一种桔小实蝇抗菌肽及其衍生物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种桔小实蝇抗菌肽及其衍生物和应用。该抗菌肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。其衍生物为经过修饰得到的具有抗菌效果的活性衍生物，或经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有抗菌功能的桔小实蝇抗菌肽衍生物。本发明获得的桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003具有生物活性，具有广泛的抗菌作用。因此，本发明的桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。
【专利说明】一种桔小实蝇抗菌肽及其衍生物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种桔小实蝇抗菌肽及其衍生物和应用。
【背景技术】
[0002] 昆虫是非常庞大的生物种群之一，据估计，世界上昆虫的种类大约有800万，占整 个动物数量的95%以上，其个体数量超过千百种，昆虫的分布相当广泛，几乎所有生态环境 都有昆虫的踪迹，这些特殊环境都表明了昆虫本身具有极强的适应生存能力和防御外界能 力，昆虫本身的防御系统并不同于脊椎动物，其没有完善的B淋巴系统和T淋巴系统，也没 有完善的免疫球蛋白和补体存在，大量研究结果表明，在昆虫感染病原菌或可能导致病原 菌感染的情况下，昆虫自身都能快速合成大量的具有杀菌作用的抗菌肽，迅速杀灭已侵入 机体的病原菌，并阻止病原菌的继续侵染，此特殊的防御系统使得昆虫抗菌肽成为人类生 命科学研究领域的热点，因此，研制高效的、新一代的，并且对人类和动物及环境都具有安 全保障的抗菌制剂，已经成为当今科学研究领域的新课题。
[0003] 二十世纪七十年代，瑞典科学家Boman等首先发现了以天蚕素命名的昆虫抗菌 肽，以惜古比天蚕为实验材料，注射錯状芽抱杆菌诱导其产生 cecropin。据统计，目前科学研究者己经相继从家蝇、家蚕、作蚕、菌麻蚕、烟草天蛾、肉蝇 及多种昆虫中分离得到200多种昆虫抗菌肽。根据其氨基酸组成结构和生物特性，可将昆 虫抗菌肽大致分为以下四类：形成两亲性a-螺旋的线状抗菌肽；具有二硫键的环状或末 端开放的抗菌肽；富含脯氨酸的抗菌肽（Proline-rich peptides);富含甘氨酸的抗菌肽 (Glycine-rich peptides)。
[0004] 由于昆虫种类巨大，还有很多新的昆虫抗菌肽未被鉴定发现。桔小实蝇 ifectrocera Hendel是果蔬的重要害虫，属双翅目Diptera、实妮科Trypetidae、 寡毛实蝇亚科Dacinae，在广东省目前也是导致柑橘、枇杷等果树挂果时为害特别严重的害 虫之一。作为双翅目昆虫的桔小实蝇，在它的基因组内，理论上应该有抗菌肽基因，党向丽 等（2012)从桔小实蝇中分离出抗菌肽Bactrocerin-2,除此之外，相关研究鲜有报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种桔小实蝇抗菌肽及其衍生物。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述桔小实蝇抗菌肽及其衍生物在制备抗菌产品中 的应用。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 一种桔小实蝇抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0008] -种桔小实蝇抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0009] -种桔小实蝇抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示或其反向互补序列。
[0010] 一种桔小实蝇抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示或其反向互补序列。
[0011] 一种桔小实蝇抗菌肽衍生物，该衍生物为SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基 酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2功能相同的氨基酸序列。
[0012] 一种桔小实蝇抗菌肽衍生物，该衍生物为SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基 酸序列的化学修饰物。
[0013] 进一步的，上述化学修饰包括乙酰化、氨基化、甲基化、磷酸化、糖基化、脂基化、泛 素化、生物素标记、荧光蛋白标记。
[0014] 本发明的有益效果是： 本发明提供了一种桔小实蝇抗菌肽，无溶血活性，具有生物安全性，经实验证明，对多 种细菌，如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌具有抑菌活性，可用于抗病原微生物感染的 生物技术产品研发。以桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003氨基酸序列或基因序列为基础，通过基 因工程、蛋白质工程、发酵工程、转基因和其它生物技术手段，可以大规模获得桔小实蝇抗 菌肽蛋白，用于抗病原微生物感染的生物技术产品研发。
