人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备方法，包括：从NCBI的GENEBANK上获取人cAST基因；将人cAST基因插入至表达载体并转化到宿主细胞表达；得到人源cAST蛋白；取人源cAST蛋白免疫成年绵羊，经免疫5次后采血分离血清；血清经33％～50％饱和硫酸铵沉淀后，再过cAST抗原亲和柱纯化即得羊抗人cAST抗体。得到的抗体具备效价高、纯度高、特异性强的特点。
【专利说明】人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶 (CAST胞质型天口冬氨酸氨基转移酶）的多克隆抗体（简称人源CAST抗体）的制备方法。
【背景技术】
[0002] 天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase, AST)广泛存在于人体各种 组织细胞中，尤W肝、也组织细胞含量最为丰富，而正常人血清中AST活性很低。人体中AST 存在两种同工酶，一种是CAST,主要来源于细胞浆，另一种是mAST，存在于线粒体内。该两 种同工酶在基因组成上有差异，在氨基酸组成、免疫学特性W及在体内的半衰期等均不同。
[0003] 现临床检验测定血清中AST的活性即为CAST与mAST活性的总和，由于AST分布 广泛，缺乏组织特异性，对临床诊断价值不高，近年亚细胞水平的同工酶检测已逐步应用于 临床，包括血清mAST的测定。在机体轻度病变时，组织细胞的细胞膜通透性增高，CAST透 过细胞膜进入血液系统中，但mAST有两层线粒体膜的保护，不易释放入血；而当机体严重 疾病时，出现细胞坏死、线粒体崩解，附着在线粒体上的mAST可迅速释放进入血中。因此， 血清mAST活性可反映组织细胞的坏死程度，若血清中检测出高水平mAST,则表明也肌、肝 脏严重受损；另外mAST在血中的半衰期比CAST短，当细胞不再破坏或修复时，血清中mAST 很快降至正常水平，因此mAST又是也肌、肝脏损害预后的评价指标，对疾病的诊断、治疗具 有重要的价值。
[0004] 目前，血清中mAST测定主要有电泳法、层析法W及免疫抑制法等，尤W免疫抑制 法具备特异、准确、快速简便、可用于自动化检测的优点，适合于临床大规模标本的应用。其 检测原理是；CAST抗体与血清样本中CAST作用形成免疫复合物，使CAST活性被抑制，而 mAST活性不受影响，mAST可与苹果酸脱氨酶（M畑）催化的反应偶联，使NA畑氧化成NAD+， 通过检测特定波长处NADH吸光度下降的速率，计算可得mAST的活性。
[000引由上述反应原理可知，CAST抗体是mAST活性测定体系的关键原料，CAST抗体成为 能否精确测定人血清样本中mAST活性的关键。适用于mAST活性测定的CAST抗体应具有 W下几个特点：
[0006] (1)特异性高；能特异性识别血清样本中CAST,而不与mAST发生交叉反应；
[0007] (2)抑制能力高；能有效的抑制血清样本中CAST的活性；
[000引 做纯度高。
[0009] 目前，市场上CAST抗体其免疫原来源不一，一些来源于其他物种的CAST所获得的 CAST抗体则不能特异有效地抑制人血清样本中的CAST活性；而人源性CAST抗体其抗原多 数为人CAST全长的某个片段巧?10个氨基酸），而该种由短肤免疫产生的多克隆抗体往 往只能识别某个抗原决定簇，因此同样存在不能充分抑制人血清样本CAST活性的问题；而 由人CAST全长序列免疫得到的抗体则十分稀少，有的抗原则是通过从人也脏或肝脏中提 取得到，该就大大限制了其应用。
【发明内容】
[0010] 本发明针对现有技术的上述不足，提供一种可高效制备人源CAST全长序列、并由 该抗原制备出效价高、特异性强的抗体，W满足临床体外诊断试剂的需求的人源天冬氨酸 氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备方法。该制备方法成本低廉、操作简单、成功率 高，制备得到的抗体效价高、纯度高、特异性强的特点。
[0011] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种人源CAST的多克隆抗 体的制备方法，制备步骤包括：
[001引 （1)从NCBI (#国国家牛物巧术信烏中也）的GE肥BANK上获取人CAST的全基因 序列，经密码子优化并在两端引入6?30bp的核巧酸序列后进行合成；合成后的人CAST基 因序列为SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列；
[0013] (2)将合成后的人源CAST基因插入至表达载体中，并转化到宿主细胞中进行表 达；
[0014] 做培养步骤似所获得的含有目的基因的宿主细胞，得到人源CAST蛋白，并经亲 和纯化后，得该蛋白纯品；
[00巧](4)取步骤做所获得的人源CAST纯品1?lOmg，采用皮下多点注射法免疫成年 绵羊，每2周一次，共免疫5次；首次免疫加入与抗原等量的弗氏完全佐剂，后4次加入与抗 原等量的弗氏不完全佐剂，末次免疫lOd(天）后采血，分离血清；
