专利名称：温敏壳聚糖－接枝－NIPAAm/VL共聚物转基因载体的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种温度敏感的壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)/月桂酸乙烯酯(VL)共聚物非病毒转基因载体的制备方法，属于基因治疗领域新型高效非病毒载体的制备方法和技术。
背景技术：
转基因技术在生物、医药、环保等领域发挥着越来越重要的作用，一批批转基因动物和植物相继产生，已成为科学研究中新的亮点。对于成功的基因治疗来说，其中一个重要的因素就是需要高效的载体，能够运载携带遗传信息的DNA进入细胞核，转录和翻译成目的蛋白质以达到疗效。目前，在研发天然及合成的非病毒转基因载体方面已经进行了很多有益的尝试，但是仍然面临着巨大的挑战，将外源DNA带入细胞核内还存在许多障碍。
目前基因转染主要采用显微注射、病毒载体、非病毒载体转化等方法，它们都存在容易造成DNA损伤、转染效率低、设备昂贵、需要高超的操作技能等缺点，制约着该技术的更广泛的应用。为了提高基因的转染率，研究人员尝试利用病毒和非病毒载体将基因“输送”至宿主细胞。尽管病毒载体可获得很高的转染率，但其缺点是易引起免疫反应和肿瘤化趋势。鉴于此，对非病毒载体的研发日益引起了广泛的关注，如脂质体、聚赖氨酸、二乙基氨基葡聚糖、树状高分子、壳聚糖等，这些非病毒载体通过静电相互作用同DNA形成聚电解质复合物，复合方法简便易行，并使包覆的DNA得到保护。聚乙烯亚胺(PEI)是一种被广泛研究的非病毒载体，但是由于其相当高的正电荷密度，PEI表现出较强的膜破坏性和细胞毒性，并且同病毒载体相比，其转染效率也不高，这也可能与其高电荷密度有关，因为可能在某些情况下，PEI/DNA形成的复合物过于稳定，以至于在细胞核内限制了DNA的解离，影响了基因的表达。
近来，研究人员开始关注那些既能在运载DNA进入细胞核过程中与基因保持较高的结合力，又能在细胞核内降低与基因的结合力以释放DNA的新型载体。一条潜在的路线就是通过使用能够在不同pH值或温度条件下发生构象变化或相变的刺激响应(智能)聚合物来调控其与DNA的结合。对于温度响应聚合物来说，聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAm)在其低临界溶解温度(LCST在32-34℃)以下溶于水，高分子链段呈无规线团状。温度高于LCST，PNIPAm从水中析出，链段呈密实的小球。PNIPAm的这种特性被广泛地应用于生物医学领域，包括温敏性药物释放、调控细胞吸附和温敏性分离膜等。Hennink等研究发现，聚异丙基丙烯酰胺与N，N’-(二甲基胺乙基)甲基丙烯酸酯的共聚物(PNIPAm-co-DMAEMA)可作为温度和pH值响应的基因治疗载体，但是其转染后的基因表达效率低于PEI；Yokoyama等将疏水共聚单元引入PNIPAm-co-DMAEMA体系来调节相变温度，结果发现可以提高与DNA的结合力，通过温度的变化可调控基因的释放与表达；Okano等也将异丙基丙烯酰胺引入阳离子聚合物体系，研究发现，转染过程中通过适当地降低细胞的温度使PNIPAm链段呈松散的线团状，DNA得以从载体中解离或暴露，有利于基因的表达，由此提高基因的转染效率。
壳聚糖是一种生物相容性良好、可降解、无细胞毒的天然碱性多糖，几十年来研究人员对壳聚糖物化和生物性质的认识不断深入。Mumper等首次将壳聚糖用作转基因非病毒载体，通过改变其分子量可得到尺寸100-600nm的DNA/壳聚糖复合物微粒；MacLaughlin等将壳聚糖和其低聚物与质粒DNA形成复合物，考察了对COS-1细胞的转染情况。实验发现分子量小于105的壳聚糖可与DNA形成粒径100-200nm的纳米微粒，且复合物在10％的血清中稳定性好，能得到满意的转染率。Roy等利用口服途径将DNA/壳聚糖复合物释放到小鼠肠道上皮细胞，转染基因成功表达Arab2蛋白，减缓对免疫系统过敏性反应。
但是，目前所研究的壳聚糖/DNA复合物均通过自身的质子化氨基与DNA通过静电相互作用而形成。强烈的静电相互作用一方面有助于复合物的形成，但另一方面对复合物解离起到阻碍作用，进而降低了转染率。Kuhn等以理论计算研究了DNA与阳离子两亲性分子形成复合物时电荷的变化，结果表明，疏水性足够强的两亲性分子可在很低的浓度下使复合物呈电中性或发生电荷反转，即呈正电性。从转基因的安全角度而言，减小载体的用量可降低毒副作用，且借助亲疏水性的调节可调控载体的相转变温度及与细胞的亲和性，进而提高转染效率。
与本发明有关的参考文献如下[1]M.Yokoyama，Gene delivery using temperature-responsive polymeric carriers，Drugdiscov.Today 7(2002)426-432. M.Kurisawa，M.Yokoyama，T.Okano，Transfection efficiency increases by incorporationhydrophobic monomer units into polymeric gene carriers，J.Control.Release 68(2000)1-8. M.Kurisawa，M.Yokoyama，T.Okano，Gene expression control by temperature withthermo-responsive polymeric gene carriers，J.Control.Release 69(2000)127-137. R.J.Mumper，J.Wang，J.M.Claspell，A.P.Rolland，Novel polymeric condensing carriersfor gene delivery，Proc.Int.Symp.Controlled Release Bioact.Mater.22(1995)178-179.