[0015] 本发明获得的桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003具有生物活性，具有抗菌作用。分离纯 化的桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003对金黄色葡萄球菌的MIC为5l^g/mL。因此，本发明的桔小 实蝇抗菌肽BH-AMP003可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、 防腐剂、医药产品如抗菌药物等。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为经诱导后的桔小实蝇幼虫cDNA文库重组质粒的酶切鉴定电泳图谱； 图2为质粒载体pPIC3. 5K的物理图谱； 图3为重组质粒载体的PCR鉴定，图中：M为DNA Marker DL2000 ;1为以空载体 pPIC3. 5K质粒为模板的扩增产物；2、3、4、5为转化子的扩增产物； 图4为含抗菌肽的重组载体的构建流程图； 图5为重组酵母转化子的PCR鉴定，M为DNA Marker DL2000 ;1为阴性对照；2、3为酵 母重组菌株的菌落PCR扩增产物； 图6为重组酵母菌株诱导抗菌肽表达，经过分离纯化后SDS-PAGE电泳检测，M为 Protein Marker, 1为纯化后的抗菌肽； 图7为桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003对金黄色葡萄球菌的抑菌活性：孔1 :加入100ML的 对照溶液(不含抗菌肽);孔2 :加入100ML的2. 5 Mmol/L桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003 ;孔3 : 加入100ML的5. 0 Mmol/L桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003 ;孔4 :加入100ML的10 ? OMmol/L桔 小实蝇抗菌肽BH-AMP003 ;孔5 :加入100ML的20. 0 Mmol/L桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003 ; 图8为桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D31、沙门氏菌、尿肠 球菌、动物致病大肠杆菌的抑菌实验结果，孔1加入氨苄青霉素；孔2加入阴性对照CldH2O ; 孔3、4、5加入的为本发明制备的毕赤酵母工程菌表达的桔小实蝇抗菌肽； 图9为桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003抗菌活性的热稳定性试验结果分析； 图10为桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003抗菌活性的耐酸稳定性试验结果分析。
【具体实施方式】
[0017] 本发明通过ScanProsite对桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003蛋白功能的预测结果得出 该蛋白是一个富含半胱氨酸的抗菌肽，主要存在于节肢动物（昆虫、虱、蜘蛛、蝎），双壳软 体动物和真菌体内。这六个保守的半胱氨酸都含有链内二硫键，并组成三对二硫桥结构(第 38位与第65位氨基酸，第51位与第71位氨基酸，第55位与第73位氨基酸)，其抗菌谱以 抗革兰式阳性菌为主。
[0018] 桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003的序列来自下文实施例1中桔小实蝇诱导幼虫cDNA 文库中所克隆到的5条高度同源的EST序列，对该序列进行生物信息学分析显示其cDNA序 列长度为225bp (不包含终止密码子，核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示)，编码75个氨基酸 残基的前体肽如(氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示)。进一步分析显示，该前体肽的第1-21 位氨基酸残基为其信号肽区域，将前体肽的前导肽和成熟肽部分分开，故确定BH-AMP003 成熟肽的氨基酸序列为AGCIKNGGRCVASGGPPYCCSNYCYRQVGWAHRYCKNR，即序列表中SEQ ID NO : 1所示的氨基酸序列。该成熟肽含有6个半胱氨酸，这6个半胱氨酸在已经发现的昆虫 防御素中高度保守，并形成三对二硫键，且后续的实验证明其具有抗菌活性，故桔小实蝇抗 菌肽BH-AMP003为新的昆虫抗菌肽成员。
[0019] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0020] 实施例1混合菌诱导桔小实蝇幼虫cDNA文库的构建及EST序列分析 采用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌K12D31混合菌针刺桔小实蝇幼虫，诱导24小时后， 参照invitrogen TRIzol Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书提取桔小实蝇幼虫的 总RNA，观察到18S和28S特征条带整齐清晰，亮度比接近1:2,同时经过紫外分光光度 计测定0D 26(i/0D28(i=1. 82,说明总RNA的质量较好。文库构建采用Clontech公司Smart cDNA Library Construction Kit试剂盒，并利用试剂盒本身附带的引物、载体、限制 性内切酶等进行实验。取1呢桔小实蝇幼虫的总RNA，以SMART III寡聚核苷酸片断 (5 ' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3，）和 CDSIII/3 ' PCR 引物（5 ' -AITCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (T) 3(|沁#-3 '）进行逆转录合成第一链，得到 5 ii L cDNA 第一链产物。取 2uL第一链产物以 5' PCR 引物（5'-AAGCAGTGGTATAAC GCAGAGT-3'）、 CDSIII/3' 引物（5, - ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd (TLN-iN-S，）进行 LD-PCR (long-distance PCR)扩增，将cDNA双链经蛋白酶K消化并纯化后用限制性内切酶S//I进 行酶切处理，用Chroma SPIN-400将cDNA按分子大小分部，除去小于400bp的片段，将分部 好的cDNA用T4 DNA连接酶连接到以相同限制性内切酶S/7I酶切处理过的文库构建载体 质粒上。转化Iu L连接产物，取200 UL转化液稀释到合适浓度后涂板。随机挑取单克隆， 摇菌、保种、提取质粒(重组质粒的酶切鉴定结果如图1所示)、17引物单向测序，结果显示， 重组率超过95%，插入片段长度为500-3000bp，去除载体后平均大小为Ikb左右，手工使用 BLAST N和BLAST X在线同源比对，SEQT00L、ClustalX 1. 83程序分析测序结果。
