序列所取代。实践中，人源化抗体一般是人抗体，其中一些CDR残基和可能部分FR残基被啮齿动物抗体的类似位点所取代。可包括一个或多个重链结构域的重链恒定区和铰链区可来自任何种类或亚类，以获得所需效应，例如特定的效应物功能。
[0150]通常，人框架区的框架残基可被来自CDR供体抗体的相应残基替换，从而改变并有可能提高抗原结合。框架取代可通过本领域已知方法进行鉴定，例如建立CDR与框架残基互相作用的模型来鉴定参与抗原结合的重要框架残基，以及经序列比较以鉴定特定位置处的非正常框架残基，例如参阅美国专利5，585，089和Riechmann等的Nature332:323(1988)。
[0151]更为优选的是，人源化抗体保留对CXCR5的高亲和力，并且保留或获得其它有利的生物学性质。因此，利用母体序列和人源化序列的三维模型，通过分析母体序列和各种概念性的人源化产物，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可为本领域技术人员利用和熟知。可利用图示和展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。参考此展示，可分析某些残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合CXCR5能力的残基。通过此种方式，可从接收和导入序列选择和合并FR残基，使得所需抗体特性得到最大化，例如增加对靶点抗原的亲和力，但是CDR残基是直接并最实质性地影响CXCR5结合的。还可修饰CDR区域，使其含有一个或多个与得自亲代抗体(CDR得自亲代抗体)氨基酸不同的氨基酸，以提供增强的或不同的目的性质，例如更高的亲和力或亲合力。[0152]可操作和改变抗体恒定区的某些区域，以提供具有不同与或优于亲代抗体性质的抗体同源物、衍生物、片段等。因此，例如许多IgG4抗体在铰链区附近形成链内二硫键。链内二硫键可使母体双价分子变得不稳定，形成含有一条重链及与之相连轻链的单价分子。这类分子可重新结合，但为随机结合。
[0153]经观察，修饰IgG4分子铰链区的氨基酸可降低链内二硫键形成的几率，从而稳定IgG4分子，这将最大程度降低双特异性分子形成的几率。若治疗用抗体是IgG4分子，则这种修饰是有利的，这是因为稳定性增强可最大程度降低分子在生产和制备过程中以及在体内的解离几率。单价抗体可能不具有与双价母体分子相同的有效性。例如，当将双价IgG4施用给患者时，双价IgG4的比例在两周内衰变为约30%。位点228的氨基酸取代增强了IgG4稳定性。位于位点228的丝氨酸可为另一氨基酸替换，例如其余19种氨基酸中的一种。尤其可对重组抗体作出这种变动，其中核酸编码序列经突变可得到228位点处的氨基酸取代。例如S可被替换为脯氨酸。
[0154]另一组适合修饰的氨基酸包括铰链区域的氨基酸，这些氨基酸影响含有重链的分子与F。受体之间的结合和被结合抗体的内化。这类氨基酸包括IgGl分子中从约233至约 237 的残基(Glu-Leu-Leu-Gly-Gly) ； (SEQ ID NO:49)中从约 252 至约 256 的残基(Met-1le-Ser-Arg-Thr)和(SEQ ID NO:50)中从约 318(Glu)至约 331(Pro)的残基，例如包括 Lys32。、Lys322 和 Pro329。
[0155]完全的人抗体特别适合于人类患者的治疗性处置。可通过许多本领域已知的方法制备人抗体，其中包括利用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库而进行的上述噬菌体展示方法，参阅美国专利 4，444，887 和 4，716，111 ；W098/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654，WO 96/34096, W096/33735 和 WO 91/10741。还可利用 Cole 等人和 Boerder 等人的技术制备人单克隆抗体(Cole 等的 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR.Liss (1985);和 Boerner 等的 J Tmmunol 147:86 (1991))。
[0156]还可使用转基因小鼠生产人抗体，这些小鼠不能表达有功能的内源免疫球蛋白，但也表达某些人免疫球蛋白基因。例如，可通过随机方式或同源重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物引入到小鼠的胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因以外，可将人的可变区、恒定区和多变区引入到小鼠胚胎干细胞中。通过同源重组引入人免疫球蛋白位点，可使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别或同时失去功能。具体而言，JH区的纯合缺失可防止内源抗体生成。被修饰的胚胎干细胞经扩增，被显微注射到胚泡中，形成嵌合小鼠。随后繁育嵌合小鼠，产生表达人抗体的纯合后代，例如参阅Jakobovitis等的Proc Natl AcadSci USA90:2551 (1993) ; Jakobovitis 等的 Nature362:255 (1993) ;Bruggermann 等的 Yearin Tmmunol 7:33 (1993);和 Duchosal 等的 Nature355:258 (1992))。
[0157]使用CXCR5 (例如所有或部分CXCR5，如CXCR5的EC区域)通过正常方式免疫转基因小鼠。利用常规杂交瘤技术可从被免疫的转基因小鼠得到抗CXCR5的单克隆抗体。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中发生重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，利用这种技术有可能产生治疗用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。如果想了解概况，可参阅Lonberg等的IntRev Immunol 13:65-93 (1995)。对于生产人抗体和人单克隆抗体以及生产这类抗体的试验方案的讨论，可参阅例如WO 98/24893 ；W0 92/01047 ；WO 96/34096 ；W0 96/33735 ；EP0 N0.0 598 877 ;和美国专利 5，413，923 ;5，625，126 ；5，633，425 ；5, 569，825 ；5, 661，016 ；5, 545，806 ；5, 814，318 ；5, 885，793 ；5, 916，771 以及
5,939, 598。此外，例如 Amgen (Fremont, CA)、Genpharm (San Jose, CA)和 Medarex, Inc.(Princeton, NJ)等公司利用与上述类似的技术可提供抗CXCR5的人抗体。
[0158]同样，可免疫移植有人外周血白细胞、脾细胞或骨髓(以色列XTLBiopharmaceuticals公司的三体杂交瘤技术)的小鼠，制备人mAb。可利用被称为“导向选择”的技术生成识别所选择表位的完全人抗体。在该方法中，使用经选择的非人类单克隆抗体如小鼠抗体来引导选择识别相同表位的完全人抗体(Jespers等的Bio/technologyl2:899(1988))。
[0159]使用重组技术时，抗体变异体可在细胞内、细胞周质空间内产生，或直接被分泌到培养基中。如果抗体变异体是在细胞内产生的，则可首先通过例如离心或超滤除去微小碎片，其是宿主细胞或是被裂解的片段。Carter等的Bio/Technology 10:163 (1992)描述了一种分离被分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简而言之，细胞糊浆与乙酸钠(PH3.5)和EDTA接触。可通过离心除去细胞碎片。当抗体变异体被分泌到培养基中时，一般首先利用市售的蛋白质浓缩过滤器如Amicon或Millipore Pellicon超滤组件浓缩来自这些表达体系的上清液。可加入蛋白酶抑制剂例如PMSF，以抑制蛋白酶解，还可加入抗生素以防止外来污染物的生长。
[0160]可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析，纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白质A或蛋白质G是否适合作为亲和配体取决于抗体变异体上任意免疫球蛋白F。域的物种和同型。可使用蛋白质A纯化基于人IgGl、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等的J Immunol Meth6 2:1 (1983))。可使用蛋白质G用于小鼠同型和人IgG3 (Guss等的EMBOJ5:1567 (1986))。亲和配体所结合的基质通常多数是琼脂糖，但也可使用其它基质。机械稳定的基质例如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可实现比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。当抗体变异体包括Ch3域时,可使用Bakerbond ABXTM树脂(JT Baker ；Phillipsburg, NJ)进行纯化。还可利用其它蛋白质纯化技术,例如离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、肝素琼脂糖层析、阴离子或阳离子交换树脂层析(例如多聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀，这取决于待回收的抗体或变异体。
[0161]进行任何初步纯化步骤后，含有目的抗体或目的变异体和污染物的混合物可进行低PH疏水作用层析，其中使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
[0162]而且，利用本领域技术人员所熟知技术，本发明抗体还可用于产生“模拟” CXCR5的抗独特型抗体(例如参阅Greenspan等的FASEB J7:437 (1989)和Nissinoff, JImmunol 147:2429 (1991))。例如，可使用与配体结合并竞争性抑制CXCR5多聚化和/或CXCR5与配体结合的抗体来产生“模拟”CXCR5和结合域并从而结合和中和CXCR5和/或其配体的抗独特型。这种中和性抗独特型或这些抗独特型的Fab片段可用于治疗方案，例如中和 CXCLl3。
[0163]本发明的抗体可为双特异性抗体。双特异性抗体可为单克隆抗体，优选为具有对至少两种不同抗原结合特异性的人或人源化抗体。在本发明中，结合特异性之一针对CXCR5，另一种可针对任何其它抗原，例如细胞表面蛋白、受体、受体亚基、配体、组织特异性抗原、病毒来源的蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌来源的蛋白、细菌表面蛋白等。因此另一特异性可以是结合CXCL13。
[0164]制备双特异性抗体的方法是众所周知的。传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein等的Nature305:537 (1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，杂交瘤(四体杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行正确分子的纯化。类似方法披露于WO 93/08829和Traunecker等的EMBOJlO:3655 (1991)。例如 Kufer 等的 Trends Biotech22:238-244，2004 提供了生产双特异性抗体的其它方法。
[0165]可将具有所需结合特异性的抗体可变区融合到免疫球蛋白的恒定区序列上。优选用包括至少部分铰链区、Ch2和Ch3区的免疫球蛋白重链恒定区进行融合。它可具有首个重链恒定区(Chi)，其含有至少在一次融合中出现的轻链接合所需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合区和免疫球蛋白轻链(若需要的话)的DNA插入到不同的表达载体，并共转化到适宜的宿主生物体内。对于产生双特异性抗体的更多细节，可参阅例如Suresh等的MethEnzyml21:210(1986)。
[0166]本发明也考虑了异源偶联抗体。异源偶联抗体由两个通过共价键连接的抗体组成。有人建议用这类抗体对准免疫系统细胞至不希望的细胞(美国专利4，676，980)。考虑该抗体可用合成蛋白化学的已知方法在体外制备，包括涉及交联剂的那些方法。例如，免疫毒素可用二硫化物交换反应或形成硫酯键的方式来构建。适合于该目的的试剂例子包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯，以及如美国专利4，676，980中所披露的那些。
[0167]此外，还可产生CXCR5的单域抗体。这种技术的某些例子已在W09425591有关源自骆驼重链Ig的抗体时有所叙述，在US20030130496有关从噬菌体文库分离单域完全人抗体时也有所叙述。
[0168]此外，某些生产单链抗体的技术(美国专利4，946，778;Bird, Science242:423 (1988) ；Huston 等，Proc Natl Acad Sci USA85:5879 (1988)；以及Ward,等，Nature334:544 (1989))也可适应于生产单链抗体。单链抗体是通过将Fv区域的重链和轻链片段以一个氨基酸桥连接生成一个单链多肽而形成的。大肠杆菌中的功能^片段的组合技术也可以利用(Skerra等，Science242:1038 (1988))。
[0169]本发明包括了与一个多肽重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)的抗体。本发明的融合或辍合的抗体可用于简化纯化，参阅例如W093/21232 ；EP 439, 095 ；Naramura 等，Tmmunol Lett39:91 (1994);美国专利 5, 474, 981 ；Gillies 等,Proc Natl AcadSci USA89:1428 (1992);以及 Fell 等，J Immunol 146:2446 (1991)。标记氨基酸序列可以是六个组氨酸的肽(SEQ ID NO: 51)，如pQE载体提供的标签(QIAGEN，Inc.，Chatsworth, CA)，此外，其中许多还可经商业渠道获得，Gentz等，Proc Natl Acad Sci USA86:821 (1989)。其它可用于纯化的多肽标签包括但不限于“HA”标签，它对应于一个源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson 等，Cell37:767 (1984))以及 “flag” 标记。
[0170]还可产生一种单肽链接合分子，其中重链和轻链Fv域相连。单链抗体(“scFv”)和它们的构建方法在例如美国专利4，946，778中有所叙述。或者，Fab可以类似方式构建和表达。与完全的鼠mAbs相比，所有完全和部分的人抗体均可具有较小的免疫原性，片段和单链抗体也可具有较小的免疫原性。[0171]抗体或抗体片段，可从用McCafferty等，Nature348:552 (1990)所述技术产生的抗体卩遼菌体文库分离。Clarkson等，Nature352:624(1991)和Marks等，J MolBiol222:581 (1991)分别叙述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体的技术。随后的出版物叙述了以链改组方式生产高亲和力(在nM的范围)的人抗体的方法(Marks等，Bio/TechnOlOgyl0:779(1992))，以及以组合感染和体内重组作为构建大型噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nucl Acids Res21:2265 (1993))。因此，这些技术是分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行的替代技术。
[0172]抗CXCR5抗体是用酶联免疫吸附分析(ELISA)、FACS、Western免疫印迹技术或本领域内已知的其它免疫化学技术检测的。因此，B细胞或表达CXCR5的细胞可以已知的技术用于检测与其结合的抗体，或者，作为一种设计选择，以重组方式表达的CXCR5或其一部分如EC区域可附着在固相上，用作试验中的捕获元件。
[0173]为了确定某种特定的抗体同源物是否与人类CXCR5结合，任何传统的结合测定均可应用。有用的CXCR5结合测定包括FACS分析、ELISA分析、放射免疫分析等方法，以检测抗体与人类CXCR5的结合以及由此而产生的功能。本文所教导的全长和可溶性人类CXCR5在这类分析中是有效的。抗体或同源物与CXCR5或其可溶性片段的结合，可以很方便地使用对该物种的免疫球蛋白具有特异性的二抗来检测，所检测的抗体或同源物源自上述物种。
