专利名称：亲水性聚合物磁性微球及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属复合高分子功能材料技术领域，涉及聚合物磁性微球，特别涉及亲水性聚合物磁性微球的制备方法和用途。
背景技术：
磁性高分子微球是由无机Fe3O4等磁性材料和有机聚合物复合而成，其功能的多样性和易控性已引起了人们的普遍关注。这类功能材料具有高分子材料的性质，通过聚合单体的选择，易实现其功能性的调整，如亲水性和疏水性以及生物兼容性等；而表面存在的反应性功能基团，能够结合生物活性分子，因而在固定化酶、细胞分离和靶向药物等方面有着广泛的应用前景。
具有超顺磁性的聚合物微球，在外加磁场减弱为零的时候，微球几乎没有剩磁。这类材料制备的固定化酶，突出的优势是在磁场的作用下能够有效快速地与反应介质分离，从而防止固定化酶在分离及洗涤过程中流失。目前制备聚合物磁性微球的方法主要有高分子包埋法，单体聚合法和原位法，其中单体聚合法是在磁性粒子和有机单体存在的条件下，采用不同的聚合方式(悬浮聚合，分散聚合和乳液聚合等)，在引发剂作用下聚合制备高分子磁性微球。与包埋法相比，单体聚合法合成磁性聚合物微球的大小尺度易控制，且球形规整。利用原位法制备高分子磁性微球，微球的磁响应性较弱，且工艺过程复杂，实用性较低。
本发明采用反相悬浮聚合法制备亲水性聚合物磁性微球。美国专利4339337公开了一种悬浮聚合制备磁性聚合物微球的方法，是将亲油化处理的磁性Fe3O4微粒和亲油性烯类单体及油性引发剂组成的油相分散在含表面活性剂的水相中，形成水包油型悬浮液，加热引发聚合形成磁性聚合物微球。实验结果表明，仅管Fe3O4微粒表面经过烃油亲油性处理，但在聚合过程中仍出现团聚，部分Fe3O4微粒与烯类单体相发生分离，得到的微球Fe3O4含量低(0.8-2.7％)，磁性弱，均质性差。
国内与本发明相近的微悬浮聚合法(CN 1566169A)是用油酸类表面活性剂包覆Fe3O4微粒后分散于苯乙烯中形成磁流体，磁流体与二乙烯苯和油性引发剂过氧化苯甲酰混合，滴加到含有十二烷基硫酸钠和十六醇乳化剂的水溶液水相中，先引发聚合反应一段时间后，再滴加甲基丙烯酸等功能性单体与水溶性引发剂过硫酸钾溶液，再次进行聚合反应(二次聚合)，形成复合微球。分析上述制备过程和实验可知，该发明存在一些不足(1)采取二次引发聚合，制备程序多，过程长。(2)所制备的磁性微球比表面甚小，缺少特异的功能性基团，不利于在生物医学、特别是在固定化酶及细胞分离等领域的应用。另外，该发明没有对制备的超顺磁性聚合物微球的用途给出具体说明和实例。专利CN 1105741C提供了网式筛板振动悬浮聚合反应装置，该装置中包括聚合反应常规装置中的反应釜、油相储罐和水相储罐外，还配装了分散塔。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种亲水性聚合物磁性微球及其制备方法，本发明的另一个目的是给出该微球固定化酶的催化性能。
本发明的关键在于发明一种亲水性聚合物磁性微球的制备方法，即Fe3O4磁粉不经油酸或表面活性剂包覆处理，而是将其用合适的极性溶剂分散成磁流体，然后与聚合单体相混合，加入引发剂反相悬浮聚合成球。
本发明聚合物磁性微球的特征之一在于，微球具有多孔结构，孔径分布主要集中在10-80nm，孔体积在0.2-1.0cm3/g，比表面积在100-200cm2/g范围。
本发明聚合物磁性微球的特征之二在于，其含有环氧基、酰胺基和羟基等功能性基团，Fe3O4粒子主要被包裹于聚合物的网络结构中。其中，环氧基团含量在0.1-2.0mmol/g范围。