[0021] 经过抗性筛选与菌落PCR筛选得到的阳性克隆测序与GenBank数据库Blastn分 析，得到5条EST编码的桔小实蝇抗菌肽，将其中一条命名为BH-AMP003,该抗菌肽由42个 氨基酸残基组成(氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示)，分子量为4.31 kDa，等电点为8. 90,呈 碱性，编码该42个氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。桔小实蝇BH-AMP003具有典 型的抗菌肽一级结构特征和物理化学特性。
[0022] 我们通过ProtParam分析桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003完整的编码蛋白由75个 氨基酸组成(氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示)，它的分子质量单位为8. 06 KD，检测其等 电点理论值为8. 90,该蛋白的酸性氨基酸总数（Asp+Glu)共为1个，它的碱性氨基酸总数 (Arg+Lys)共为6个，编码该42个氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。为了排除信 号肽对蛋白抗原表位筛选的干扰，我们采用Signal P程序预测该抗菌肽序列中的信号肽结 构，结果表明，桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003含有一个信号肽结构为1-21位氨基酸残基的信 号肽，成熟肽部分位于第34-75位氨基酸残基，其氨基酸序列为：KRAT⑶LLSKTGVGLSLCAAH CVLRGNRGGYCQGAGVCVCRI〇
[0023] 实施例2桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003的重组表达 本实验采用组氨酸缺陷型毕赤酵母GSl 15作为宿主菌，采用胞内表达载体pPIC3. 5K构 建重组表达系统。选择Sac I内切酶线性化重组载体pPIC3.5K，然后将通过分子克隆手段 使之带有相应酶切位点的桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003基因（SEQ ID N0:3所示)通过T4 DNA 连接酶与线性化载体连接，再将其转化到大肠杆菌DH5 a中，利用氨苄青霉素抗性的LB平 板筛选阳性转化子。挑单菌落接种培养，抽提质粒进行酶切验证和测序。整个实验的详细 方法参见Sam brook J.编著的《分子克隆试验室手册》。进一步将重组载体转化毕赤酵母 GS115感受态细胞，筛选重组子，诱导表达，并且对重组工程菌株进行高密度发酵，检测桔小 实蝇抗菌肽BH-AMP003的抑菌活性和抗菌谱。
[0024] 1.桔小实蝇抗菌肽BH-AMP003的合成 以经过测序的含有桔小实蝇抗菌肽基因BH-AMP003 (SEQ ID N0:3所示）的文库质粒 为模板，分别设计和合成Primerl及Primer2两段引物，经过PCR扩增合成桔小实蝇抗菌肽 BH-AMP003 基因。
[0025] 引物 1 :5, -CGGGATCCACCATGAAACGCGCCACCTGCGAT-3' ； 引物 2 :5' -CGGAATTCTCATTAGATGCGGCAGACGCAGAC~3,； 反应条件：
【权利要求】
1. 一种桔小实蝇抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. -种桔小实蝇抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. -种桔小实蝇抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示或其反向互补序列。
4. 一种桔小实蝇抗菌肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示或其反向互补序列。
5. -种桔小实蝇抗菌肽衍生物，其特征在于：该衍生物为SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2功能相同的氨基酸序列。
6. -种桔小实蝇抗菌肽衍生物，其特征在于：该衍生物为SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的化学修饰物。
7. 根据权利要求6所述的一种桔小实蝇抗菌肽衍生物，其特征在于：所述化学修饰包 括乙酰化、氨基化、甲基化、磷酸化、糖基化、脂基化、泛素化、生物素标记、荧光蛋白标记。
8. -种桔小实蝇抗菌肽及其衍生物在制备抗菌产品中的应用，所述抗菌肽为权利要求 1?4任一所述的桔小实蝇抗菌肽，所述抗菌肽衍生物为权利要求5?7任一所述的桔小实 蝇抗菌肽衍生物。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗菌产品包括饲料添加剂、防腐剂、 保健品、药。
【文档编号】C07K14/435GK104356215SQ201410524612
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月8日 优先权日:2014年10月8日
【发明者】李莉, 李本涛 申请人:广州格拉姆生物科技有限公司