[0174]为了确定某种特定的抗体或同源 物是否显著地阻断CXCL13或其它配体与人类CXCR5的结合，任何适宜的竞争性分析试验均可使用。有用的分析方法包括例如ELISA分析、FACS分析、放射免疫分析等，它们可定量分析抗体或同源物与CXCL13或其它配体竞争结合人CXCR5的能力。优选的是，测量配体阻断带标记的人类CXCR5与固定化的抗体或同源物结合的能力。
[0175]通过测定与人类CXCR5+细胞结合的能力，可以评估抗体或同源物与人类CXCR5结合的能力。在确定某种特定的抗体或同源物是否与人类CXCR5结合的过程中，适合使用的CXCR5+细胞是用编码全长人CXCR5的DNA转化并在细胞表面表达CXCR5的哺乳动物的组织培养细胞，或B细胞系。
[0176]抗体或同源物与CXCR5+细胞的结合可通过使用对同一物种的免疫球蛋白具有特异性的荧光标记的二抗对细胞染色来检测，所检测的抗体同源物源自上述物种。荧光激活细胞分选仪(“FACS”)可用于检测和量化任何类型的结合，一般性地参阅Shapiro, Practical Flow Cytometry, Alan R.Liss, Inc., New York, N.Y.(1985)。
[0177]同样，抗体同源物阻断配体如CXCL13与人类CXCR5结合的能力，可将过量配体与CXCR5+细胞一起预温育，并对结合的配体阻断抗体或同源物与该细胞结合的程度进行定量来确定。抗体同源物与CXCR5+细胞的结合可使用对同一物种的免疫球蛋白具有特异性的带荧光标记的二抗，通过FACS分析来量化，所检测的抗体同源物源自上述物种。或者，如本领域内公知，可使用带标记的配体或抗体进行竞争分析。
[0178]用于上述分析的配体如CXCL13可以从用该配体基因转化的细胞提供，或来自实施本文教导的方法所获得的或经商业购买的分离的CXCL13。
[0179]为了确定某种特定的抗体或同源物是否未引起体内循环的CXCR5+细胞数目的显著减少，在对具有正常免疫功能的哺乳动物施用抗体或同源物后24小时内，测定从该哺乳动物分离出的循环CXCR5+细胞的数目，并与施用前的数目比较，或与施用了具有不相关特异性的同型抗体或同源物而非本发明的抗体或同源物的对照哺乳动物体内的数目比较。施用了 CXCR5抗体或其功能部分或衍生物的动物体内CXCR5+细胞的定量，可通过下列步骤完成:例如，通过使用与抗CXCR5抗体结合的带荧光标记的抗体以及对T细胞和B细胞具有特异性的带标记抗体给获得的细胞染色，然后再进行FACS分析。
[0180]本发明的抗体可以描述或规定为识别或特异性结合CXCR5的表位或部分的抗体。该表位或多肽部分可按本文所述而规定，例如根据N端和C端的位置、根据毗邻氨基酸残基的大小、构象表位等。
[0181]本发明的抗体也可以通过交叉反应性来描述或规定。跟与CXCR5有至少95%、至少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %、至少70 %、至少有65 %、至少有60 %、至少55 %，以及至少50%同一性(使用本领域内已知和本文所述的方法计算)的CXCR5多肽结合的抗体，也包括在本发明内。
[0182]本发明的抗体也可以通过与目的CXCR5的结合亲和力来描述或规定。抗CXCR5抗体可以以低于约1(TM、低于约10_6M，或低于约IO-5M的Kd结合。目的抗体的较高结合亲和力可以是有益的，例如具有约10_8至10_15、约10_8至10_12、约10_9至10—11，或约10_8至IO-10M的平衡解离常数或Kd的那些抗体。本发明还提供了一些抗体，按照本领域内任何已知的测定竞争性结合的方法如本文所述的免疫分析所确定的，这些抗体竞争性地抑制抗体与本发明的表位的结合。在一些优选的实施方案中，该抗体竞争性地抑制与表位的结合达到至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少为60%，或至少50%。
[0183]本发明还包括 含有目的抗体的辍合物。该辍合物包含两个主要组分，一是目的抗体，二是第二组分，其可以是细胞结合剂、细胞毒性剂等。
[0184]本文所用的术语“细胞结合剂”是指一种能特异性识别和结合细胞表面分子的试剂。因此，细胞结合剂可以是:CD抗原，病原体抗原如病毒抗原，分化抗原，肿瘤抗原，细胞特异性抗原，组织特异性抗原，Ig或Ig样分子等。
[0185]在一个实施方案中，该细胞结合剂能特异性识别CXCL13或CXCR5的复合物及其配体，如CXCL13。该辍合物可与靶点细胞接触足够的时间，使该辍合物的效应子功能对细胞起作用，和/或使该辍合物有足够的时间被细胞内化。
[0186]细胞结合剂可以是目前已知或刚为人所知的任何类型，包括肽、非肽、糖、核酸、配体、受体等，或其组合。该细胞结合剂可以是能与细胞结合的任何化合物，无论是以特异性或非特异性方式结合。一般而言，细胞结合剂可以是抗体(尤其是单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、营养输送分子(如转铁蛋白)，或其它任何细胞结合分子或物质。
[0187]可利用的细胞结合剂的其它例子包括:多克隆抗体；单克隆抗体；抗体片段，如 Fab、Fab’、F(ab’)2 以及 Fv(Parham, J.1mmunol.131:2895-2902(1983) ；Spring 等，J.1mmunol.113:470-478 (1974)；以及 Nisonoff 等，Arch.Biochem.Biophys.89:230-244(1960)) ο
[0188]第二组分也可以是一种细胞毒性剂。本文所用的术语“细胞毒性剂”是指一种能降低或阻断细胞的功能或生长，和/或导致细胞破坏的物质。因此，细胞毒性剂可以是紫杉醇、美登素(maytansinoids)，如DMl或DM4、CC_1065或CC-1065类似物、蓖麻蛋白、丝裂霉素C等。在某些实施方案中，如同本发明的辍合物的任何结合剂，细胞毒性剂是以共价键与目的抗体直接连接或通过可切割的或不可切割的连接分子连接的。[0189]适宜的美登素的例子包括美登醇(maytansinol)和美登醇类似物。美登素能抑制微管的形成并对哺乳动物细胞具有很强的毒性。
[0190]适宜的美登醇类似物的例子包括含有被修饰的芳环的美登醇类似物和在其它位置有修饰的美登醇类似物。在下列美国专利中披露了这类适宜的美登素:4，424，219 ；4，256，746 ;4，294，757 ;4，307，016 ;4，313，946 ;4，315，929 ;4，331，598 ;4，361，650 ；4，362，663 ;4，364，866 ;4，450，254 ;4，322，348 ;4，371，533 ;6，333，410 ;5，475，092 ；5，585，499 ;以及 5，846，545。
[0191]适宜的含有被修饰的芳环的美登醇类似物的例子包括:(I) C-19-脱氯(美国专利4，256，746)(例如通过美坦西醇P2 (ansamytocin P2)的LAH还原而制备)；(2) C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利4，361，650和4，307，016)(例如用链霉菌或放线菌脱甲基或用氢化锂铝(LAH)脱氯而制备)；以及(3)C-20-脱甲氧基、C-20-乙酰氧基(-0C0R)，+/-脱氯(美国专利4，294，757)(用酰氯进行酰化而制备)。
[0192]适宜的在其它位置有修饰的美登醇类似物的例子包括:(I) C-9-SH (美国专利4，424，219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应而制备)；(2) C-14烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利4，331，598) ; (3)C_14_羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利4，450，254)(从诺卡尔菌属制备)；(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利4，364，866)(通过链霉菌使美登醇转化而制备)；(5)C-15-甲氧基(美国专利4，313，946和4，315，929)(从Trewia nudiflora 分离)；(6)C-18_N-脱甲基(美国专利 4，362，663 和 4，322，348)(通过链霉菌使美登醇脱甲基化而制备)；以及(7)4，5-脱氧(美国专利4，371，533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原而制备)。
[0193]细胞毒性辍合物可以体外方法制备。为了将细胞毒性剂、药物或前药与抗体连接，通常使用连接基。适宜的连接基是本领域内公知的，包括二硫基、硫醚基、酸不稳定基、光不稳定基，肽酶不稳定基以及酯酶不稳定基。例如，利用二硫键交换反应或在目的抗体和药物或前药之间形成硫醚键可构建辍合物。
[0194]如上所讨论，本发明提供了编码本文所披露抗体或其功能变体的分离的核酸序列，含有编码本发明CXCR5结合多肽的核苷酸序列的载体构建物，含有这种载体的宿主细胞，以及生产多肽的重组技术。
[0195]该载体通常包含本领域内已知的组分，一般包括但不限于一个或多个下列组件:信号序列、复制起点、一个或多个标记或选择基因、促进和/或加强翻译的序列、增强子元件等。因此，该表达载体包括与适宜的转录或翻译调控核苷酸序列(例如那些源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的核苷酸序列)可操作地连接的核苷酸序列。其它调控序列的例子包括操作子、mRNA的核糖体结合位点，和/或其它控制转录和翻译(例如其起始和终止)的适宜序列。当调控序列在功能上与相应多肽的核苷酸序列相关时，核苷酸序列就是“可操作地连接的”。因此，如果一个启动子核苷酸序列控制该核苷酸序列的转录，那么该启动子核苷酸序列就是与例如抗体重链序列可操作地连接的。
[0196]此外，编码与抗体重链和/或轻链序列非天然相连的适宜信号肽序列，可引入表达载体中。例如，信号肽(分泌前导)的核苷酸序列可与多肽序列融合，使得该抗体被分泌到周质空间或培养基中。在预期宿主细胞中起作用的信号肽，加强了相应抗体或其部分的细胞外分泌。该信号肽可在细胞分泌抗体时从多肽上裂解。这类分泌信号的例子是众所周知的并包括例如在美国专利5，698，435,5, 698，417以及6，204，023中所述的那些分泌信号。
[0197]载体可以是质粒、单链或双链病毒载体、单链或双链RNA或DNA的噬菌体载体、噬菌粒、粘粒或任何其它目的转基因的载体。采用众所周知的将DNA和RNA导入细胞的技术，可将这类载体作为聚核苷酸导入细胞。在噬菌体和病毒载体的情况下，也可采用众所周知的感染及转导技术，将载体作为包装或包裹的病毒导入细胞。病毒载体可以是复制型或复制缺陷型。在后一种情况下，病毒的繁殖一般只会在辅助型宿主细胞中发生，并需使用携带产生颗粒所必须的各种病毒组分的多种载体。使用源自现有DNA构建物的RNA，也可用无细胞翻译系统生产蛋白(参阅例如W086/05807和WO 89/01036，以及美国专利5，122，464)。
[0198]本发明的抗体可从任何适宜的宿主细胞表达。可用于本发明的宿主细胞的例子包括原核细胞、酵母或高级的真核细胞，包括但不限于微生物，例如用含有本发明抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠杆菌、欧文氏菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、志贺氏菌，以及杆菌、假单胞菌和链霉菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酿酒酵母、毕赤酵母、放线菌、克鲁维酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属、木霉属、链孢霉属，以及丝状真菌，如链孢霉菌、青霉属、弯颈霉属和曲霉属)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV ;或烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(例如C0S、CH0、BHK,293或3T3细胞)，该构建物含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病 毒的启动子(例如腺病毒后期启动子；或疫苗病毒7.5K启动子)。
[0199]用于原核宿主细胞的表达载体，一般含有一个或多个表型选择标记基因。表型选择标记基因可以是，例如一种编码赋予耐药性或提供自养要求的蛋白的基因。有用的原核宿主细胞的表达载体的例子包括从商业渠道获得的质粒如PKK223-3 (PharmaciaFine Chemicals,Uppsala, Sweden)、pGEMl(Promega Biotec,Madison,WI)、pET (Novagen, Madison, WI)以及 pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA)系列载体(Studier, JMol Biol219:37(1991);以及 Scho 印 fer, Genel24:83 (1993))所衍生的那些载体。通常用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括T7，(Rosenberg等，Gene56:125 (1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang等，Nature275:615(1978);以及Goeddel 等，Nature281:544(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel 等，Nucl AcidsRes8:4057 (1980)),以及 tac 启动子(Sambrook 等，Molecular Cloning, A LaboratoryManual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990))。
[0200]酵母载体往往含有一个复制起点序列，如2μ酵母质粒、自主复制序列(ARS)、启动子区、多聚腺苷化序列、转录终止序列以及可选择标记基因。酵母载体的适宜的启动子序列包括但不限于金属硫蛋白启动子、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J BiolChem255:2073 (1980))或其它糖酵解酶(Holland 等，Biocheml7:4900 (1978))如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶以及葡糖激酶。其它用于酵母表达的适宜载体和启动子，在Fleer等，Gene107:285(1991)中进一步说明。其它酵母和酵母转化方案的适宜启动子和载体是本领域内众所周知的。酵母转化方案也是众所周知的。Hinnen等,Proc Natl Acad Sci75:1929 (1978)叙述了这样的一个方案，它在一种选择性培养基中选择Trp+转化。
[0201]任何真核细胞培养物都是可行的，无论是源自脊椎动物还是无脊椎动物的培养物。无脊椎动物细胞的例子，包括植物和昆虫细胞(Luckow等，Bi0/Techn0l0gy6:47 (1988)；Miller 等，Genetic Engineering, Setlow 等，eds., vol.8, pp.277-9, PlenumPublishing (1986);以及 Maeda 等，Nature315:592 (1985))。例如，杆状病毒系统可用于生产异源蛋白。在昆虫系统中，苜猜银蚊夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicanuclear polyhedrosis virus, AcNPV)可作为载体用来表达外源基因。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可在AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下被克隆。其它已经鉴定的宿主包括白纹伊蚊(Aedes)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和家香(Bombyx mori)。各种各样的转染病毒株可从市面上获得，例如AcNPV的L-1变种和家蚕NPV的Bm_5株。此外，如本领域内众所周知，棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿、烟草的植物细胞培养液也可作为宿主。