[0016] (5)将步骤（4)获得的羊抗人CAST血清用质量百分比为33%?50%的饱和硫酸 馈溶液沉淀，收集到的沉淀用buffer A溶解，得到羊抗人CAST抗体的粗提液；
[0017] (6)用buffer A平衡CAST抗原亲和柱，再将步骤（5)得到的粗提液上柱吸附，结 束后用buffer B进行洗脱，并收集洗脱液；
[0018] (7)将步骤（6)收集到的洗脱液装入透析袋中并用buffer A透析12?2化，即可 获得羊抗人CAST抗体纯品即人源CAST多克隆抗体。
[0019] 本发明上述制备步骤还包括如下步骤：将获得的羊抗人CAST抗体纯品采用Elisa 法（酶联免疫吸附实验，行业常规方法）测定其效价，同时利用人mAST抗原作为对照，经检 测上述制备得到的羊抗人CAST抗体效价大于1:60000,对照组则无显色反应，经过上述步 骤可知本发明获得的即为人源CAST多克隆抗体。
[0020] 其中，步骤（1)中经密码子优化后的人CAST基因序列为SEQ ID NO. 1所示的核巧 酸序列；所述的在人CAST基因序列两端引入6?30bp的核巧酸，引入该些核巧酸的主要功 能为：①加入酶切位点，方便目的基因与载体的连接；②加入合适的标签，便于后期的分离 纯化，优选组氨酸标签；
[0021] 所述的表达载体是原核表达载体，优选阳T系列，进一步优选阳T2化+;所述的宿 主细胞是原核宿主细胞，优选大肠杆菌菌种，进一步优选Rosetta (DE3);
[0022] 步骤（3)所述的亲和纯化是可与宿主细胞表达出的人CAST特异性结合并能通过 特定洗脱而分离的方法，优选媒柱亲和纯化；
[002引 所述的buffer A包括0. 01?0. Imol/L，抑7. 0?8. 0的磯酸盐缓冲液、H轻甲基 氨基甲焼盐酸盐缓冲液（Tris-Hcl)、4-轻己基脈嗦己賴酸缓冲液化巧es)中的一种。
[0024] 所述的buffer B包括0. 01?0. 25mol/L，P肥.0?4. 0的甘氨酸-盐酸缓冲液、 巧樣酸轴-盐酸缓冲液；或者0. 01?0. 25mol/L，抑10. 0?12. 5的碳酸轴-氨氧化轴缓 冲液、测酸轴-氨氧化轴缓冲液、磯酸氨二轴-氨氧化轴缓冲液中的一种。
[00巧]所述cAST抗原亲和柱包括cAST交联畑S-activated Se地arose 4fast Flow、 CNBr-activated Sepharose 4fast Flow 或 epoxy-activated sepharose 6B 中的一种。
[0026] 所述人mAST抗原是指通过基因工程手段将人mAST基因克隆至原核或真核表达载 体中，并转化至宿主菌中实现正确表达而得到的。
[0027] 本发明的优点和有益效果：
[0028] 1、本发明所制备的人CAST抗体是基于人源CAST全长蛋白序列免疫成年绵羊所得 的多克隆抗体，整个制备流程简单、易操作。其中，作为抗原物质的人CAST蛋白利用基因工 程手段，成功地在体外实现了全序列高效表达，而且采用的纯化方式是"一步亲和纯化法"， 与传统的直接从人体脏器提取该蛋白的方法相比，该工艺不仅操作简单，制备成本低，而且 所得的成品产率高、纯度高、生物活性高，更便于大规模的应用。此外，利用上述抗原对成年 绵羊进行免疫，所获得的羊抗人CAST抗血清经硫酸馈沉淀及CAST抗原亲和柱两步纯化后， 所得抗体不仅得率高、纯度高、效价高，而且与人mAST无交叉反应，具备了对人CAST的高度 特异性。
[0029] 2、用上述羊抗人CAST抗体应用于mAST检测试剂盒，所用抗体量少，反应特异性 高，适合于试剂盒的制备和应用，可广泛应用于临床检测。
【具体实施方式】
[0030] W下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
[0031] 一种人源CAST多克隆抗体的制备方法，包括W下操作步骤：
[0032] (1)从NCBI的GE肥BANK上获取人CAST的全基因序列，根据大肠杆菌偏爱密码子 表，对人CAST基因序列进行密码子改造W去除大肠杆菌稀有密码子，优化后的人CAST基因 序列为SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列；
[003引 （2)在优化后的人CAST基因序列5'端加入酶切位点Nde I，3'端去除终止密码 子后加入酶切位点化0 I，之后进行全序列合成，具体的合成方法如下：
[0034] 1)设计长度为80mer的覆盖整个人源CAST基因的寡核巧酸序列22个，作为引物， 每相邻的两个寡核巧酸序列有20个碱基的重复，设计的引物如下：
[00；35] P1 ;80mer
[0036] CATATGGCACCTCCGAGCGTGTTTGCCGAGGTGCCGCAGGCACAACCTGTTCTGGTGTTCAAGCTGACA GCCGACTTCCG
[0037] P2 ：80mer
[0038] CAGTCATCTGTGCGATAGGCACCAACGCCCAGATTCACTTTACGAGGGTCAGGGTCCTCACGGAAGTCG GCTGTCAGCTT
[0039] P3 ：80mer