发明内容
本发明的目的在于提供亲疏水性可调，相转变温度可控的温度敏感壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物非病毒转基因载体的制备方法。所构建的温敏性共聚物载体亲疏水性可调，无细胞毒性，在体温下，由于处于LCST以上，高分子链段形成紧密的疏水网络，在较低的电荷比下可与质粒DNA形成粒径小于120nm的复合物微粒，能防止DNA被核酸酶的降解，且有助于胞吞；基因转入细胞后，降低培养介质温度低于LCST，共聚物大分子链段水合，呈松散的线团状，基因解离和外露，有利于基因的表达。通过调节温度可实现对基因表达的控制。
为达到上述目的，实施以下技术方案，也即本发明申请保护的关键技术。(1)温度敏感壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物非病毒转基因载体的制备。取异丙基丙烯酰胺溶解于四氢呋喃中配制成溶液，然后按异丙基丙烯酰胺与月桂酸乙烯酯摩尔比1∶1-16∶1加入月桂酸乙烯酯，磁力搅拌20分钟后，按异丙基丙烯酰胺质量的0.5-2％加入偶氮二异丁腈引发剂，和按异丙基丙烯酰胺质量的1.0-5％加入巯基乙酸链转移剂，在氮气保护条件下于45-60℃反应5-8小时，产物以乙醚沉淀洗涤产物三次，真空烘箱中干燥得到异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚样品。
(2)将上述异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物分别溶于去离子水中，按与共聚物摩尔比1∶1加入分子量为1000-7000、脱乙酰度为80-95％的壳聚糖水溶液，再按与共聚物摩尔比0.5-2加入碳二亚胺偶联剂，以盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺调节pH值至4.5-5.5，在5℃-20℃下磁力搅拌反应6-10小时，形成温度敏感壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物，将产物于去离子水中透析5天，冷冻干燥得最终温度敏感性载体。
(3)将上述精制过的温度敏感壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物载体，溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中配制成0.2mg/ml-10mg/ml的溶液，再按照共聚物与DNA电荷比1∶6-10∶1加入含有β半乳糖苷酶报告基因的质粒DNA，漩涡振荡静置，可得粒径为50-120nm的复合物粒子。
本发明的优点，为保证复合物的稳定和达到温度调控基因表达的目的，本发明选用壳聚糖的分子量为1000-7000，脱乙酰度80-95％。所合成的温度敏感低分子量壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物亲疏水性可调，通过在体温环境下形成塌陷的网络并借助疏水相互作用，在较低的电荷比下可与质粒DNA紧密复合，不仅有利于胞吞，且能有效地防止DNA受核酸酶的降解；降低温度至LCST以下，高分子网络水合，形成松散的结构，有利于基因的表达。此外，疏水性月桂酸酯基的引入可有效调控载体的相转变温度，提高细胞的亲和性和跨膜能力，在相同的条件下转染率高于壳聚糖，且借助温度的变化可控制基因的表达进而提高基因的转染率。而常用的壳聚糖载体一般与DNA的电荷比大于1∶1复合才能获得稳定的聚电解质复合物，且单纯壳聚糖载体不具温度敏感性，因而不具备基因表达的可控性。
具体实施例方式
实施例一取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，加入0.25克月桂酸乙烯酯，磁力搅拌20分钟后，加入0.01克偶氮二异丁腈和20μl巯基乙酸，在氮气保护条件下45℃反应5小时，以乙醚沉淀洗涤产物三次，真空烘箱中干燥样品。
取2.0克上步反应所得样品溶解于20ml去离子水中，取3.5克分子量1000，脱乙酰化度为95％的壳聚糖溶解于20ml去离子水中，加入0.15克碳二亚胺，以盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺调节pH值至4.5，5℃下磁力搅拌反应6小时，将产物于去离子水中透析5天，冷冻干燥得最终载体。
将透析过的5mg温敏性载体溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度0.2mg/ml，含有β-galactosidase报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，浓度0.2mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl载体溶液与10μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得载体/DNA复合物粒子加入到已培养至指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，转染3小时后采取如下温度控制条件37℃(21小时)→20℃(1小时)→37℃(24小时)后，裂解细胞，测定细胞裂解液中β-galactosidase的含量及蛋白含量以确定基因转染效率，β-galactosidase的活性为16.42 Unit/mg protein.