本发明聚合物磁性微球的特征之三在于，球形规整，组分Fe3O4在微球中的含量为2-30％。微球磁响应性强，具有超顺磁性，比饱和磁化强度在2-20emu/g范围。
本发明聚合物磁性微球的特征之四在于，其对生物酶的偶联率高。用于制备固定化酶，固定化酶的催化活性高，并且在使用过程中不发生磁聚集现象。
本发明亲水性聚合物磁性微球的制备方法， 包括如下步骤1、制备Fe3O4磁流体在40-70℃时，于含有Fe2+和Fe3+盐的水溶液中滴入浓氨水至pH值为8-11，Fe3O4沉淀熟化10-30min后进行过滤分离，洗涤、干燥后得到磁粉。磁粉中加入分散剂，搅拌下形成Fe3O4磁流体。
2、反相悬浮法制备亲水性聚合物磁性微球(1)将Fe3O4磁流体混于亲水性烯类单体中，形成均匀的聚合相。磁流体占聚合相总重量的40-90％，优选的为50-80％；加热温度控制在20-50℃，优选的为25-40℃；控制搅拌速度为300-800r/min，优选的为400-600r/min。
(2)在聚合反应器中加入疏水性有机溶剂和稳定剂，搅拌分散均匀形成悬浮相。其中，悬浮相中稳定剂占2-20％，优选的为5-10％；悬浮相的质量为聚合相的质量的200-800％，优选的为250-500％。控制搅拌速度为300-700r/min，优选的为400-600r/min。
(3)将聚合相液体转移至反应器分散于聚合相中，控制搅拌速度为400-800r/min，优选的为500-600r/min；在氮气气氛中由偶氮二异丁腈引发下聚合，反应时间为4-12h，优选的为6-9h。反应结束后，微球经洗涤和真空干燥后，干态存放。
方法中制备Fe3O4磁流体所使用的铁盐水溶液中Fe2+和Fe3+的摩尔比为1∶0.5至1∶2，铁盐可以是FeCl2、FeCl3、FeSO4和Fe2(SO4)3；加入的分散剂与Fe3O4质量比在3∶1至10∶1之间，优选的为4∶1至6∶1。这里的分散剂可以是甲酰胺、N，N′-二甲基甲酰胺等强极性有机物。
制备方法中聚合相中的烯类单体包括丙烯酰胺、N-乙烯吡咯烷酮、丙烯醇、丙烯醛、丙烯酸及其衍生物甲基丙烯酸缩水甘油酯，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺等，使用两种或两种以上单体。
所采用的悬浮相中的疏水性有机溶剂包括环己烷、正己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一种或一种以上；所使用的稳定剂是复合表面活性剂，由Span类表面活性剂与聚乙二醇、乙基纤维素、硬脂酸钙和十二烷基硫酸钠中的两种或两种以上复配而成。
本发明亲水性聚合物磁性微球可用于酶和细胞等生物体固定化的载体材料，尤其适应于作青霉素酰化酶固定化的载体。
采用文献[J.Mol.Catal.BEnzym.2000，1145-53]所公开的碱滴定法，测定亲水性聚合物磁性微球固定化青霉素酰化酶催化水解青霉素G钾制备6-氨基青霉烷酸(6-APA)的表观活性，可达500IU/g以上(均以干重表示)。
由上述公开的技术方案可以看到，本发明的制备方法工艺过程简单，设备可采用常用的聚合釜，易操作，有利于实现工业化生产。制备的多孔亲水性聚合物磁性微球，对生物酶有良好的固定化作用。
图1为本发明磁性微球的扫描电子显微镜照片。由图可知，制备的聚合物磁性微球呈规则球形，微球之间没有出现粘连。
图2是磁性微球的孔径分布图。从图可见，制备的聚合物磁性微球的孔径分布很宽，大约从几纳米至近百纳米，说明聚合物内部存在许多大小不一的孔道。微球具有较大的比表面积和多孔结构，有利于其在生物大分子酶固定化中的应用。