[0202]脊椎动物细胞、脊椎动物细胞在培养基(组织培养基)中的繁殖，可以是一种常规步骤，但苛求细胞系确实存在，它需要例如一种具有独特因子的专门培养基、饲养细胞等，参阅 Tissue Culture, Kruse 等，eds., Academic Press (1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子为猴肾细胞；人胚肾细胞；幼仓鼠肾细胞；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc Natl Acad Sci USA77:4216 (1980));小鼠塞尔托利氏细胞;人宫颈癌细胞(例如HeLa);犬肾细胞；人肺癌细胞；人肝细胞；小鼠乳腺肿瘤；以及NSO细胞。
[0203]宿主细胞是用载体转化以产生抗体，并在常规营养培养基中培养，该培养基含有生长因子、维生素、矿物 质等，以及适合于所用细胞和载体的诱导剂。常用的启动子序列和增强子序列是源自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40 (SV40)以及人的巨细胞病毒(CMV)。源自SV40病毒基因组的DNA序列可用于提供其它遗传组件，用于在哺乳动物宿主细胞(如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接和多聚腺苷化位点)中表达一个结构基因序列。病毒的早期和晚期启动子是特别有用的，因为两者都很容易从病毒基因组作为片段获得。该片段也可能含有一个病毒复制起点。用于哺乳动物宿主细胞的典型表达载体可从商业渠道获得。
[0204]可从商业渠道获得的培养基如Ham’s F10、极限必需培养基(MEM)、RPM1-1640和达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)都适合于培养宿主细胞。此外，Ham等，MethEnzymol58:44(1979)和Barnes 等，Anal Biocheml02:255 (1980)，以及美国专利 4，767，704 ；4，657，866 ;4，560，655 ;5，122，469 ;5，712，163 ;或 6，048，728 中所述的任何培养基也可作为宿主细胞的培养基使用。这些培养基中任何一种，必要都可补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(如氯化物，如氯化钠、氯化钙或氯化镁；以及磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素，痕量元素(定义为无机化合物，通常其最终浓度在微摩尔的范围内)，以及葡萄糖或等效的能量来源。任何其它必要的补充，都可以按适当的浓度包括在内，作为一项设计选择。培养基条件，如温度、PH值等，都是本领域内已知适合于细胞的，并使转基因能够理想表达。[0205]使用本领域内任何已知的方法，就可获得目的聚核苷酸，并确定该聚核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，就可从化学合成的寡核苷酸组装编码抗体的聚核苷酸(例如Kutmeier等，Bio/Techniquesl7:242 (1994)所叙述的)，然后扩增连接的寡核苷酸，例如通过PCR。
[0206]或者，编码抗体的聚核苷酸可从表达相同抗体的核酸的细胞产生。如果不具备含有编码某特定抗体的核酸的克隆，但抗体分子的序列是已知的，则可从适当来源如文库中获得编码免疫球蛋白的核酸，这也许是一种对产生抗体的细胞具有特异性的核酸，所述细胞如选定表达本发明的抗体的杂交瘤细胞。可为PCR扩增配置适宜的引物。然后，使用本领域内众所周知的任何方法，可将PCR所产生的扩增核酸克隆到可复制的克隆载体中去。
[0207]一旦核苷酸序列和对应于抗体的氨基酸序列被确定，就可使用本领域内已知的操作核苷酸序列的方法，如重组DNA技术、定点诱变，PCR等(参阅，例如Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring HarborLaboratory (1990)；以及Ausubel 等，eds., Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley & Sons (1998)，操作该抗体的核苷酸序列以获得本文所述的等效物，产生含有不同氨基酸序列的抗体，例如，造成氨基酸取代、删除和/或插入。
[0208]可以众所周知的方法检查重链和/或轻链可变区的氨基酸序列，以鉴定CDR序列，例如，通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列的比较可确定序列高变异性的区域。使用常规DNA重组技术，可将一个或多个⑶R插入构架区，例如插入人的构架区使非人源抗体人源化，如上所述。通过该构架区与一个或多个CDR的结合而产生的聚核苷酸，可编码与CXCR5特异性结合 的抗体或至少编码其ED域。例如，这种方法可用于一个或多个参与链内二硫键可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或删除，以产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。
[0209]本发明的抗体或抗体片段可用于在体外或体内检测生物样本的CXCR5，从而检测表达CXCR5的细胞。在一个实施方案中，本发明的抗CXCR5抗体被用于测定CXCR5在一种组织或源自该组织的细胞中的存在和水平。例如，在用本发明的抗体或抗体片段进行的免疫分析中，可测定CXCR5在该组织或活检样本中的水平。组织或活检样本可冷冻或固定。同一方法或其它方法也可用于测定CXCR5的其它性能，如它的水平、细胞定位、mRNA水平、基因突变等等。
[0210]上述方法可用于例如为已知或疑患癌症的个体诊断癌症，将该个体测定的CXCR5水平与一个正常对照或标准相比。本发明的分析也可用于诊断关节炎或其它以B细胞的浸润和富集以及分化淋巴组织发展为特征的自身免疫性疾病。
[0211]本发明还提供了为了研究或诊断应用而进一步标记的单克隆抗体、人源化抗体及其抗原表位结合片段。在某些实施方案中，该标记是一种放射性标记、荧光团、生色团、显像剂，或金属离子。
[0212]此外还提供了一种诊断方法，其中将所述标记抗体或其抗原表位结合片段施用于怀疑患有癌症、关节炎、自身免疫性疾病或其它CXCR5疾病的个体，对该标记在个体体内的分布予以测量或监视。
[0213]本发明的抗体及其片段可作为亲和纯化剂使用。在此过程中，使用本【技术领域】已知的方法，将抗体固定在一种固相载体如葡聚糖或琼脂糖树脂或滤纸上。被固定的抗体与含有CXCR5的样本或载有CXCR5的待纯化细胞接触，然后用一种适宜的溶剂洗涤载体，该溶剂将洗去样本中除CXCR5或待纯化细胞以外几乎所有的物质，CXCR5或待纯化细胞则结合在被固定的本发明的抗体上。最后，用另一种适宜的溶剂(如甘氨酸缓冲液，PH值5.0)洗涤载体，这将从抗体上释放CXCR5或细胞。
[0214]为了诊断应用，目的抗体通常会用一种可检测的成分加以标记。有许多标记可供利用，大致可分为以下几类:(a)放射性同位素，如36S、14C、1251、3H和1311(抗体可用放射性同位素标记，使用 Current Protocols in Immunology, vol.12, Coligen 等，ed., ffiley-1nterscience, New York(1991)所述的技术,例如，放射性可用闪烁计数技术来衡量)；(b)荧光标签，如稀土螯合物(铕螯合物)、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白以及得克萨斯红；突光标签可用Current Protocols inImmunology (同上)披露的技术结合到抗体上，例如，荧光可用荧光仪量化；以及(c)有各种酶底物标签可供利用(美国专利4，275，149提供了综述)，酶通常可催化产色底物的化学改变，这可采用各种技术来测量，例如酶可催化底物颜色的变化，这可用分光光度来衡量；或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。定量测定荧光变化的技术是众所周知的，例如使用发光计，或者该标记可向一种荧光受体提供能量。酶标记的例子包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利4，737，456)、荧光素、2，3- 二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶，过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶、葡糖糖基化酶、溶菌酶、糖氧化酶(如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶，葡糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。使酶与抗体结合的技术在 O' Sullivan 等，Meth Enz, ed.Langone & Van Vunakis, Academic Press, NewYork, 73(1981)中有所叙述。
[0215]当使用这些标记时，有适宜的底物可供利用，例如:(i)对于辣根过氧化物酶可用过氧化氢酶作为底物，过氧化氢酶可氧化一种染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)) ；(ii)对于碱性磷酸酶(AP)可用磷酸对-硝基苯基酯作为产色底物；以及(iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)可用产色底物(例如对硝基苯基-β -D-半乳糖苷酶)，或荧光底物如4-甲基伞形酮酰-β -D-半乳糖苷酶。
[0216]其它酶-底物组合也可供本领域专业人员利用。对于一般性评述，参阅美国专利4，275，149 和 4，318，980。
[0217]有时，标记与抗体是间接地结合。例如，抗体可与生物素结合，上述任何报告蛋白都可与抗生物素蛋白结合，反之亦然。生物素与抗生物素蛋白选择性地结合，因此，标记可与抗体以间接方式结合。或者，为了实现标记的间接结合，抗体与一种小的半抗原(如地高辛)结合，将不同类型的标记或上述的报告蛋白与一种抗地高辛抗体结合。因此，使用第二种抗体可以实现标记与抗体或突变蛋白的间接结合。
[0218]在本发明的另一个实施方案中，抗体不必加以标记，它的存在可使用一种与该抗体结合的标记抗体来检测，其是另一种形式的第二抗体。
[0219]本发明的抗体可用于任何已知的分析方法，如竞争性结合分析、直接和间接夹心分析以及免疫沉淀试验。Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques (CRCPress, Inc.1987)。
[0220]竞争性结合分析取决于一种带标记的标准物与试验样本在与有限量的抗体结合过程中的竞争能力。试验样本中抗原的量与跟抗体结合的标准物的量成反比。为便于测定跟抗体结合的标准物的量，抗体在竞争之前或之后通常是不溶解的。因此，与抗体结合的标准物和试验样本可与未结合的标准物和试验样本方便地分离。
[0221]夹心分析涉及使用两种抗体，每一种都有能力与待检测目标的不同免疫原部分(决定簇或抗原表位)结合。在夹心分析中，待分析试验样本与直接或间接固定在固体载体上的第一种抗体结合，然后直接或间接地加有标记的第二种抗体与已经结合的试验样本结合，从而形成不溶性的三部分复合物，参阅例如美国专利4，376，110。第二种抗体本身可用一种可检测的成分加以标记(直接夹心分析)，或采用抗免疫球蛋白的抗体或用可检测成分加以标记的结合对(例如抗体/抗原、受体/配体、酶/底物)的其它适宜成员进行测量(间接夹心法)。例如，一种夹心分析是ELISA分析，在这种情况下，该可检测成分是酶。
[0222]对于免疫组织化学，细胞或组织样本可以是新鲜的或冷冻的，或可封在石蜡里并用一种防腐剂如甲醛固定。
[0223]抗体也可用于体内诊断分析。一般而言，抗体的突变体是用放射性核苷酸(如mIn、99TC、14C、m1、3H、32P或35S)标记的，使得表达CXCR5的位点可使用免疫闪烁法定位。
[0224]本发明还包括试剂盒，例如包括抗体、其片段、同源物、其衍生物等的试剂盒，例如一种带标记或具有细胞毒性的辍合物，以及抗体使用说明书、杀死特定类型细胞的辍合物等等。该说明书可包括在体外、体内或体内外使用抗体、辍合物等的指示。抗体可以是液态或固态，通常是冻干形式。该试剂盒可包含其它适宜的试剂，如缓冲液、重组溶液以及为了预定用途的其它必要成分。成套的预定剂量组合试剂与使用说明书，例如用于治疗用途或诊断分析，都是经过精心考虑的。如果抗体是带标记的，例如用酶标记的，那么该盒可包括底物和酶所需的辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。此外，其它添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或裂解缓冲液)等也可包括在内。各种试剂的相对量可以改变而提供试剂溶液的浓缩物，这就提供了用户灵活性、节省空间、节省试剂等优越性。这些试剂也可以干粉形式提供，通常是冻干形式，包括赋形剂，它在溶解时可提供具有适当浓度的试剂溶液。
[0225]本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，例如出于获得临床前数据的目的，将目的抗体或等效物施用于非人类哺乳动物。代表性的待治疗非人类哺乳动物，包括非人灵长类动物、狗、猫、鼠、啮齿类以及其它哺乳动物，其中进行了临床前研究。这些哺乳动物可为一种需用抗体治疗的疾病建立动物模型，或可用于研究目的抗体的毒性。在每个这样的实施方案中，可在哺乳动物中进行剂量递增研究。
[0226]一种抗体，无论有无第二个组分(如作为一种治疗成分与抗体结合)，无论是单独或与细胞毒性因子一起施用，均可作为治疗剂使用。本发明是关于以抗体为基础的治疗，其中涉及给动物、哺乳动物或人施用本发明的抗体，以治疗CXCR5介导的疾病、病症或状况。该动物或患者可以是需要特别治疗的哺乳动物，例如经诊断患有特殊(例如与CXCR5有关的)疾病的哺乳动物。针对CXCR5的抗体是有用的，例如可用于预防或治疗关节炎、炎症，一般而言，移植排斥反应、癌症和自身免疫性疾病。例如，通过施用在治疗上可接受剂量的本发明的抗CXCR5抗体，或多种本发明的抗体或其等效物的混合物，或与其它不同来源的抗体联合施用，所治疗哺乳动物尤其是人的疾病症状可得到减轻或预防。
[0227]本发明的治疗化合物包括但不限于本发明的抗体(包括如本文所述的其片段、类似物，等效物和衍生物)、如本文所述的编码本发明的抗体的核酸(包括其片段、类似物和衍生物)以及如本文所述的抗独特型抗体。本发明的抗体可用于治疗、抑制或预防与CXCR5异常表达和/或活性相关的疾病、病症或状况，包括但不限于任何一种或多种本文所述的疾病、病症或状况。治疗和/或预防与CXCR5异常表达和/或活性相关的疾病、病症或状况包括但不限于减轻与这些疾病、病症或状况相关的至少一种症状。如本领域内众所周知或本文所述，本发明的抗体可以药学上可接受的组合物形式提供。“生理上可接受的”、“药理学上可接受的”等术语是指已经被联邦或州政府的监管机构批准，或已列入美国药典或其它普遍公认的用于动物、尤其是人类的药典。
[0228]抗CXCR5抗体可以任何可接受方式给哺乳动物施用。施用方法包括但不限于胃肠外、皮下、腹腔内、肺内、鼻内、硬膜外、吸入和口服途径；若欲进行免疫抑制治疗，则施用于病灶内。胃肠外输液包括肌内、皮内、静脉内、动脉内或腹腔内施用。抗体或组合物可以任何方便途径施用，例如通过输液或快速注射、 通过上皮或粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并可与其它生物活性剂一起施用。给药可以是全身性或局部性。此外，也许需要以任何适当途径将本发明的治疗抗体或组合物施用于中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射借助于脑室内导管，例如与一个忙器如奥莫耶忙器(0_aya reservoir)连接的导管。此外，该抗体适合于以脉冲输液方式给药，尤其是以抗体剂量递减的方式。优选的是以注射方式给药，优选静脉注射或皮下注射，部分地取决于给药时间的长短。
[0229]各种其它给药系统是众所周知的，可用于本发明的抗体的给药，包括例如封装于脂质体、微粒、微胶囊(参阅Langer, Science249:1527 (1990) ；Treat等，inLiposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer ；Lopez-Berestein 等，eds., p.353-365 (1989)；以及 Lopez-Berestein, ibid., p.317-327)以及能表达该化合物的重组细胞；受体介导的胞吞(参阅111等，18丨010^111262:4429(1987));构建作为逆转录病毒或其它载体等的组成部分的核酸。