[0040] GCCTATCGCACAGATGACTGCCATCCGTGGGTGCTGCCGGTTGTGAAAAAAGTTGAGCAGAAGATCGCA AACGATAACAG
[0041] P4 ：80mer
[0042] CGGCTTGCACAGCTGCGGAATTCGGCTAAGCCCAGGATCGGCAGGTACTCGTGGTTCAGGCTGTTATCG
【权利要求】
1. 一种人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于： 制备步骤包括： (1) 从NCBI的GENEBANK上获取人cAST的全基因序列，经密码子优化并在两端引入6? 30bp的核苷酸序列后进行合成，合成后的人cAST基因序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列； (2) 将合成后的人源cAST基因插入至表达载体中，并转化到宿主细胞中进行表达； (3) 培养步骤（2)所获得的含有目的基因的宿主细胞，得到人源cAST蛋白，并经亲和纯 化后，得该蛋白纯品； (4) 取步骤（3)所获得的人源cAST蛋白纯品1?10mg，采用皮下多点注射法免疫成年 绵羊，每2周一次，共免疫5次；首次免疫加入与抗原等量的弗氏完全佐剂，后4次加入与抗 原等量的弗氏不完全佐剂，末次免疫l〇d(天）后采血，分离血清； (5) 将步骤（4)获得的羊抗人cAST血清用质量百分比为33%?50%的饱和硫酸铵溶 液沉淀，收集到的沉淀用bufferA溶解，得到羊抗人cAST抗体的粗提液； (6) 用bufferA平衡cAST抗原亲和柱，再将步骤（5)得到的粗提液上柱吸附，结束后用 buffer B进行洗脱，并收集洗脱液； (7) 将步骤（6)收集到的洗脱液装入透析袋中并用bufferA透析12?24h，即可获得 羊抗人cAST抗体纯品即人源cAST多克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：制备步骤还包括将获得的羊抗人cAST抗体纯品采用Elisa法测定其 效价，同时利用人mAST抗原作为对照，经检测上述制备得到的羊抗人cAST抗体效价大于 1:60000,对照组则无显色反应。
3. 根据权利要求2所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：步骤（2)所述的表达载体是原核表达载体。
4. 根据权利要求3所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：所述的原核表达载体为PET22b+。
5. 根据权利要求2所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：步骤（3)所述的宿主细胞是原核宿主细胞。
6. 根据权利要求5所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：所述的宿主细胞为Rosetta (DE3)。
7. 根据权利要求2所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：所述的bufferA为0. 01?0. lmol/L，pH7. 0?8. 0的磷酸盐缓冲液、 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（Tris-Hcl)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液Ofepes)中的一 种。
8. 根据权利要求2所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：所述的buffer B为0. 01?0. 25mol/L，pH2. 0?4. 0的甘氨酸-盐酸缓 冲液、柠檬酸钠-盐酸缓冲液；或者〇. 01?〇. 25mol/L，pH 10. 0?12. 5的碳酸钠-氢氧化 钠缓冲液、硼酸钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液中的一种。
9. 根据权利要求2所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：所述cAST抗原亲和柱包括cAST交联NHS-activated Sepharose 4 fast Flow、CNBr-activated Sepharose 4 fast Flow 或 epoxy-activated sepharose 6B 中的 一种。
10.根据权利要求2所述的人源天冬氨酸氨基转移酶胞质同工酶的多克隆抗体的制备 方法，其特征在于：所述人mAST抗原是指通过基因工程手段将人mAST基因克隆至原核或真 核表达载体中，并转化至宿主菌中实现正确表达而得到的。
【文档编号】C07K16/06GK104447998SQ201410804884
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】邹炳德, 邹继华, 陆慧贤, 俞凤, 周俊 申请人:宁波美康盛德医学检验所有限公司