图3磁性微球的红外光谱图。图中位于906cm-1、849cm-1和806cm-1的红外吸收峰是环氧基团的特征吸收峰，而在1546cm-1和1727cm-1的吸收峰是酰胺基团的吸收峰和羰基的特征吸收峰，说明制备的聚合物磁性微球含有多种功能性基团。
具体实施例方式实施例11、Fe3O4磁流体的制备将5.4g FeCl2和13.8g FeCl3配成水溶液后加入三口瓶中，控制混合溶液的体积为250 mL。通入氮气使反应物处于氮气保护下水浴加热，温度为40℃，搅拌速度为500r/min，滴加浓氨水至溶液的pH值为9。滴加结束后，将温度升至80℃熟化30min后，过滤分离出固体，用去离子水洗涤至中性，干燥后得到Fe3O4粉体。在得到Fe3O4磁粉中加入400mL甲酰胺，控制搅拌速度为500r/min，室温下得到Fe3O4磁流体。
2、悬浮介质的制备在装有恒速搅拌机、氮气管和冷凝管的反应器中加入1 L的正庚烷，用四氯乙烯调节其密度至1.1g/cm3，以此混合有机溶剂作悬浮介质。悬浮介质加热至60℃，然后加入0.8g Span60和8.0g硬脂酸钙。
3、聚合物微球的制备将40g甲基丙烯酸缩水甘油酯和60g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺加入上述制备的Fe3O4磁流体中，搅拌30min后转移至预热的悬浮相中。控制搅拌机转速为600r/min，待含有Fe3O4的单体相分散成均匀的小液滴时(可吸取少量用光学显微镜进行观察)，加入4.5 g偶氮二异丁腈引发剂，在氮气保护下反应7h。停止反应后，磁场作用下分离出聚合物微球，用丙酮洗涤后在室温下进行真空干燥。
实施例21、Fe3O4磁流体的制备将6.5g FeSO4和17.0g Fe2(SO4)3配成水溶液后移至反应器中，控制混合溶液的体积为250mL。通入氮气使反应物处于氮气保护下加热到70℃，在搅拌状态下滴加浓氨水至溶液的pH值为10，搅拌速度为500r/min。滴加结束后，将温度升至80℃熟化10min后，过滤分离出固体，用去离子水洗涤至中性，干燥后得到Fe3O4粉体。在得到Fe3O4磁粉中加入350 mL分散剂甲酰胺，控制搅拌速度为600r/min，室温下得到Fe3O4磁流体2、悬浮介质的制备在装有恒速搅拌机、氮气管和冷凝管的反应器中加入1 L的正己烷，用四氯乙烯调节其密度至1.1g/cm3，以此混合有机溶剂作悬浮介质。悬浮介质加热至60℃，然后加入1.6g Span80和4.0g硬脂酸钙。
3、聚合物微球的制备将40g甲基丙烯酸缩水甘油酯和60g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺加入上述制备的Fe3O4磁流体中，搅拌30min后转移至预热的悬浮介质中。控制搅拌机转速为500r/min，待含有Fe3O4的单体相分散成均匀的小液滴时，加入5.0g偶氮二异丁腈引发剂，在氮气保护下反应7h。停止反应后，磁场作用下分离出聚合物微球，用丙酮洗涤后在室温下进行真空干燥。
实施例3在实施例1的基础上，将Fe3O4磁流体的制备中的加热温度由40℃调为55℃，在搅拌状态下滴加浓氨水至溶液的pH为11，熟化温度和时间由80℃、30min调为55℃、20min，其余条件不变，同样能生产出聚合物微球。
实施例41、Fe3O4磁流体的制备同实施例1。
2、悬浮介质的制备在装有恒速搅拌机、氮气管和冷凝管的反应器中加入1L的环己烷，用四氯乙烯调节其密度至1.1g/cm3后作悬浮介质。悬浮介质加热至60℃，搅拌下加入1.0g span80、2.0g十二烷基硫酸钠和2.5g硬脂酸钙。