[0230]活性成分也可封装在以凝聚技术或界面聚合法制备的微胶囊中，例如分别用于胶体药物给药系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或微乳液的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。在Remington’s PharmaceuticalSciences (雷明顿药物科学)，16版，A.0sal, Ed.(1980)中公开了这些技术。
[0231]也可应用经肺给药，例如使用吸入器或喷雾器，以及含有雾化剂的制剂。抗体也可以干粉组合物的形式施用患者肺部，参阅例如美国专利6，514，496。
[0232]在一个具体实施方案中，也许希望在需要治疗的局部区域施用本发明的治疗抗体或组合物；这可通过以下方式实现:例如但不限于，局部输液、局部敷用、注射、经由导管、以栓剂或植入的方式；所述植入物是一种多孔、非多孔或凝胶状物质，包括膜如硅橡胶膜或纤维。优选的是，当施用本发明的抗体时，应注意采用蛋白不吸收或不吸附的材料。
[0233]在另一实施方案中，该抗体可经由一种控制释放系统给药。在一个实施方案中，可使用泵(参阅 Langer, Science249:1527 (1990) ；Sefton, CRC CritRef Biomed Engl4:201 (1987) ；Buchwald 等，Surgery88:507 (1980)；以及 Saudek等，NEngl J Med321:574(1989)).在另一实施方案中，可使用聚合材料(参阅Medical Applications of Controlled Release, Langer 等，eds., CRC Press(1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen 等，eds., Wiley (1984) ； Ranger 等，J Macromol Sci Rev Macromol Chem23:61 (1983);也参见Levy 等,Science228:190 (1985) ;During 等，Ann Neurol25:351 (1989);以及 Howard 等,JNeurosurg71:105 (1989)) 0在另一实施方案中，控制释放系统可放置在治疗靶点的附近。
[0234]通过混合具有所需纯度的多肽与任选的“药学上可接受的”载体、稀释剂、赋形剂或常用于本领域的稳定剂(即缓冲液、稳定剂)、防腐剂、等渗剂、非离子型洗涤剂、抗氧化剂以及其它多种添加剂，参阅Remington’s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学),16版，Osol, ed.(1980)，多肽或抗体治疗制剂可制备成冻干制剂或水溶液储存。这些添加剂在所用剂量和浓度下，对接受治疗者一般都没有毒性，因此，赋形剂、稀释剂、载体等是药学上可接受的。
[0235]“分离”或“纯化”的抗体基本上不含细胞物质或来自细胞或组织来源或源自蛋白的培养基的其它污染蛋白，或在化学合成的情况下基本上不含化学前体或其它化合物。“基本上不含细胞物质”这一措词包括抗体制剂，其中多肽/蛋白从细胞中分离或以重组方式产生，但是与该细胞的组分是分开的。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括污染蛋白含量低于约30%、20%、10%、5%、2.5%或1% (干重)的抗体制剂。当抗体是以重组方式产生时，优选基本上不含培养基，即以蛋白制剂体积计，培养基含量低于约20%、10%、5%、2.5%或I %。当抗体是以化学合成方式产生时，优选基本上不含化学前体或其它化合物和试剂，即目的抗体是与化学前体或涉及蛋白合成的其它化合物分开的。相应地，这些抗体制剂含有低于约30%、20%、10%、5%或1% (干重)的化学前体或目的抗体以外的其它化合物。在本发明一个优选的实施方案中，抗体是分离或纯化的。
[0236]本文所用的术语“低至不可检测的聚集水平”，是指样本中含有不超过5%、不超过4 %、不超 过3 %、不超过2 %、不超过I %且往往不超过0.5 %的聚集量(按蛋白重量计，例如以高效尺寸排阻层析法(HPSEC)测量)。
[0237]本文所用的术语“低至不可检测的碎片水平”，是指例如在HPSEC所确定的一个单峰处，或还原性毛细管凝胶电泳(rCGE)所确定的两个(2)峰(重链和轻链)处，样本中含有等于或高于80%、85%、90%、95%、98%或99%的总蛋白，且不含高于5%、高于4%、高于3%、闻于2%、闻于1%或闻于0.5%的总蛋白的其它单峰。本文所用的rCGE是指还原条件下的毛细管凝胶电泳，该还原条件足以使抗体或抗体类型或衍生物分子中的二硫键还原。
[0238]就含有CXCR5抗体或其结合片段的液体制剂而论，本文所用的术语“稳定”和“稳定的”是指制剂中的抗体或其抗原结合片段，在给定的制造、制备、运输和储存条件下，对于热和化学解折叠、聚集、降解或断裂的抵抗力。本发明的“稳定的”制剂在给定的制造、制备、运输和储存条件下，可保持等于或高于80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%的生物活性。所述抗体制剂的稳定性，可根据聚集、降解或断裂的程度来评估，并与参照物比较；采用的方法是本领域内专业人员已知的，包括但不限于rCGE、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及 HPSEC。
[0239]术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这类生理载体可以是无菌液体，例如水和油，包括来源于石油、动物、植物或合成的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物为静脉内注射时，水是适宜的载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油的水溶液也可作为液体载体使用，尤其是用于注射溶液。适宜的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要，该组合物也可含有少量的润湿剂或乳化剂，或PH缓冲剂。该组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂、贮库等形式。该组合物可用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂的形式。口服制剂可含有标准载体，如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适宜载体的例子在“雷明顿药物科学”(Remington’s PharmaceuticalSciences, Martin)中有所描述。这类组合物将包含有效量的抗体,优选的是纯抗体，以及适量的载体以形成适合给患者施用的形式。如本领域内周知，该制剂将配制成适合于施用的方式。
[0240]缓冲剂有助于将pH值维持在近似于生理条件的范围内。缓冲剂优选的是约2mM至约50mM的浓度范围。适宜用于本发明的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等 )以及乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。磷酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、三甲胺盐例如Tris、HEPES以及其它已知的此类缓冲剂均可以使用。
[0241]可加入防腐剂以阻滞微生物生长，加入量的范围可为0.2^-1% (w/v)。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄基铵、烷基二甲基苄基铵卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化己烷双胺、羟基苯甲酸烷基酯如羟苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇以及3-戊醇。
[0242]等渗剂的存在可确保本发明的液体组合物的生理等渗性，其包括多元糖醇、优选的是三元或三元以上的糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇以及甘露醇。考虑到其它成分的相对含量，多元醇可以约0.1%至约25% (重量)的含量存在，优选的是1%至约5%。
[0243]稳定剂是指种类广泛的赋形剂，其功能范围可从填充剂至将治疗剂溶解或有助于预防治疗剂变性或粘在容器壁上的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇、如乳糖、海藻糖、水苏糖、阿糖醇、赤藓醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫基乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即〈10残基)；蛋白质，如人血清白蛋白、胎牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物、如聚乙烯吡咯烷酮，糖类；单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖，如棉子糖；多糖，如右旋糖苷等等。稳定剂含量的范围为活性蛋白的0.1至10，000倍(w/w重量)。
[0244]其它各种赋形剂包括填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗氧化剂(如抗坏血酸、蛋氨酸或维生素E)以及共溶剂。
[0245]根据所治疗具体病症的需要，本文的制剂也可包含一种以上的活性化合物，优选的是那些具有互补活性的化合物；这类互补活性不会在相互之间造成不良影响。例如，也许希望进一步提供一种免疫抑制剂。这类化合物分子以适宜的量组合，以有效地实现预期目的。
[0246]本文所用的术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物，即具有由相反溶解倾向的基团，通常是油溶性烃链和水溶性离子基团组成的结构。表面活性剂可根据表面活性基团所带的电荷而划分为阴离子型、阳离子型和非离子型表面活性剂。表面活性剂经常作为润湿剂、乳化剂、增溶剂和分散剂，用于各种的药物组合物以及生物材料制剂。
[0247]可加入非离子型表面活性剂或洗涤剂(又称为润湿剂)以帮助治疗剂的溶解，并保护治疗蛋白以避免振荡引起的聚集，也使得制剂暴露于表面剪切力而不会发生蛋白的变性。适宜的非离子型表面活性剂包括聚山梨酯(20、80等)、聚环氧烷(184、188等)、
Pluronic?多元醇以及聚氧乙烯山梨坦单醚(HVEEN-20?、TWEE1N-8G?等)。非
离子型表面活性剂的含量范围可为约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选的是约0.07mg/ml至约 0.2mg/ml。
[0248]本文所用的术语“无机盐”是指任何由于酸分子中的一部分或所有氢原子被金属或起金属作用的基团置换而生成的不含碳化合物，并在药物组合物和生物材料制剂中经常作为渗透压调节化合物。最常见的无机盐是NaCl、KCl、NaH2PO4等。
[0249]本发明提供了抗CXCR5结合的化合物或其片段的液体制剂，其pH值范围为约5.0至约7.0，或约5.5至约6.5，或约5.8至约6.2，或约6.0。
[0250]本发明包括在医生诊所或实验室的医用冰箱和冷冻室温度(如约_20°C至约5°C)下储存时(例如约60天、约120天、约180天、约I年、约2年或以上)具有稳定性的液体制剂，上述稳定性是用例如高效尺寸排阻层析法(HPSEC)来评估的。本发明的液体制剂在室温下也显示了至少几小时的稳定性，例如根据HSPEC的评估，在使用之前稳定I小时、2小时或约3小时。
[0251]术语“小分子”和类似术语包括但不限于肽、拟肽类物质、氨基酸、氨基酸类似物、聚核苷酸、聚核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量为每摩尔小于约10,000克的有机或无机化合物(包括杂有机和/或有机金属化合物)、分子量为每摩尔小于约5，000克的有机或无机化合物、分子量为每摩尔小于约1，000克的有机或无机化合物、分子量为每摩尔小于约500克的有机或无机化合物，以及这类化合物的盐、酯及其它药学上可接受的形式。
[0252]因此，例如在癌症的情况下，本发明的抗体可以单独使用，也可与其它类型的癌症治疗剂结合使用，包括传统的化疗剂(紫杉醇(paclitaxel)、卡钼(carboplatin)、顺钼(cisplatin)和多柔比星(doxorubicin)),抗EGFR剂(吉非替尼(gef itinib)、厄洛替尼(erlotinib)和西妥昔单抗(cetuximab)),抗血管生成剂(贝伐珠单抗(bevacizumab)和舒尼替尼(Simitinib))，以及免疫调节剂如干扰素α和沙利度胺。
[0253]在另一项实施方案中，在风湿性疾病如类风湿性关节炎(RA)的情况下，可使用含有本发明的CXCR结合分子的组合治疗剂。例如，一种人源化CXCR5抗体可与一种小分子结合使用，例如缓解病情的抗风湿药，包括但不限于甲氨蝶呤和吡啶合成抑制剂如来氟米特(Mader & Keystone, J Rheum34Supp (16-24) 2007，Gaffo 等，Am J Health SystPharm63:2451-2465, 2006)。
[0254]由于各种形式的目的CXCR5结合分子可以是不清除B细胞的，本发明的分子可与具有重叠作用机制的其它药物组合，以产生叠加或协同的终点。因此，例如，第二种药物可以是在T细胞轴上在细胞因子水平上起作用的药物等。
[0255]本文所用的术语“治疗剂”是指可用于与异常CXCR5和/或CXCL13代谢和活性相关的疾病、障碍等的治疗、管理或改善的任何药物。其可能在异常B细胞水平或B细胞活性中表现作用。也包括在与异常CXCR5和/或CXCL13代谢和活性相关的疾病、障碍等的治疗中具有药理学作用的已知化合物。
[0256]此外，本发明的抗体可以与各种效应分子缀合，例如异源的多肽、药物、放射性核苷酸或毒素，参阅例如 WO 92/08495 ；W0 91/14438 ；W089/12624 ;美国专利 5，314，995 ；以及EP0 396，387。一种抗体及其片段可与一种治疗组分缀合，例如一种细胞毒素(例如一种细胞静止剂或杀细胞剂)、一种治疗剂或放射性金属离子(例如α发射体如213Bi)。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何损害细胞的试剂。其例子包括紫杉醇(paclitaxol)、松胞菌素 B(cytochalasin B)、短杆菌肽 D(gramicidin D)、溴乙卩定(ethidium bromide)、依米丁 (emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二美5基葱酉昆(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普卡霉素(mithramycin)、放线菌素(actinomycin D)、l_ 去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(Iidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和O票呤 霉素(puromycin)及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6_巯基票呤(6-mercaptopurine)、6_硫代鸟_呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5_ 氟脲啼唳(5-fluorouracil)和氮烯咪胺(decarbazine))，焼化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、亚硝基服氮芥(carmustine (BSNU))和洛莫司汀(lomustine (CCNU))、环憐酸胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼(cisplatin))，蒽环霉素(anthracyclines)(例如柔红霉素(daunorubicin)、道诺霉素(daunomycin)和多柔比星(doxorubicin))，抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)、放线菌素(actinomycin)、博莱霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin(AMC)))，以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))。