实施例二取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，加入0.98克月桂酸乙烯酯，磁力搅拌20分钟后，加入0.02克偶氮二异丁腈和50μl巯基乙酸，在氮气保护条件下60℃反应6小时，以乙醚沉淀洗涤产物三次，真空烘箱中干燥样品。
取2.0克上步反应所得样品溶解于20ml去离子水中，取3.5克分子量2000，脱乙酰化度为90％的壳聚糖溶解于20ml去离子水中，加入0.35克碳二亚胺，以盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺调节pH值至5.0，10℃下磁力搅拌反应8小时，将产物于去离子水中透析5天，冷冻干燥得最终载体。
将透析过的5mg温敏性载体溶于0.02M醋酸/0.02醋酸钠溶液中，浓度0.5mg/ml，含有β-galactosidase报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，浓度0.2mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl载体溶液与10μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得载体/DNA复合物粒子加入到已培养至指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，转染3小时后采取如下温度控制条件37℃(21小时)→20℃(3小时)→37℃(24小时)后，裂解细胞，测定细胞裂解液中β-galactosidase的含量及蛋白含量以确定基因转染效率，β-galactosidase的活性为25.73 Unit/mg protein.
实施例三取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，加入1.96克月桂酸乙烯酯，磁力搅拌20分钟后，加入0.03克偶氮二异丁腈和70μl巯基乙酸，在氮气保护条件下60℃反应7小时，以乙醚沉淀洗涤产物三次，真空烘箱中干燥样品。
取2.0克上步反应所得样品溶解于20ml去离子水中，取3.5克分子量5000，脱乙酰化度为80％的壳聚糖溶解于20ml去离子水中，加入0.50克碳二亚胺，以盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺调节pH值至5.0，15℃下磁力搅拌反应8小时，将产物于去离子水中透析5天，冷冻干燥得最终载体。
将透析过的10mg温敏壳聚糖溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，含有β-galactosidase报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，浓度1mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl温敏载体溶液与20μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得载体/DNA复合物粒子加入到已培养至指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，转染3小时后采取如下温度控制条件37℃(21小时)→20℃(2小时)→37℃(26小时)后，裂解细胞，测定细胞裂解液中β-galactosidase的含量及蛋白含量以确定基因转染效率，β-galactosidase的活性为20.61 Unit/mg protein。
实施例四取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，加入3.92克月桂酸乙烯酯，磁力搅拌20分钟后，加入0.04克偶氮二异丁腈和100μl巯基乙酸，在氮气保护条件下60℃反应8小时，以乙醚沉淀洗涤产物三次，真空烘箱中干燥样品。
取2.0克上步反应所得样品溶解于20ml去离子水中，取3.5克分子量7000，脱乙酰化度为90％的壳聚糖溶解于20ml去离子水中，加入0.70克碳二亚胺，以盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺节pH值至5.5，20℃下磁力搅拌反应10小时，将产物于去离子水中透析5天，冷冻干燥得最终载体。
将透析过的10mg温敏壳聚糖溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，浓度10mg/ml，含有β-galactosidase报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，浓度1mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl温敏性载体溶液与20μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得载体/DNA复合物粒子加入到已培养至指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，转染3小时后采取如下温度控制条件37℃(21小时)→20℃(1小时)→37℃(26小时)后，裂解细胞，测定细胞裂解液中β-galactosidase的含量及蛋白含量以确定基因转染效率，β-galactosidase的活性为22.74 Unit/mg protein。