3、聚合物微球的制备将40g甲基丙烯酸缩水甘油酯和60g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺加入上述制备的Fe3O4磁流体中，搅拌30min后转移至预热的悬浮介质中。控制搅拌机转速为650r/min，待含有Fe3O4的单体相分散成均匀的小液滴时，加入5.5g偶氮二异丁腈引发剂，在氮气保护下反应7h。停止反应后，磁场作用下分离出聚合物微球，用丙酮洗涤后在室温下进行真空干燥。
实施例41、Fe3O4磁流体的制备同实施例2。
2、悬浮介质的制备在装有恒速搅拌机、氮气管和冷凝管的反应器中加入1 L的正己烷，用四氯乙烯调节其密度至1.1g/cm3，作悬浮介质。悬浮介质加热至60℃，加入0.6g Span80、1.2g乙基纤维素和3.0g硬脂酸钙。
3、聚合物微球的制备将40g甲基丙烯酸缩水甘油酯和60g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺加入上述制备的Fe3O4磁流体中，搅拌30min后转移至预热的悬浮介质中。控制搅拌机转速为600r/min，待含有Fe3O4的单体相分散成均匀的小液滴时，加入6.5g偶氮二异丁腈引发剂，在氮气保护下反应7h。停止反应后，磁场作用下分离出聚合物微球，用丙酮洗涤后在室温下进行真空干燥。
实施例5Fe3O4磁流体的制备同实施例2。悬浮介质和稳定剂的组成同实施例1。将30g甲基丙烯酸缩水甘油酯、10g丙烯酰胺和60g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺加入上述制备的Fe3O4磁流体中，搅拌30min后转移至预热的悬浮液中。控制搅拌机转速为500r/min，待含有Fe3O4的单体相分散成均匀的小液滴时，加入5.5g偶氮二异丁腈引发剂，在氮气保护下反应7h。停止反应后，磁场作用下分离出聚合物微球，用丙酮洗涤后在室温下进行真空干燥。
实施例6Fe3O4磁流体的制备同实施例1。悬浮介质和稳定剂的组成同实施例1。将30g甲基丙烯酸缩水甘油酯、10g N-乙烯吡咯烷酮和60g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺加入上述制备的Fe3O4磁流体中，搅拌30min后转移至预热的悬浮液中。控制搅拌机转速为500r/min，待含有Fe3O4的单体相分散成均匀的小液滴时，加入5.5g偶氮二异丁腈引发剂，在氮气保护下反应7h。停止反应后，磁场作用下分离出聚合物微球，用丙酮洗涤后在室温下进行真空干燥。
实施例7Fe3O4磁流体的制备同实施例1。悬浮介质和稳定剂的组成同实施例3。将30g甲基丙烯酸缩水甘油酯、10g甲基丙烯酰胺和60g N，N′-亚甲基双丙烯酰胺加入上述制备的Fe3O4磁流体中，搅拌30min后转移至预热的悬浮液中。控制搅拌机转速为500r/min，待含有Fe3O4的单体相分散成均匀的小液滴时，加入7.0g偶氮二异丁腈引发剂，在氮气保护下反应7h。停止反应后，磁场作用下分离出聚合物微球，用丙酮洗涤后在室温下进行真空干燥。
实施例8实施例1至实施例7所得聚合物磁性微球制备固定化青霉素酰化酶。
称取0.1g干燥聚合物磁性微球，用去离子水润湿、溶胀，吸去水后，加入2.60mL用pH 7.8的磷酸盐缓冲稀释的青霉素酰化酶溶液，于30℃水浴摇床中反应72h。磁场中分离出固定化酶。