[0257]使治疗组分与抗体缀合之类的技术是众所周知的，参阅例如Amon等，inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗体和癌症治疗)，Reisfeld 等(eds.)，p.243_56Alan R.Liss (1985) ；Hellstrom 等，in Controlled Drug Delivery (控制给药)，2nd ed.，Robinson 等，eds.，p.623-53，Marcel Dekker (1987) ；Thorpe, inMonoclonal Antibodies’84:Biological And Clinical Applications (生物和临床应用),Pinchera 等，eds., p.475-506 (1985) ；Monoclonal Antibodies For Cancer Detectionand Therapy (用于癌症检测和治疗的单克隆抗体),Baldwin等，eds., p.303-16，AcademicPress (1985);以及 Thorpe,等，Immunol Rev (免疫学评论)62:119 (1982)。或者，一种抗体也可以与第二种抗体缀合，以形成一种异源耦联抗体，如双功能抗体，参阅例如美国第4, 676, 980 号专利。
[0258]本发明的缀合物可用于改变一定的生物反应，治疗剂或药物组分不应被理解为只限于传统的化学治疗剂。例如，该药物组分可以是具有某种所需生物活性的蛋白或多肽。这类蛋白可包括，例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌属外毒素，或白喉毒素；蛋白，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤维蛋白溶酶原活化剂；凋亡剂，例如TNF-α ,TNF-β ,AIM I (WO 97/33899) ,AIM II (WO97/34911)、Fas 配体(Takahashi 等，Int Immunol, 6:1567 (1994)), VEGF (WO 99/23105);血栓形成剂；抗血管生成剂，例如血管生长抑素或内皮抑素；或生物反应修饰剂，例如淋巴因子、白细胞介素-1 (IL-1)、白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-6 (IL-6)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)或其它生长因子。
[0259]用于体内施用的制剂必须 是无菌的。这可通过例如无菌过滤膜过滤而实现。例如，本发明的液体制剂可通过用0.2 μ m或0.22 μ m过滤器过滤而灭菌。
[0260]可以制备缓释型制剂。缓释型制剂的适宜例子包括含有抗体的用固体疏水型聚合物制成的半渗透基质，该基质以成形物体的形式出现，例如薄膜或基质。缓释型基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚甲基丙烯酸2-羟基乙基酯、聚乙烯醇、聚乳酸酯(美国第3，773，919号专利)、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如由乳酸-乙醇酸共聚物构成的可注射微球粒)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物能够释放分子长达100天以上，但某些水凝胶释放蛋白的时间则较短。根据所涉及的机制，可以制订出达到稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物交换而形成分子间的S-S键，那么通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冷冻干燥、控制水分含量、使用适当的添加剂、氨基酸置换和开发特异的聚合物基质组合物就可以达到稳定。
[0261]抗体或其变体和组合物将以符合药品质量管理规范的方式配制、给药以及施用。这方面考虑的因素包括包括所治的具体疾病、所治的具体哺乳动物、个体的临床情况、致病原因、给药部位、给药方法、给药方案以及医疗工作者所知的其它因素。即将施用的抗体或其变体的“治疗有效量”取决于这些考虑，并可以是为了预防、减轻或治疗CXCR5疾病、症状或障碍所必须的最低量。
[0262]任选地，抗体或其变体也可与目前用于预防或治疗该疾病的一种或多种药物配制在一起。上述其它药物的有效量取决于药物中抗体的含量、疾病或治疗的种类，以及上面讨论的其它因素。这些量通常与此前所用的剂量一样且通过同样的给药途径，或为此前所用剂量的约I至99%。
[0263]本文所用的术语“有效量”是指一种治疗剂(例如一种预防药物或治疗药物)的量，其足以降低某种CXCR5疾病的严重性和/或持续时间，减轻其一种或多种症状，预防CXCR5疾病的发展或导致CXCR5疾病的消退，或足以产生防止CXCR5疾病或其一种或多种症状的发展、复发、发作或恶化的效果，或足以加强或改善另一种用于治疗CXCR5疾病的治疗方式(例如另一种治疗剂)的预防和/或治疗效果。例如，以基线或正常水平计，本发明的治疗剂可将升高的B细胞水平降低至少5%，优选的是至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少100%。在另一项实施方案中，一种治疗药物或预防药物的有效量足以将某种CXCR5疾病如关节炎或移植排斥的症状降低至少5%，优选的是至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %，或至少100 %。作为等价的术语，本文也使用”治疗有效量”这一术语。
[0264]在某种具体疾病或状况的治疗中，治疗用多肽、抗体或其片段的有效量将取决于该疾病或状况的性质，并可通过标准的临床技术测定。当可能时，可先在体外试验的条件下得出剂量-反应曲线以及本发明的药物组合物。如果可获得适宜的动物模型系统，同样可获得剂量-反应曲线，并运用本领域已知的方法外推出适宜的人类剂量。但是，基于本【技术领域】的常识，能有效地降低炎症影响的药物组合物可形成的局部治疗剂浓度为例如约5至20ng/ml之间，优选的是约10至20ng/ml之间。在本发明另一项具体实施方案中，针对造成依赖于B细胞的自体免疫现象或移植排斥现象的细胞能有效地减缓其增生和存活的药物组合物，可形成的局部治疗剂浓度为约10至100ng/ml之间。
[0265]在一项优选的实施方案中，一种治疗用多肽、抗体或其片段的水溶液可以皮下注射的方式施用。每次剂量的范围按每公斤体重计可为约0.5mg至约50mg,或优选按每公斤体重计为约3mg至约30mg。针对具体的疾病、患者群体、施用方式等，可采用本领域内已知的药学方法凭经验确定该剂量。
[0266]根据许多临床因素，包括疾病类型、疾病严重程度以及患者对治疗剂的敏感度，皮下注射的剂量方案可在每周一次至每天一次的范围内变化。
[0267]本发明提供了制备抗体或其CXCR5-结合片段的液体制剂的方法，其包括将纯化抗体的一部分浓缩至约 15mg/ml、约 20mg/ml、约 30mg/ml、约 40mg/ml、约 50mg/ml、约 60mg/ml、约 70mg/ml、约 80mg/ml、约 90mg/ml、约 100mg/ml、约 200mg/ml、约 250mg/ml、约 300mg/ml或更高的最终浓度，例如使用具有适当分子量(mw)限度的半透膜(例如对于F(ab，)2片段的限度为30Kd ;对于Fab片段的限度为IOKd)来进行浓缩，以及任选地采用同样的半透膜将浓缩的抗体部分渗滤至制剂缓冲液中。
[0268]此外，本发明也包括了稳定(例如Kd稳定)的、改善体内半衰期的产品的液体制剂。因此，本发明的抗体在个体(优选的是人)体内的半衰期为3天以上、7天以上、10天以上、15天以上、25天以上、30天以上、35天以上、40天以上、45天以上、2月以上、3月以上、4月以上、5月以上或更长。
[0269]为了延长抗体在体内的血清循环，可采用各种各样的技术。例如，惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)，可以通过PEG的位点特异性缀合或通过赖氨酸残基上的ε氨基连接到抗体的N-端或C-端上，其中可经过多功能连接子连接、也可以不经过。可以采用导致生物活性损失最小的直链或支链聚合物衍生。缀合程度可通过SDS-PAGE和质谱密切监测，以确保PEG分子与抗体的正确缀合。未反应的PEG可通过尺寸排阻法或离子交换色谱法与抗体-PEG缀合物分离。采用本领域专业人员已知的方法，例如本文所述的免疫测定法，可以测定PEG衍生的抗体的结合活性以及体内功效。
[0270]在体内具有较长半衰期的抗体也可通过将一个或多个氨基酸修饰(即取代、插入或缺失)引入IgG恒定区或其FeR结合片段(如^或铰链^区域片段)来产生，参阅例如WO 98/23289 ；W0 97/34631 ;以及美国第 6，277，375 号专利。
[0271 ] 而且，抗体可与白蛋白缀合使得抗体在体内更稳定，或在体内具有较长的半衰期。这些技术是本领域内众所周知的，参阅例如WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137 ；以及EPO 413，622。抗体也可通过其它方法来修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酰化、酰胺化、用已知保护剂/封闭剂实现衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白实现键合等。
[0272]在一项实施方案中，按照常规步骤将该组合物配制成适合于人类静脉给药的药物组合物。通常，静脉给药的药物组合物是以无菌等渗缓冲水溶液配制的溶液。在必要的场合，该组合物也可包含稳定剂和局部麻醉剂如利多卡因或其它“卡因”类麻醉剂，以减轻注射部位的疼痛。通常，各种成分是以单位剂量的形式单独供应或混合后供应，例如作为冻干粉末或无水浓缩物装在密封容器中，如安瓿瓶或小袋，并标明有效成分的量。当药物组合物以输注方式给药时，可通过装有无菌医药级水或盐水的输注瓶给药。当药物组合物以注射方式给药时，例如可在药盒中提供装有无菌注射用水或盐水的安瓿，使得各成分可在注射前先混合。
[0273]本发明也提供了液体制剂，本发明的液体制剂是装在密封容器中，如安瓿瓶或小袋，并标明产品的量。本发明的液体制剂可装在密封容器中，并标明抗体或抗体片段的量和浓度。例如，本发明的液体制剂可装在密封容器中，CXCR5抗体浓度至少为15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml>7Omg/ml、80mg/ml、90mg/ml、IOOmg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml,或 300mg/ml,其量为 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml 或 20ml。
[0274]提供了一种含有对上述疾病治疗有用物质的制造产品。该制造产品包括容器和标签。适宜的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可用各种材料制造，例如玻璃或塑料。该容器容纳能有效地诊断、预防或治疗CXCR5症状或疾病的组合物，并可设有一个无菌入口(例如该容器可以是静脉注射液小袋或小瓶，设有一个能被皮下注射针头刺破的塞子)。容器上贴的标签或附带的标签标明该组合物是用于治疗所选的病症。该产品还可包括第二个容器，装有药学上可接受的缓冲液，如磷酸缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可包括从商业和用户的立场看来所需的其它材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及使用说明等包装插页。
[0275]在本发明的另一方面，以基因治疗的方式，施用含有编码抗体或其功能衍生物的序列的核酸，以治疗、抑制或预防与CXCR5的异常表达和/或活性相关的疾病或障碍。基因治疗是指通过给个体施用一种表达或可表达的目的核酸而进行的治疗。在本发明的该实施方案中，核酸在介导某种治疗作用的目标宿主细胞中产生编码的蛋白。任何可供利用的基因治疗方法均可按照本发明而使用。
[0276]关于基因治疗方法的一般评论，参阅Goldspiel等，ClinicalPharmacy12:488 (1993) ；ffu 等，Biotherapy3:87 (1991) ；Tolstoshev, Ann Rev PharmacolToxicol32:573 (1993) ;MulIigan, Science260:926 (1993) ；Morgan 等，Ann RevBiochem62:191 (1993)；以及 May, TIBTECH11:155 (1993)。[0277]在一个方面，该化合物含有编码抗体或其功能结合片段的核酸序列，上述核酸序列是在适宜的宿主细胞中表达抗体或其片段或嵌合蛋白或重链或轻链的表达载体的一部分。具体而言，此类核酸序列具有以可操作方式与抗体编码区以及其它调控序列连接的启动子，该启动子是诱导型或组成型的，也任选地具有组织特异性。
[0278]在另一项具体实施方案中，使用了某些核酸分子，其中抗体编码序列和任何其它所需序列的侧面连接在该基因组所需位点促进同源重组的区域，从而为该编码抗体的核酸在染色体内的表达创造了条件(Koller等，Proc Natl Acad Sci USA86:8932 (1989)；Zijlstra等，Nature342:435 (1989))。在一项特殊的实施方案中，被表达的抗体分子是一种单链抗体，或者，该核酸序列包括同时编码该抗体的重链和轻链或其片段的序列。其它整合方法包括使用特定的能识别特定核酸序列、锌指等的转录因子。
[0279]将核酸施用到患者体内的方式可以是直接的，也可以是间接的。在直接情况下，患者是直接与核酸或载有核酸的载体接触；在间接情况下，首先在体外用核酸转化细胞，然后移植至患者体内。
[0280]在一项实施方案中，核酸序列被直接施用到体内，并被表达以产生编码产物。这可用本领域内公知的许多方法中的任何一种来实现，例如构建和施用作为适宜核酸表达载体一部分的抗体编码序列，使得该载体进入细胞内，例如通过使用缺陷型或减毒型逆转录病毒或其它病毒载体感染(参阅美国专利4，980，286);通过直接注射裸DNA;通过使用微粒轰击(例如基因枪；生物导弹，Dupont);通过使用非病毒载体，如含有两亲化合物的合成组合物，该两亲化合物与亲水的核酸结合并能够与细胞融合，通常含有一个与膜结合的疏水部分；通过用脂质或细胞表面受体或转染剂涂覆，封装于脂质体、微粒或微胶囊中；通过施用与一种肽连接的载体( 已知该肽将进入细胞核)；通过施用与一种配体连接的载体(该配体将受到受体介导的胞吞作用，该胞吞作用可用于瞄准特异表达该受体的细胞)(参阅例如Wu等，J Biol Chem262:4429(1987));等等。在另一实施方案中，可形成核酸_配体复合物，其中该配体含有一种融合病毒肽以扰乱核内体，从而使核酸避免溶酶体降解。在另一个实施方案中，通过瞄准特定的受体，核酸可在体内靶向以达到细胞特异性的吸收和表达(参阅 WO 92/06180 ；W0 92/22635 ；W092/20316 ；W093/14188 以及 WO 93/20221)。
[0281]关于载体，如本领域公知，例如可以使用慢病毒载体。慢病毒载体包含用于包装病毒基因组和整合到宿主细胞DNA中的组分。将用于基因治疗的编码抗体的核酸序列克隆进一个或多个载体，这些载体协助把基因递送给患者。例如，慢病毒载体可用于将一种转基因传给造血干细胞。显示逆转录病毒载体在基因治疗中应用的参考文献如下=Clowes等，J Clin Invest93:644 (1994) ;Kiem 等，Blood83:1467 (1994) ；Salmons 等，Human GeneTherapy4:129 (1993)；以及 Grossman 等，Curr Opin Gen and Dev 3:110 (1993)。
[0282]腺病毒也可用于本发明。基于腺病毒的给药系统的靶点器官为例如肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒感染非分裂细胞，这是比先前的逆转录病毒载体优越之处。Kozarsky等在Curr Opin Gen Dev3:499 (1993)中回顾了基于腺病毒的基因治疗。Bout等在Human Gene Therapy5:3 (1994)中展示了利用腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸上皮细胞。在基因治疗中利用腺病毒的其它例子可参阅Rosenfeld等，Science252:431 (1991)；Rosenfeld 等，Cel 168:143 (1992) ；Mastrangeli 等，J Clin Invest91: 225 (1993)；W094/12649 ；以及 Wang 等，Gene Therapy2:775 (1995)。[0283]腺病毒相关病毒(AAV)也可用于基因治疗(Walsh等，Proc Soc Exp BiolMed204:289(1993);以及美国专利 5，436，146,6, 632，670 和 6，642，051)。