对比例一取2克异丙基丙烯酰胺溶解于25毫升四氢呋喃中，加入0.98克月桂酸乙烯酯，磁力搅拌20分钟后，加入0.02克偶氮二异丁腈和50ml巯基乙酸，在氮气保护条件下60℃反应6小时，以乙醚沉淀洗涤产物三次，真空烘箱中干燥样品。
取2.0克上步反应所得样品溶解于20ml去离子水中，取3.5克分子量5000，脱乙酰化度为80％的壳聚糖溶解于20ml去离子水中，加入0.35克碳二亚胺，以盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺节pH值至5.0，10℃下磁力搅拌反应8小时，将产物于去离子水中透析5天，冷冻干燥得最终载体。
将透析过的10mg温敏壳聚糖溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，含有β-galactosidase报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，浓度10mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl温敏载体溶液与20μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得载体/DNA复合物粒子加入到已培养至指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，转染48小时后裂解细胞，测定细胞裂解液中β-galactosidase的含量及蛋白含量以确定基因转染效率，β-galactosidase的活性为18.93Unit/mg protein。
对比例二取精制过的分子量5000脱乙酰化度为80％的壳聚糖5mg，溶解于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，浓度1mg/ml。含有β-galactosidase报告基因的质粒DNA溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中，浓度0.2mg/ml，静置1小时后滤菌，取20μl壳聚糖溶液与10μl质粒DNA溶液混合，漩涡振荡，静置40分钟。将所得壳聚糖/DNA复合物粒子加入到已培养至指数生长期的C2C12成肌细胞含血清的培养基中，转染48小时后裂解细胞，测定细胞裂解液中β-galactosidase的含量及蛋白含量以确定基因转染效率，β-galactosidase的活性为18.32 Unit/mg protein。
权利要求
1.一种温敏壳聚糖-接枝-NIPAAm/VL共聚物转基因载体的制备方法，其特征包括以下步骤(1)取异丙基丙烯酰胺溶解于四氢呋喃中配制成溶液，然后按异丙基丙烯酰胺与月桂酸乙烯酯摩尔比1∶1-16∶1加入月桂酸乙烯酯，磁力搅拌20分钟后，按异丙基丙烯酰胺质量的0.5-2％加入偶氮二异丁腈引发剂，和按异丙基丙烯酰胺质量的1.0-5％加入巯基乙酸链转移剂，在氮气保护条件下于45-60℃反应5-8小时，产物以乙醚沉淀洗涤产物三次，真空烘箱中干燥得到异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚样品；(2)将上述异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物分别溶于去离子水中，按与共聚物摩尔比1∶1加入分子量为1000-7000、脱乙酰度为80-95％的壳聚糖水溶液，再按与共聚物摩尔比0.5-2加入碳二亚胺偶联剂，以盐酸/N，N，N′，N′四甲基乙二胺调节pH值至4.5-5.5，在5℃-20℃下磁力搅拌反应6-10小时，形成温度敏感壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物，将产物于去离子水中透析5天，冷冻干燥得最终温度敏感性载体；(3)将上述精制过的温度敏感壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物载体，溶于0.02M醋酸钠/0.02M醋酸溶液中配制成0.2mg/ml-10mg/ml的溶液，再按照共聚物与DNA电荷比1∶6-10∶1加入含有β半乳糖苷酶报告基因的质粒DNA，漩涡振荡静置，可得粒径为50-120nm的复合物粒子。
全文摘要
本发明公开了一种温敏壳聚糖－接枝－异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物转基因载体的制备方法。该方法过程以异丙基丙烯酰胺与月桂酸乙烯酯共聚合成温敏性共聚物，将分子量1000－7000，脱乙酰度80－95％的壳聚糖与共聚物偶联，形成壳聚糖－接枝－异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯共聚物，精制后得到载体；该载体及含有β半乳糖苷酶报告基因的质粒DNA分别溶于醋酸/醋酸钠的溶液中，静置后，再把溶液按载体与DNA不同电荷比形成粒径50－120nm的复合物微粒。本发明采用的载体亲疏水性可调，相转变温度低于37℃，无细胞毒性，在较低的电荷比下能与质粒DNA复合，并能抗核酸酶对DNA的降解，在相同的条件下转染率高于壳聚糖，且借助温度的变化可控制基因的表达。
文档编号C08F299/00GK1629203SQ20041007235
公开日2005年6月22日 申请日期2004年10月21日 优先权日2004年10月21日
发明者刘文广, 孙书军, 程男, 姚康德, 梁东春, 左爱军, 郭刚, 张镜宇 申请人:天津大学