固定化青霉素酰化酶催化水解青霉素G钾生成6-APA的表观活性采用碱滴定法测定。固定化酶用去离子水洗涤数次，至洗涤液中无蛋白质检出，然后装入100mL 37℃恒温的反应器中，加入2mL pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液和8mL去离子水，测定起始溶液的pH值。控制机械搅拌转速为150r/min下将37℃恒温的10mL 8％的青霉素G钾溶液移入反应器，用pH控制仪自动滴加标准NaOH溶液，使反应体系的pH值不变。记录反应进行前3min所消耗的标准NaOH溶液的体积。固定化酶的表观活性A(IU/g)由下式计算A(IU/g)＝CNaOH·VNaOH·1000/(m/t)式中，CNaOHNaOH的摩尔浓度(mol/L)；VNaOH消耗NaOH的体积(mL)；m载体干重(g)；t反应时间(min)；将实施例1至实施例7所得聚合物磁性微球用于制备固定化青霉素酰化酶的载体，用碱滴定法测定其表观活性，结果列于表1。
表1聚合物磁性微球制备固定化青霉素酰化酶的表观活性
权利要求
1.一种亲水性聚合物磁性微球，其特征在于在亲水性聚合物磁性微球中Fe3O4重量百分比为2-30％，其余为含有环氧基、酰胺基和羟基等功能性基团的聚合物，Fe3O4粒子被包裹于聚合物的网络结构中。
2.根据权利要求1所述的亲水性聚合物磁性微球，其特征在于上述磁性微球孔径分布主要在10-80nm，孔体积在0.2-1.0cm3/g，比表面积在100-200cm2/g范围，比饱和磁化强度在2-20emu/g范围。
3.制备权利要求1所述的亲水性聚合物磁性微球的方法，包括如下步骤1、Fe3O4磁流体的制备a、在带有加热装置和搅拌装置的反应釜中，加入含有Fe2+和Fe3+盐的水溶液，在氮气保护下，加入浓氨水至溶液pH值为8-11后，升温熟化10-30min，然后进行过滤分离、洗涤、干燥后得到磁粉；b、将上述制取的磁粉加入带搅拌装置的反应釜中，在搅拌状态下加入分散剂，形成Fe3O4磁流体。2、反相悬浮法制备亲水性聚合物磁性微球a、悬浮介质的制备在装有搅拌装置和加热装置的反应釜中加入疏水性有机溶剂和稳定剂，搅拌均匀后形成悬浮介质，将悬浮介质加热至20-70℃待用；b、聚合物微球的制备将上述步骤1制备的Fe3O4磁流体混于亲水性烯类单体中，搅拌状态下形成均匀的聚合相，然后将聚合相加入上述悬浮介质中，在搅拌和氮气气氛下，加入偶氮二异丁腈引发聚合反应，反应结束后，在磁场作用下分离出聚合物微球，经洗涤和真空干燥后，干态存放。
4.根据权利要求3所述的制备亲水性聚合物磁性微球的方法，其特征在于上述含有Fe2+和Fe3+盐的水溶液中，Fe2+和Fe3+的摩尔比为1∶0.5-2，铁盐可以是FeCl2、FeCl3、FeSO4和Fe2(SO4)3；分散剂是甲酰胺、N，N′-二甲基甲酰胺等强极性有机物，Fe3O4与分散剂的质量比在1∶3-10之间。
5.根据权利要求3所述的制备亲水性聚合物磁性微球的方法，其特征在于在上述步骤2的悬浮介质制备中，疏水性有机溶剂包括环己烷、正己烷、正庚烷或四氯乙烯中的一种或一种以上；稳定剂是复合表面活性剂，由Span类表面活性剂与聚乙二醇、乙基纤维素、硬脂酸钙和十二烷基硫酸钠中的两种或两种以上复配而成；悬浮相中稳定剂占2-20％。
6.根据权利要求3所述的制备亲水性聚合物磁性微球的方法，其特征在于在上述步骤2的聚合物微球的制备中，Fe3O4磁流体占聚合相总重量的40-90％；聚合反应的时间为4-12h；搅拌速度为300-700r/min；悬浮相的质量为聚合相的质量的200-800％。
7.权利要求1所述的亲水性聚合物磁性微球的用途，其特征在于该亲水性聚合物磁性微球用于青霉素酰化酶固定化的载体。
全文摘要
本发明公开了一种亲水性聚合物磁性微球及其制备方法和用途。用甲酰胺等极性有机溶剂分散超顺磁性Fe
文档编号C08F2/44GK101085874SQ200710112798
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月18日 优先权日2007年6月18日
发明者薛屏, 杨金会 申请人:宁夏大学