[0284]基因治疗的另一种手段涉及以电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等方法将基因转移至组织培养液的细胞内。通常，该转移方法包括给细胞引入一种可选择的标记。然后将细胞置于一个选择过程中，分离出那些接受并表达了引入基因的细胞。然后将那些细胞移入患者体内。
[0285]因此，可在生成的重组细胞移入体内之前先将核酸引入细胞。这样的引入过程可以本领域内已知的任何方法实现，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染，细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。将外部基因引入细胞的许多技术都是本领域内公知的(参阅例如Loeffler等，Meth Enzymol217:599 (1993) ;Cohen 等,Meth Enzymol217:618 (1993)；以及Cline PharmTher29:69(1985))，并可按照本发明加以利用，但前提是该受者细胞必要的发育和生理功能未受到干扰。该技术应该将核酸稳定地引入细胞，使核酸能被细胞表达、遗传并被细胞后代表达。
[0286]生成的重组细胞可以本领域内已知的各种方法引入患者体内。重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选通过静脉注射。预期使用细胞的数量取决于所期待的效果、患者状况等，可由本领域专业人员决定。
[0287]出于基因治疗目的而可将核酸引入的细胞包括任何所需的、可利用的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞、血细胞如T淋巴细胞和B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞，嗜酸性粒细胞、巨核细胞以及粒细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血液、外周血液、胎肝等获得的细胞。
[0288]在一项实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自身的。编码本发明抗体的核酸的引入使得该转基因可由细胞或它们的后代表达，然后该重组细胞被施用体内以产生治疗作用。在一项专门的实施方案中，使用了干细胞或祖细胞。任何能被分离并在体外维持的干细胞和/或祖细胞都有可能按照本发明的实施方案加以利用(参阅例如WO 94/08598 ；Stemple 等，Cell71:973 (1992) ；Rheinwald Meth Cell Bio21A: 229 (1980);以及 Pittelkow等，Mayo Clinic Proc61:771 (1986))。因为CXCR5在例如B细胞上表达，所以血细胞和骨髓细胞是适宜的宿主细胞。但是，本发明关于使用干细胞宿主的范围并不包括制备和利用转基因以将目的转基因引入胚胎和胚胎干细胞而制备转基因生物体。
[0289]本发明通过给个体施用有效量的例如本发明的液体制剂而提供了治疗、预防和改善CXCR5疾病或其一种或多种症状的方法。个体优选是哺乳动物，如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如猴，如猕猴，以及人类)。在一项优选的实施方案中，个体是人。
[0290]CXCR5也可表达在某些癌细胞中，如胰腺、结肠、膀胱，以及白血病T细胞(Qinping 等,0ncogene24:573-584，2005),和白血病 B 细胞(Burkel 等,Blood, Jul2007 ；do1:10.1182/blood-2007-05-089409)，并且 CXCR5 的刺激与癌细胞的增殖相关(Meijer等，Canc Res66:9576-9582, 2006)。
[0291]因此，目的抗体或其衍生物可用于控制表达CXCR5的癌细胞的增殖，上述癌症是通过以本文教导的诊断分析来测定CXCR5表达的存在而确定的。目的抗体可降低恶性细胞的浸润、减少对凋亡的抵抗以及最大程度地减少增殖。然后给这类患者施用抑制癌细胞增殖的量的本文所提供的目的抗体或其衍生物。
[0292]自身免疫性疾病与CXCL13的异常表达和/或高度表达相关，如狼疮(Ishikawa等，J Exp Medl93:1393-1402, 2001)和舍格伦综合征(Salomonsson 等，Scan JImm55:336-342, 2002 ；以及 Barone 等，Arth Rheum52 (6) 1773-1784，2005)，或与 CXCR5的高度表达相关，如重症肌无力(Sims等，J Imml67:1935-1944，2001 ；Saito等，JNeuroimm55:336-342，2005 ；以及 Tackenberg 等，Eur J Imm37:849-863，2007)。因此，用目的抗体将CXCL13或CXCR5配体的高水平或高活性降低至最低限度。在以B细胞的高水平、CXCR5或CXCL13或其它CXCR5配体的高水平为特征的自身免疫性疾病中，如本文所教导，施用了抑制B细胞活性的量的目的抗体。
[0293]在多发性硬化症中，观察到CXCR5的异常表达(Brainl29(Pt 1)200-211，2006)。
[0294]在结肠炎中，CXCR5在GALT的形成和功能中起一定作用(Carlsen等，Gut, 2002, 51 (3)364-367)。CXCR5介导的B细胞向肠粘膜固有层的迁移和浸润，以及一般的粘膜浸润(Mazzucchelli 等，J Clin Invest, 1999，104(10)R49-R54)，及其在溃疡性结肠炎病变部位(其包含异位生发中心)的表达，被目的抗体所抑制。
[0295]在某些情况下和某些症状如类风湿性关节炎中，B细胞的减少可在减轻症状方面产生治疗效益(Oligino & Dalrymple, Arth Res Ther5 (Suppl4) S7-S11, 2003)。与未患类风湿性关节炎的人相比，CXCR5在关节炎患者的滑液组织中表达水平很高(Schmutz等，ArthRes Ther7:R217-R229, 2005)。因此，某些形式的本发明的抗体及其衍生物能够减少B细胞数量，并能预防B细胞在关节中的浸润和相互作用。相应地，治疗方法可包括给诊断为关节炎的患者施用其剂量足以降低B细胞水平的目的抗体。该抗体可局部地注射至受影响的关节。
[0296]在某些病症，包括银屑病关节炎(Canete等，Ann RheumDis, Janl2, 2007，do1:10:1136/ard.2006.062042)、一般慢性炎症(Aloisi &Pujol-Borrell, Nat Rev TmmB: 205-217, 2006)以及慢性移植排斥(Baddoura 等，Am JTrans5:510-516, 2005)和急性(DiCarlo 等，Am J Trans7:201-210，2007)移植排斥中，观察到了异位的淋巴样再生。CXCL13和CXCR5存在于心脏移植的情况中(DiCarlo等，同上)；CXCL13存在于银屑病关节炎的情况中(Canete等，同上)。如在正常淋巴结处所发现的那样，CXCL13和/或CXCR5的存在与具有B细胞和T细胞区域的异位淋巴结发展有关。异体抗原的B细胞抗原呈递也与急性心脏同种异体移植模型有关(Noorchashm等，JImml77:7715-7722, 2006)。
[0297]因此，目的抗体可用于减轻发炎和移植排斥。因此在移植手术之前或之后，给患者施用足以抑制B细胞活性的量的本发明的抗体，以减轻发炎、尽量减缓异位生发中心的发展、尽量减少移植后B细胞的恢复，以及尽量降低B细胞异体抗原呈递。
[0298]本发明将以下列非限制性实施例进一步为技术人员加以说明。这些实施例描述了某些本发明可以借此实施的实施方案。
实施例[0299]实施例1:免疫原的产生
[0300]抗CXCR5单克隆抗体可以针对用编码全长人CXCR5并表达于细胞表面上的DNA转化的CHO细胞(“r-CXCR5-CH0细胞”)产生。用来转化该细胞的CXCR5序列如NM001716.2、NC000011.8或NM001716可以从数据库获得，并且可以从合适的细胞来源中合成或分离。
[0301]将CXCR5可读框置于表达载体如pCDNA3.lneo_DEST内，并且随后转染至300-19细胞(免疫原)。
[0302]另外，将具有氨基酸序列，
[0303]MNYPTLEMDLENLEDLFffELDRLDNYNTSLVENHLC(SEQ ID NO:1)的 CXCR5EC 结构域通过羧基末端的半胱氨酸缀合至KLH，并且用作免疫原。腹膜内(IP)施用表达CXCR5或CXCR5EC结构域的细胞(0.2ml中的5 X IO6个细胞或100 μ I缓冲液中的50 μ g肽，任选地与100 μ I佐剂如弗氏完全佐剂混合)。抗原注射每两周加以重复直至使用任何多种已知方法，例如通过使用例如可以由例如FACS分离的CXCR5+细胞以及例如市售ΜΑΒ190 (R & D Systems)作为阳性对照的ELISA或FACS，在血清中检测到高滴度CXCR5抗体。
[0304]表达CXCR5的细胞在37 °C于5% 0)2下在补加10%透析的胎牛血清(FBS)(Invitrogen)的 RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA)中维持。通过用补加 5mM EDTA 的憐酸缓冲(无Ca/Mg)盐溶液(CMF-PBS)置换上述培养基并在该缓冲液内收获细胞而制备用于注射的细胞。收获的细胞通过在500 Xg离心约5分钟而沉淀、通过将该沉淀重悬于CMF-PBS中并如前离心而洗涤一次、计数并且通过将细胞沉淀重悬于CMF-PBS中而调整至用于注射的适宜体积(如0.2ml中的5 X IO6个细胞)。 [0305]如所提及，CXCR5表达例如通过FACS分析法，使用市售CXCR5抗体，如MAB190 (R &D)、克隆RF8B2和2G8 (2G8是大鼠抗小鼠CXCR5抗体，而其它的购买抗体是抗人CXCR5抗体)(BD)及2C1 (Abnova)以及针对hCXCR5的多种多克隆抗体，实施本领域已知方法而监测。
[0306]为方便质粒构建和为了增强CXCR5的表达，产生对应于包含CXCR5核酸编码序列的前135个碱基对的前导肽序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸在摆动编码位置内含有一些改变以降低GC含量。全部核苷酸序列改变是沉默性的，即不产生氨基酸序列改变。在寡核苷酸退火到一起后，将改造的前导肽编码序列通过PCR-SOE (Ho等，Gene77:51 (1989)和Horton等，BioTechniques8:528 (1990))与编码序列的剩余部分连接。
[0307]CXCR5的表达在作为免疫原使用之前进行验证。细胞在含有10% FBS,0.2mM谷氨酰胺和I X非必需氨基酸溶液的RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA)中培养，随后在T75摇瓶中接种每孔约3-5X IO5个细胞并且培育大约24-48小时。
[0308]转化或转染的细胞培养约二周直至不携带CXCR5表达质粒的细胞通过抗生素选择被消除。可以将稳定细胞系的细胞裂解、获得蛋白质并进行Western印迹分析。
[0309]使用用于检测CXCR5的细胞表面表达的方法，如通过FACS分析而对稳定或瞬时转染的细胞测定CXCR5的表达。另外，可以将细胞裂解并研究蛋白质，例如通过Western印迹分析进行。从培养皿中收获的转染细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤一次并重悬于去离子水中，与等体积2X蛋白质样品加样缓冲液(BioRad, Hercules, CA)混合并且随后在约100°C加热10分钟。膜蛋白使用与等体积2X蛋白质样品加样缓冲液混合并在100°C加热10分钟的条件培养基进行分析。样品使用4-12%梯度SDS-PAGE而分开。将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜(BioRad,Hercules,CA),其中所述的硝酸纤维素膜在转移蛋白质之前用PBST (含0.05% TWEEN-20?的PBS)中的5%脱脂乳封闭至少一小时。
[0310]CXCR5通过将膜与封闭缓冲液中的CXCR5特异性一级抗体在室温下温育振摇至少一小时而检测。将膜洗涤至少三次并且将封闭缓冲液中的报导分子缀合的第二抗体添加至该膜上并在室温下温育振摇至少一小时。将膜在PBST中洗涤三次并且用例如化学发光底物进行显色。
[0311 ] 实施例2 -M CXCR5mAB的产生
[0312]约4-6 周龄的 A/J 或 BALB/cJ 小鼠(Jackson Labs, Bar Harbor, ME)用 CXCR5 转染的细胞或EC肽免疫。一组小鼠在第O日用与佐剂(CFA)混合的KLH缀合肽的1:1乳剂进行腹膜内致敏(prime)，在第20日用含IFC(弗氏不完全佐剂)的所述肽和/或在无佐剂的PBS中的细胞进行静脉内加强，并且最终在第44日用混在IFC中的KLH-肽和/或在无佐剂的PBS中的细胞进行静脉内加强。另一组小鼠在第O日进行腹膜内致敏，在第15、39、53和67日进行腹膜内加强，并且最终在第81日进行静脉内加强(全部小鼠用PBS中的细胞在无佐剂下注射)。对于这两组小鼠，每一注射含有在大约200 μ I体积中的大约3 X 106-2 X IO7个细胞。备选地，肽和/或细胞免疫每两周进行一次，实施3-6次直至获得想要的抗CXCR5滴度，如通过例如FACS分析或ELISA确认。
[0313]在最后注射后3日，对小鼠任选地测试血清中的抗CXCR5抗体滴度，将小鼠处死并且取出脾脏并将其置于培养皿中的大约IOml无血清DMEM (Gibco)内。脾细胞使用钳状骨针从被膜中挑出并在37°C的IOml无血清MDM(Cellgro，Herndon, VA)中洗涤两次。将脾细胞混悬液转移至15ml锥底管中并且使碎片下沉约2-5分钟。将含有脾细胞的上清液转移至新鲜的15ml锥底管中且用MDM另外洗涤三次直至融合。可以汇集来自小鼠的脾细胞。
[0314]任选地，5ml对照性脾饲养细胞的单细胞混悬液从非免疫小鼠中基本如上文对免疫脾细胞所述加以制备并且置于培养箱(37°C，5% CO2)中直至需要。
[0315]用于免疫脾细胞的融合伴侣可以是次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)敏感性非分泌性骨髓瘤细胞系，如P3X63-AG8.653或SP2/0 (ATCC，Manassas, VA)或F0_B淋巴母细胞(ATCC，CRL-1646))。融合前，将淋巴样细胞在IMDM/10% FBS (37 °C, 7% CO2)中维持，确保该细胞在融合当日处于对数生长期。替代性选择机制依赖于使用重氮丝氨酸，其一般在融合后I日添加。
[0316]所用融合方法是在Lerner (Yale JBiol Med，1981，54 (5) 387-402)和 Gefter 等(Somatic Cell Genet，1977，3 (2) 231-236)中所述方法的综合。融合前，将汇集的脾细胞用无血清MDM洗涤三次并计数。另外，紧邻融合前，将对数期骨髓瘤细胞用无血清MDM洗涤三次并计数。淋巴样细胞在无血清MDM中重悬至I X IO7个细胞/ml。对于每次融合，将1-1.5 X IO8个脾细胞与1-3 X IO7个骨髓瘤细胞在50ml锥底聚丙烯管中混合，并且将细胞用无血清MDM洗涤一次。脾细胞对骨髓瘤细胞的比例是5:1。将该管在500Xg离心10分钟以沉淀细胞。在吸出上清液后，通过敲击管底部而柔和地重悬沉淀。随后将该管置于具有37°C水的烧杯中。全部后继融合步骤在此烧杯内实施。
[0317]接着，将预热至37 °C 的 Iml 聚乙二醇 1500 (Roche Applied Science,Indianapolis, IN)经约I分钟时间缓慢地添加至每个细胞沉淀中，同时柔和地振动试管。细胞在PEG中温育约一分钟，随后经约30秒时间逐滴添加Iml无血清MDM至每个沉淀中，并且随后将9ml无血清MDM经又一分钟添加至每个沉淀。将两支管在室温于500 Xg离心10分钟并且吸出上清液。细胞沉淀重悬在100mL滤过的完全杂交瘤生产培养基(与 10% FBS (SeraCare，Millford, MA)、0.2mM L-谷氨酰胺、I X 非必需氨基酸溶液、ImM丙酮酸钠、0.01% pen-strep (Invitrogen)和 IXHT 补充物(Invitrogen)混合的 500mlMDM(Cellgro))。
[0318]将每份100mL细胞混悬液以体积约100 μ I/孔铺种在10个96孔平底微量滴定平板中。将平板保持在37°C含7% CO2的培养箱中。在融合后第2日，通过添加每孔100μ I在MDM中的5.7 μ M重氮丝氨酸至融合细胞而选择细胞。从含有克隆的孔内抽取上清液用于初次筛选，一般在融合后10-14日。融合效率是75-99% (960个可能的孔中720-950个孔形成受到筛选的克隆)。
[0319]初次筛选可以是设计旨在检测与人CXCR5结合的抗体的放射免疫测定法(RIA)。为开展RIA，添加在PBS中亲和纯化的山羊抗小鼠IgG(F。片段特异性)(Cappell，Cochranville, PA)至96孔PVC微量滴定平板(50 μ I/孔)并在4°C温育过夜。从平板中移去山羊抗小鼠IgG并且将孔用100μ I/孔的5% FCS/PBS在室温封闭I小时。在移去封闭溶液后，添加净的杂交瘤培养上清液至孔(50 μ I/孔)中并在室温温育I小时。平板用 PBS/0.05% Tween-20 洗涤三次。接着，将 50 μ I 在 PBS/5 % FCS 中的 125I_CXCR5(~20，OOOcpm)添加至各孔，并且在室温温育I小时。最后，孔用PBS/0.05% Tween-20洗涤三次。在弹去全部洗涤缓冲液后，切开平板而将孔分开并在Y计数器中分析。向其添加5%FCS/PBS替代培养上清液的孔充当背景孔。
[0320]纯化的CXCR5根据Bolton-Hunter法，基本上如Bolton-Hunter试剂供货商(NewEngland Nuclear, Boston, MA)所述用125I标记。125I_CXCR5的质量通过证实标记过程未破坏由市售CXCR5抗体(R & D或Becton Dickinson, Mountain View, CA)识别的表位而监测。 [0321]若上清液样品在RIA中高于背景大约10倍地受到标记，则认为克隆在初次筛选时呈阳性。将阳性克隆汇集、扩充并冷冻贮存。
[0322]设计杂交瘤初级筛选法以确定抗体是否识别天然CXCR5表位。如此实现这一点，即通过FACS分析展示在用单克隆抗体染色的CXCR5+细胞上的细胞表面CXCR5，使结合作用以荧光标记山羊抗小鼠第二抗体可见。若上清液样品在FACS分析中高于背景大约10倍地受到标记，则认为克隆在初次筛选时呈阳性。另外，为定位由抗体结合的CXCR5表位，用CXCR5抗体实施竞争测定。将阳性克隆选出、扩充并冷冻贮存。
[0323]实施例3:用于抗CXCR5mAB的基于细胞的结合测定
[0324]基于细胞的结合测定用来表征抗CXCR5mAb。例如，可以使用上文所述的表达CXCR5的转染细胞如hCXCR5/HEK293。将全长人CXCR5可读框克隆至载体例如pCDNA3.1neoDEST (Invitrogen, Carlsbad, CA)。CXCR5 编码区通过使用人脑及肝脏 RNA (Ambion, Inc.,Austin, TX)作为模板的RT-PCR而合成。最终质粒构建体CXCR5/CDNA3.1neo表达了全长CXCR5蛋白。表达CXCR5的稳定细胞系通过使用标准和市售的Lipofectamine2000试剂盒转染CXCR5/pCDNA3.1neo质粒构建体至CHO或HEK293细胞(ATCC编号CRL-1573)而产生。转染后，细胞在DMEM中培养过夜，随后在含有200 μ g/ml新霉素的培养基中再接种并且培养12-14日。挑出分离的单个集落并且在单独的孔内培育直至扩增足够的克隆细胞。抗新霉素的和表达高水平CXCR5蛋白的稳定克隆通过使用抗CXCR5多克隆抗体(R&D Systems,Minneapolis, MN)或定制产生的多克隆抗体的FACS分析而鉴定。[0325]天然表达CXCR5的人HS Sultan细胞(ATCC编号CRL-1484)也通过FACS分析验证了 CXCR5表达。HS Sultan细胞在含有10%胎牛血清、0.2mM谷氨酰胺和0.1% pen/strep溶液(100 μ g/ml青霉素与10 μ g/ml链霉素)的RPMI1640中培育。
[0326]基于细胞的抗体结合作用可以使用FMAT?(荧光宏观共聚焦高通量筛选法(fluorescence macro-confocal high-throughput screening)) 8100HTS 或 8200 细胞检测系统(Applied Biosystems,Foster City, CA),按照由制造商提供的方案进行评估。天然表达CXCR5的或用CXCR5表达构建体稳定转染的细胞系在96孔平板中接种。备选地，在96孔平板中接种瞬时转染的293T或CHO细胞。细胞以密度5，000-30，000个细胞/每孔接种。20-24小时后，将抗CXCR5mAb和FMAT-缀合的山羊抗小鼠IgG抗体一并添加至孔内并且在室温下温育I小时、2小时、4小时或过夜。
[0327]基于细胞的抗体结合作用还通过使用表达CXCR5的HEK293/CXCR5稳定细胞系的FACS进行评估。细胞与PBS中的抗CXCR5mAb温育。在洗涤三次后，将细胞与荧光分子缀合的第二抗体(BDSciences, Palo Alto, CA)温育。
[0328]结果显示几种mAb结合从每个重组质粒构建体中表达的CXCR5。例如，测试了克隆 11D6、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6、79B7 和 16D7 以及后一抗体 16D7 的人源化变体16D7-HC1-LC3、16D7-HC1-LC2、16D7-HC1-LC1 和 16D7-HC2-LC1、阴性对照 IL13 抗体 CA13、阳性对照MAB190、2C1和RF8B2、三种针对IgGl、IgG2a和IgG2b的小鼠同种型对照以及大鼠IgG2b同种型对照(与RF8B2匹配)与被转染以表达CXCR5的HEK293细胞的结合作用。2C1和MAB190阳性对照抗体与CXCR5细胞结合。RF8B2显示中等结合水平。阴性对照抗体仅显示背景结合作用。除CA13之外的全部抗体以如亲代抗体16D7和79B7那样的相似结合模式和滴定动力学与hCXCR5/HEK293细胞结合。
[0329]含有CXCR5/neo质粒的瞬时转染HEK293细胞也用如上所述的免疫荧光法染色并且通过荧光显微镜检观察。基于细胞的FMAT和FACS分析证实mAb确实与从重组质粒构建体中或作为培养细胞中天然蛋白质表达的CXCR5结合。阳性结合信号基于显著高于背景结合作用和其它阴性杂交瘤克隆(P>0.01)的FMAT信号读数而确定。
[0330]产生的CXCR5mAb (如 16D7、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6 及 79B7)与 EC 结构域结合并阻断CXCL13与细胞上的CXCR5结合。
[0331]实施例4:BIAC0RE亲和力分析
[0332]来自人和小鼠的CXCR5的氨基末端EC区(氨基酸1_59)随末端生物素标签一起合成，并且在正向模式(forward format) Biacore测定中使用，其中将肽固定于Biacore芯片上并且随后测定抗体与芯片上的肽相互作用的动力学。合成性肽以大约20个应答单位(RU)固定在Biacore芯片上。随后使mAb按照制造商推荐(GE Healthcare, Piscataway,NJ)暴露于该芯片以便测量动力学。
[0333]小鼠抗hCXCR5mAb克隆16D7具有计算的KD2.16_12M ;小鼠/人IgG4嵌合16D7 (移植至人IgG4Fc上的16D7VH和VL区，其序列是本领域已知的，任选地是密码子优化的，使用标准方法如克隆法、末端扩增法确认所述区域的质量并克隆所述部分)具有KdL 41-12Μ ;并且就移植至IgG4主链上的16D7的多种人源化变体而言，其中变体的结构及其重链和轻链的衍生化由用于特定重链的” HC_”和用于特定轻链的” LC_”术语说明，其中链的组成在下文提供，16D7-HC1-LC1 具有 KD3.1T12M ；16D7-HC1-LC2 具有 KdL 41-12Μ ; 16D7-HC2-LC1 具有Kd2.4(T12M ；16D7-HC1-LC3 具有 KD1.21~12Μ ; 16D7-HC3-LC4 具有 KD4.92_12M ； 16D7-HC3-LC5 具有 KD1.8[10M 并且 16D7-HC1-LC6 具有 KD9.17-11M。
[0334]人源化SAR113244，一种16D7的人源化变体形式，带有S241P和L248E替代的16D7-HC1_LC3(替代通过采用已知方法和试剂用Kabat编号引入)，在Biacore芯片上由预固定的小鼠抗人IgG Fe抗体捕获，并随后用于反向测定模式Biacore测定，其中测定了未加标签的人CXCR5氨基末端肽(氨基酸1- 59)与该芯片上的mAb相互作用的动力学。SARl 13244的Kd被确定是1.13±0.08_nM。使用固定在芯片表面上的生物素化的人肽和SARl 13244作为分析物，以正向测定测定的Kd值与使用反向测定获得的那些Kd值是一致的。
[0335]实施例5:抗CXCR5mAb结合活性的Western印迹分析
[0336]开展Western印迹以评估变性条件下抗CXCR5mAb对CXCR5的结合活性以及人细胞系中CXCR5和其它CXCR5相关性蛋白质的表达水平。蛋白质样品也从稳定转染的细胞中，使用M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂盒(Pierce，Rockland, IL,目录编号78501)按照制造商说明书制备，并且在添加等体积的2X蛋白质样品加样缓冲液后在70°C加热10分钟。全部样品通过电泳在4-12%梯度SDS-PAGE凝胶中分开。蛋白质从凝胶转移至PVDF膜并且施加抗CXCR5mAb作为一级检测抗体至Western印迹膜上。Alexa680_缀合的第二抗体用于检测并且使用Odyssey红外成像系统(Li_cor, Lincoln, Nebraska)或使用电化学发光法(ECL)扫描该膜。抗人CXCR5的阳性对照抗体如本文中所教授那样产生。
[0337]实施例6:用于监测CXCR5内化FACS测定
[0338]暗黄覆盖层细胞从健康志愿者(Gulf Coast Blood Center,Houston, TX)获得。人外周单核细胞(PBMCs)以标准Ficol1-Hypaque梯度方法予以分离。PBMC在96孔平板中于4°C培养(0.5 X IO6 个细胞/孔)。各孔含有补加10% FBS的存在/不存在单克隆抗体(10 μ g/ml)的0.2ml RPMI16400 30分钟后，培养基用补加10% FBS和无抗体的新鲜的冷RPMI1640替换。将细胞转移至含5% CO2的371:调湿组织培养箱。单克隆抗体处理的细胞在细胞转移至37°C后立即收获、2小时或24小时后收获。细胞用PBS洗涤一次并在含1%BSA的冷PBS (PBSB)中温育30分钟。细胞随后用PE-缀合的抗人CXCR5 (BD Biosciences)染色。30分钟后，细胞用PBSB洗涤三次并在1%多聚甲醛溶液中固定过夜。次日，CXCR5的存在用 BD FACSCalibur? 系统流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, CA)分析。
[0339]实施例7 = FLIPR测定
[0340]胞内钙的变化通过铺种9000个细胞/孔并温育过夜而测量。细胞是用人CXCR5稳定转染的RBL-2H3系。随后洗涤细胞并且随后载入在含有2.5mM丙磺舒(probenicid)的缓冲液中的2mM氟-4/AM(Molecular Probes)。细胞暴露于CXCR5mAb，随后用分析缓冲液洗涤。细胞暴露于IOnM CXCL13 (R & D)。胞内Ca+2的变化使用384-B FLIPR仪(MolecularDevices)记录。市售抗人CXCR5mAb和小鼠IgGl及IgG2b用作对照。
[0341]如本文以下所讨论，构建了 mAbl6D7的几种人源化形式，如嵌合16D7 QiIgG4嵌合体)、16D7-HC1-LC1、16D7-HC1-LC2、16D7-HC2-LC1、16D7-HC1-LC3、16D7-HC3-LC4、16D7-HC3-LC5和16D7-HC1-LC6，并且对它们测试如由钙流所示的生物活性。
[0342]除阴性对照CA13以外，人源化抗体显示了与稳定表达CXCR5的转染细胞上亲代16D7抗体等同的信号中和活性。
[0343]实施例8:趋化性测定[0344]将CXCR5+HS Sultan 细胞(ATCC CRL1484)以 0.5 X IO6 个细胞 / 孔在 IOOnMCXCL13 (R & D)或CTX缓冲液(无酚红的RPMI，含有I % FBS,0.5% BSA和InM丙酮酸钠)存在下添加至transwell平板(Millipore)的上室中并评估到达下室的迁移性细胞。将这两个室装配并温育2小时。下室中的细胞在添加比色试剂(Promega)及在OD49tl上读数后进行计数。
[0345]将CXCR5特异性迁移确定为迁移的细胞总数与自发迁移性细胞数目之间的差异。若测试抗CXCR5，则细胞在添加至上室之前与该抗体温育30分钟。抗体抑制的程度是抗体存在下的特异性迁移与抗体不存在下的迁移量的比率。该比率可以乘以100%以产生公制的抑制百分数。
[0346]实施例7的抗体与亲代16D7抗体就中和趋化性的能力加以比较。除阴性对照mAbCA13之外的全部人源化抗体以与16D7及79B7、14C9、19H5、H28、54G6、G7、56H6的模式可比的模式中和趋化性。R&D MAB190具有中等活性而H28和Abnova抗体2C1没有彻底中和配体诱导的细胞迁移。
[0347]实施例9:原代人B细胞反应性测定
[0348]使用Accuspin柱(Sigma)从全血中分离人PBMCt5PBMC随后以二千万个细胞/ml重悬于BD Stain缓冲液(Becton Dickinson)中。将I μ g小鼠抗人CXCR5单克隆抗体添加至50 μ I PBMC中并且允许其在4°C结合20分钟。细胞用BD Stain缓冲液洗涤2次。将1/100稀释的50μ I第二抗体即山羊抗小鼠IgG-PE F(ab，)(Beckman Coulter)添加至PBMC-抗体混合物内并且允许其在4 °C结合20分钟。细胞用BD Stain缓冲液洗涤三次。含有1/50稀释的小鼠抗人CD20-FITC(BD)与CD4_APC(BD)的混合物分别添加至细胞上，所述细胞随后在4°C温育20分钟以评估B/T细胞特异性。细胞用BD Stain缓冲液洗涤三次并且重悬于250 μ I BD Stain缓冲液中并且在FACStar Plus上进行FACS分析。小鼠抗人CXCR5抗体(R&D ；mAbl90)用作阳性对照。产生人源化抗体的滴定曲线并且将平均荧光强度(MFI)对浓度作图。
[0349]对实施例7的人源化抗体测试与人PMBC的结合作用。
[0350]除阴性对照CA13之外，抗体均在人B细胞上结合并且具有相同的滴定模式。阴性对照CA13仅显示背景结合作用。BD克隆RF8B2与人PBMC结合不佳。
[0351]实施例10:短尾猴B细胞反应性测定
[0352]短尾猴(cyno)全血从Bioreclamation, Inc.(Hicksville, NY)获得。血液在离心后装入BD细胞制备管(CPT)。将血浆层中所含的短尾猴PBMC从CPT管中移至一支50ml管而不扰动梯度凝胶层。该管用5ml PBS洗涤以彻底提取全部细胞并且将洗液添加至50ml的新管。将短尾猴PBMC在4°C于1200转/分钟离心10分钟。将沉淀重悬于ImlBD FACSStain缓冲液(BD)中。每次测定使用一百万个细胞。将I μ g(纯化的)小鼠抗人CXCR5单克隆抗体添加至50 μ I PBMC并且允许其在4°C结合20分钟。细胞用BD Stain缓冲液洗涤2次。将1/100稀释的50 μ I第二抗体即山羊抗小鼠IgG-PE F(ab，)(Beckman Coulter)添加至细胞并且允许其在4°C结合20分钟。细胞用BD Stain缓冲液洗涤三次。将含有1/20分别稀释的小鼠抗人⑶20-FITC(BD)和⑶4-APC(BD)的混合物添加至细胞上，以便在4°C温育20分钟以评估B/T细胞特异性。细胞用BD Stain缓冲液洗涤三次，并且重悬于250 μ I BD Stain缓冲液中并在FACStar Plus上进行FACS分析。商业性小鼠抗人CXCR5mAb (R&D ；MAB190)用作阳性对照。
[0353]对人CXCR5反应的本发明的小鼠单克隆11D6与IgG同种型对照比较。测试16D7的人源化形式及市售MAB190对短尾猴CXCR5的反应性。也测试了 79B7。
[0354]对⑶20和CXCR5呈阳性的细胞用MAB190及11D6找到。另一方面，16D7及其人源化变体以及G7和BD RF8B2及Abnova2Cl均不与短尾猴B细胞结合。14C9、19H5、H28、54G6、56H6和79B7也结合短尾猴B细胞。
[0355]本发明的CXCR5抗体用来研究外周血细胞。B细胞表达CXCR5并且在至少一个实验中，发现约10%外周T细胞表达CXCR5。
[0356]实施例11:抗CXCR5mAB的测序
[0357]小鼠单克隆抗体使用市售同种型试剂盒进行同种分型。对16D7及其它抗CXCR5mAb的可变序列测序。总RNA使用Qiagen Qianeasy微量制备试剂盒,按照试剂盒的方案，从约5百万个杂交瘤细胞中分离。使用Invitrogen Superscript试剂盒(目录编号11904-018)合成第一链cDNA，试剂盒方案如下。
[0358]重链可变区及轻链可变区首先基于Wang等J Tmmunol Methods.233:167-77, 2000中所述方法，使用下列简并性PCR引物及Taq聚合酶(Roche)扩增。
[0359]重链:左引物:
[0360]I:CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO:2)
[0361 ] 2:CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEQ ID NO:3)
[0362]重链:右引物:
[0363]GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQ ID NO:4)
[0364]轻链:左引物:
[0365]GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO: 5)
[0366]轻链:右引物:
[0367]TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ ID NO:6)
[0368]其中R是A或G;N是A、G、T或C;M是A或C;W是A或T;S是G或C ;并且Y是C或T。
[0369]将PCR产物使用Invitrogen TOPO TA克隆?试剂盒(目录编号:45_0641)克隆至
PCR4-TOPO?并且使用T3和T7引物测序。序列随后对基因文库数据库blast以推导用
于克隆全长可变区的前导序列。基于blast结果，以下引物(Chardes等,FEBS Letters452:386-394,1999)选择用于使用Pfx聚合酶(Invitrogen)的第二轮PCR扩增。
[0370]重链:
[0371]左引物:
[0372]CCAAGCTGTGTCCTRTCC (SEQ ID NO:7)
[0373]右引物:
[0374]CGACAAGTCGACTAGCCCTTGACCAGGCATCC(SEQ ID NO:8)
[0375]轻链:
[0376]左引物:
[0377]WTCTCTRGAGTCAGTGGG (SEQ ID NO:9)[0378]右引物:
[0379]CGACTAGTCGACTGGTGGGAAGATGGATACAG(SEQ ID NO: 10)
[0380]将PCR产物使用Invitrogen Zero Blunt? TO PO? PCR克隆试剂盒(目录编号45-0245)克隆至pCR-Blunt II?-TOPO?并且使用Τ7引物测序。
[0381]一旦测出轻链及重链的序列，核酸可以被再编码以优化例如人宿主细胞中的表达。
[0382]实施例12:转染瘤
[0383]将NSO-eu细胞培育至密度IX IO6细胞/ml。细胞维持在指数生长期并且在转染前日更换培养基。在转染当日，洗涤40X IO6个细胞。随后，将IOyg线性化核酸例如轻链DNA和10 μ g例如线性化重链DNA添加至细胞混悬液(总DNA体积应当少于50 μ I)并且在冰上孵育培养物15分钟。把DNA与细胞的混合物转移至冷冻的透明小容器(cuvette)(0.4cm)并且施加电脉冲(750V和25yF)。透明小容器在电脉冲处理后立即置于冰上并且在冰上保持10-15分钟。收集细胞并且铺板。将细胞在5% CO2培养箱中温育12-16日或直至集落出现。以混悬培养方式培育的细胞集落或细胞的上清液通过ELISA进行测试并且将阳性转染瘤在新鲜培养基中克隆。为进一步筛选阳性转染瘤，实施了滴定ELISA或Biacore测定。将扩充的转染瘤在摇瓶中维持并且从上清液中收集抗体或其衍生物。
[0384]实施例13:体内测定
[0385]胶原诱导的关 节炎(CIA)是充分建立的人RA模型，已经用来证实抗体对TNF α的效力(Williams 等，PNAS1992，89:9784-9788)以及对 CTLA-4 与 TNF α 融合蛋白(Webb 等，Eur J Immunol.1996,26:2320-2328 ;和 Wooley 等，J Immunol.1993，151:6602-6607)的效力。一种大鼠抗小鼠CXCR5单克隆抗体即克隆1038在CIA的小鼠模型中得到描述，其中DBA/1 J小鼠用鸡II型胶原免疫并加强免疫。疾病严重性(其以眼观察方式通过测量爪肿胀/发炎而记分)每周监测两次，同时在研究结束时对收集的关节评估炎症变化、关节翳、软骨破坏和骨侵蚀。与同种型处理的CIA小鼠相比，克隆1038在以预防剂量方案施用时显著地减少疾病严重性和关节病理学(重复测量AN0VA，p<0.05)。
[0386]使用急性小鼠模型以评估16D7-HC1-LC3在体内趋化性方面的效力。简而言之，在免疫细胞如B细胞、T细胞和嗜中性粒细胞上选择性表达huCXCR5的C57/B16小鼠(8_16周龄)通过使用CDlla启动子的传统转基因方法而产生。体内趋化性模型是嗜中性粒细胞驱动的模型。当腹膜内施用20 μ g huCXCL13配体(R&D)时，表达huCXCR5受体的小鼠嗜中性粒细胞应答huCXCL13梯度而迁移至腹膜腔。腹膜腔洗液用来在腹膜内施用huCXCL1380分钟后恢复细胞并且使用荧光细胞计数分析来定量2ml腹腔灌洗样品中应答于huCXCL13滴注而特异性迁移至腹膜腔的表达huCXCR5的嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞通过表型标记如Ly6G、⑶19和⑶Ilb而鉴定。与同种型处理的对照相比时，在滴注huCXCL13之前24小时以两个不同剂量(7.5 μ g或15 μ g)皮下施用抗hCXCR5人源化16D7-HC1LC3显示在减少表达huCXCR5的嗜中性粒细胞应答于huCXCL13时迁移至腹膜腔中的效力，CXCR5抗体处理的两种样品在与嗜中性粒细胞的同种型阴性对照水平相比时显示基本上无统计学差异的嗜中性粒细胞水平。与所测试CXCR5抗体的较高剂量相比，在1.5 μ g上的人源化CXCR5抗体显示低水平的嗜中性粒细胞迁移抑制。[0387]实施例14:再表面化(resurfacing)
[0388]鼠16D7克隆的再表面化按照Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1994) 91:969和美国专利5，639，641中所述的步骤进行。
[0389]16D7 的 Vl 和 Vh 序列对蛋白质数据库(Protein Data Bank) (Nucleic AcidsResearch，28:235-242 (2000)blast或可以登录因特网上含有生物大分子的3D坐标的蛋白质数据库O3DB)，并且检索与16D7的轻链及重链氨基酸序列最相似的10个轻链及重链氨基酸序列。PDB身份编码用于确定所述序列。
[0390]可变轻链的10个最接近的同源物是IMJUCJ Mol Biol332:423-435，2003), 1AE6 (Proteins29:16 1-17 1, 1997), 1QYG(Pozharski 等，"Carving aBinding Site:Structural Study of an Ant1-Cocaine Antibody^in "Complexwith Three Cocaine Analogs")、IUZG (J Viro179: 1223，2005)、1UB5 (Beuscher等,"Structure and Dynamics of Blue Fluorescent Antibodyl9G2at Blue and VioletFluorescent Temperatures")、IRUR(Proc Natl Acad Sci USAl10:2247-2252，2004、IFPT (Nat Struct Biol2: 232-243，1995)、IQFU (Nat Struct Biol6:530-534，1999)、INAK(Virology315:159-173，2003)和 ICGS (J MoI Bio1236:247-274，1994)(多余序列被除去)并且可变重链的10个最接近的同源物是IFNS (Nat StructBiol7:881-884, 2000)UOAK(Nat Struct Biol5:189-194，1998)、IVFB (Proc Natl AcadSci91:1089-1093, 1994)、ICIC(Nature348:254-257，1990)、IGIG (Acta Crystallogr DBiol Crystallogr50:768-777, 1994)UT4K(J Mol Biol343:1269-1280, 2004)、1A7P(Marks等)、lFE8(JBiol Chem276:9985-9991, 2001) UDL7(J Exp Medl91: 2101-2112, 2000)和1YY8 (Cancer Cell 7:301_311，2005)。所述轻链及重链最接近的同源物分别是IMJU和IFNS0这两个序列用来构筑可变结构域的同源性模型，该模型随后通过原子坐标位置的共轭梯度最小化作用，用如在MOE软件包(Chemical Computing Group, Quebec, CA)中执行的 CHARMM22 力场(J Comput Chem(1983) 4，187 ；J Comput Chem(1986) 7，591)而实现能量最小化。此模型用来定位CDR区和框架残基。计算对每个抗体可变区的10个最接近同源物的每个可变区残基的溶剂可及性并且在如Scitegic方法(Hill & Lewicki (2006)Statistics:Methods and Applications, Statsoft, Tulsa, OK)内执行的 Excel 表格程序中予以平均。具有大于30%平均可及性的位置视为表面残基。具有25%-30%之间平均可及性的位置也视为依赖与CDR环的接近度。
[0391]将鼠16D7可变区的表面位置与人抗体序列中的相应位置比较。这种搜索仅留下了显示大于30%可及表面积的那些残基以及显示大于25%可及表面积并且分布在溶剂暴露性残基侧翼的少量残基。包括在完整免疫球蛋白序列中的一些保守残基以改善搜索的趋同性。仅保留种系序列用于命中分析。选择具有最多相同表面残基的人抗体可变区表面，
特别考虑在⑶R的5.0 A范围内的位置，以替换鼠16D7抗体可变区的表面残基。
[0392]序列均不含有免疫表位数据库(Immune Epitope database) (IEDB,免疫表位数据库和分析资源网站；PLoS Biol.2005 ；3(3):e91)中所列的任何已知B细胞或T细胞表位。
[0393]鼠16D7可变结构域的原初序列是:
[0394]轻链(对⑶R加下划线):
[0395]DIVMTQAAPSVAVTPRESVSISCRSSKSLLHSSGKTYLYffFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:11);和
[0396]重链(对⑶R加下划线)
[0397]QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLIDYGVNfflRQPPGKGLEffLGVIffGDGTTYYNSALKSRLSIRKDNSQSQYFLKMNSLQTDDTAMYYCARIYYffGQGTLYTYSA(SEQ ID NO:12)。
[0398]对于轻链搜索留下的表面残基组包括01、￥3、么7、？9、？15、1?16』17、518、？45、646、Q47、D65、R79、R82、E86、K108、E110 和 K112。
[0399]对轻链的提交项含有如上所定义的表面残基组和为BLAST方法趋同性而包括的保守氨基酸C23、W40、Q43、Y91、C93、F103、G104、G106及T107。全部其它氨基酸可以是20种天然氨基酸中的任何一种。对IMGT编纂的人种系抗体序列数据库(国际免疫原信息系统网站，Molec Immunol, 2004,40:647-659)进行BLAST搜索。发现最佳记分匹配是从其中衍生轻链LC4的X72482(蛋白质」d = CAA51150.1)。LC5和LC6是VL4 (VL是指可变轻链)的两个变体，据称所述的两个变体解决了轻链中可能有问题的残基:欲突变成Leu的I个暴露性甲硫氨酸(M51) (LC5和LC6)和I个潜在脱酰胺位点(LC6)，其中天冬酰胺N53改变成丝氨酸残基。总之，对可变轻链提出了与亲代鼠16D7克隆相比时含有4-6个突变的3种形式。在下表1中给出相应的突变。给出了序列编号和Kabat编号。
[0400]留下的表面残基组对于可变重链包括Ql、Q3、K5、S7、P9、L11、S15、Q16、S20、P41、G42、K43、S61、A62、K64、S65、R70、S74、Q75、Q86、T87、D88、Q103、L106、A111、A112 和 K113(序列编号)。在BLAST提交项中包含用于搜索趋同的非变异氨基酸是:C22、W36、I37、Q39、D89、Y93、C95、WlOU G102、G104和T105。对MGT编纂的人种系抗体序列数据库进行BLAST搜索。留下了重链(HC3)的一种形式。对所述表面残基组显示最佳匹配记分的AF062266(蛋白质_id = AAC18304.1)和AY393082 (蛋白质_id = AAS86018.1)的两个Vh结构域显示等效的相似性记分并显示相同的表面残基。因此，仅留下含10个突变的该重链的单个序列。未留下具有不同表面残基的记分较低的序列，因为它们具有暗示潜在降低的溶解性的较少极性残基。
[0401]表1
[0402]
【权利要求】
1.制备人源化抗体或其片段的方法，其包括: (a)鉴定与非人抗体的可变区同源的人的可变区； (b)使用步骤(a)中鉴定的人可变区构建非人抗体的可变区的同源模型，并且进行分子动力学模拟以获得非人抗体的可变区的分子动力学轨迹； (c)分析非人抗体的可变区的分子动力学轨迹，并且确定氨基酸灵活性记分以鉴定非人抗体可变区中的柔性氨基酸和柔性残基侧翼的氨基酸； (d)构建人抗体种系的同源模型，并且进行分子动力学模拟以获得人抗体种系的可变区的分子动力学轨迹； (e)分析人抗体种系的可变区的分子动力学轨迹，并且确定氨基酸灵活性记分以鉴定人抗体种系可变区中的柔性氨基酸和柔性残基侧翼的氨基酸； (f)鉴定展示出与非人抗体的可变区的分子动力学轨迹最相似的分子动力学轨迹的人抗体种系的人可变区，并且通过比较步骤(C)和(e)的最柔性氨基酸的灵活性记分来鉴定人源化突变； (g)用所述步骤(f)鉴定出的氨基酸替换所述步骤(C)鉴定出的氨基酸，以产生人源化可变区； (h)通过比较人源化可变区分子动力学轨迹与人抗体种系的可变区的分子动力学轨迹，证实步骤(g)的人源化可变区类似于人抗体；和 (i)将步骤(g)所述的人源化可变区与人序列连接，以产生人源化抗体或其片段。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(g)包括不替换离互补决定区5A以上的氨基酸。
3.如权利要求1所述的方法，其还包括通过将所述人源化可变区序列与一组人抗体序列的序列相比较，证实步骤(g)所述的人源化可变区与人抗体相似。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(g)所述的人源化可变区不包含B细胞表位或T细胞表位。
5.制备特异性结合人CXCR5的胞外结构域的人源化抗体或其片段的方法，其包括: (a)鉴定与非人CXCR5抗体的可变区同源的人的可变区； (b)使用步骤(a)中鉴定的人可变区构建非人CXCR5抗体的可变区的同源模型，并且进行分子动力学模拟以获得非人抗体的可变区的分子动力学轨迹； (c)分析非人抗体的可变区的分子动力学轨迹，并且确定氨基酸灵活性记分以鉴定非人抗体可变区中的柔性氨基酸和柔性残基侧翼的氨基酸； (d)构建人抗体种系的同源模型，并且进行分子动力学模拟以获得人抗体种系的可变区的分子动力学轨迹； (e)分析人抗体种系的可变区的分子动力学轨迹，并且确定氨基酸灵活性记分以鉴定人抗体种系可变区中的柔性氨基酸和柔性残基侧翼的氨基酸； (f)鉴定展示出与非人抗体的可变区的分子动力学轨迹最相似的分子动力学轨迹的人抗体种系的人可变区，并且通过比较步骤(C)和(e)的最柔性氨基酸的灵活性记分来鉴定人源化突变； (g)用所述步骤(f)鉴定出的氨基酸替换所述步骤(C)鉴定出的氨基酸，以产生人源化可变区； (h)通过比较人源化可变区分子动力学轨迹与人抗体种系的可变区的分子动力学轨迹，证实步骤(g)的人源化可变区类似于人抗体；和 (i)将步骤(g)所述的人源化可变区与人序列连接，以产生特异性结合人CXCR5的胞外结构域的人源化抗体或其片段。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述步骤(g)包括不替换离互补决定区5人以上的氨基酸。
7.如权利要求5所述的方法，其还包括 通过将所述人源化可变区序列与一组人抗体序列的序列相比较，证实步骤(g)所述的人源化可变区与人抗体相似。
8.如权利要求5所述的方法，其中步骤(g)所述的人源化可变区不包含B细胞表位或T细胞表位。
【文档编号】C07K16/28GK104017079SQ201410307453
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2008年8月27日 优先权日:2007年8月29日
【发明者】R·李, V·米克尔, E·阿兰, N·鲁特施, B·卡莫隆, T·奥利吉诺, N·鲍里恩 申请人:塞诺菲-安万特股份有限公司