高粘度迪优坦胶及其制备方法
【专利摘要】本发明描述了迪优坦多糖的生产，所述多糖显示粘度特性提高。通过产生鞘氨醇单孢菌ATCC53159的衍生物生产这种改进的迪优坦多糖，所述衍生物含有其中克隆了迪优坦多糖的生物合成基因的多拷贝广谱宿主性质粒。所述质粒能在宿主鞘氨醇单孢菌菌株内产生用于这种多糖合成的多个基因拷贝。以这种方式提供的方法不仅能提高靶迪优坦多糖的产量，还能产生物理特性改进(上述较高的粘度)的迪优坦多糖。已证实这种迪优坦多糖在油田应用和水泥材料中作为增粘剂可能特别有用。本发明还包括产生这种改进迪优坦多糖的创造性方法以及这种方法中产生改进迪优坦所需的新克隆基因。此外，本发明包括含有所需DNA序列的工程改造的新鞘氨醇单孢菌菌株。
【专利说明】高粘度迪优坦胶及其制备方法
[0001]本申请是申请日为2006年10月31日，申请号为“200680048801.9”，发明名称为“高粘度迪优坦胶及其制备方法”的申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明描述了与重复单元类型相同的以前生产的多糖相比，显示粘度特性增加的迪优坦(diutan)多糖。通过产生鞘氨醇单孢菌(Sphingomonas sp.)ATCC53159的衍生物来制备这种改进的迪优坦多糖，所述衍生物含有其中克隆了迪优坦多糖的生物合成基因的多拷贝广谱宿主性质粒。所述质粒能在宿主鞘氨醇单孢菌菌株内产生用于这种多糖合成的多个基因拷贝。以此方式提供的方法不仅能提高靶迪优坦多糖的产量，还能产生物理特性改进(上述较高的粘度)的迪优坦多糖。现已证实这种迪优坦多糖在油田应用和水泥材料中作为增粘剂(viscosifier)可能特别有用。本发明还包括产生这种改进迪优坦多糖的创造性方法以及这种方法中产生改进迪优坦所需的新克隆基因。此外，本发明包括含有所需DNA序 列的工程改造的新鞘氨醇单孢菌菌株。
[0003]发明背景
[0004]多糖或树胶一般用于使水溶液增稠或使之成为凝胶状，通常分为两类:增稠剂和胶凝剂。典型的增稠剂包括:淀粉、黄原胶、迪优坦胶、文莱胶(welan gum)、瓜尔胶、羧甲基纤维素、海藻酸盐、甲基纤维素、刺梧桐树胶和黄蓍胶。常见的胶凝剂包括明胶、结冷胶、淀粉、海藻酸盐、果胶、角叉菜聚糖、琼脂和甲基纤维素。
[0005]多年来，某些多糖，或者更具体地说，生物胶，例如黄原胶、结冷胶、文莱胶和迪优坦胶通过微生物发酵生产。这些生物胶表现出不同特征，例如使其应用于许多不同领域的粘度改进能力。用于食品，例如糖果凝胶(confectionery jelly)、果酱和果冻、甜食凝胶、糖霜和乳制品，以及微生物培养基组分的胶凝剂属于该清单。此外，可将增稠剂用于许多最终应用领域以改进靶液体的粘度。特别感兴趣的是这些胶能改变地下和/或水下石油液体粘度，从而有助于收集这些液体，虽然可能有许多其它不同的最终应用存在(例如，包括水泥生产)。已从不同的细菌来源产生了不同的生物胶，例如野油菜黄单孢菌(Xanthomonascampestris)的黄原胶、伊乐藻鞘氨醇单孢菌(Sphingomonas elodea)的结冷胶、鞘氨醇单孢菌ATCC31555的文莱胶和鞘氨醇单孢菌ATCC53159的迪优坦胶(S-657)。在过去已对这些菌株进行了遗传修饰以求明显改变通过上述发酵方法产生的胶物质。这种修饰能导致诸如除去酰基等变化，从而产生表现出不同物理特性的不同胶物质。这些遗传修饰的类型一般是:通过改变宿主生物内的基因表达来最终改变靶生物胶的组成，或者通过引入单独显示基因扩增的质粒来提高靶生物胶产量(例如授予Pollock等的美国专利号5，854，034，5，985，623和6，284，516以及授予Pollock个人的美国专利号6，709，845)。
[0006]迪优坦胶(也称为杂多糖(heterpolysaccharide) S-657)通过发酵菌株鞘氨醇单孢菌ATCC53159制备，其在水溶液中表现出增稠、助悬和稳定特性。迪优坦通常表现为六聚体重复单元，所述重复单元由主链中的4个糖(葡萄糖-葡糖醛酸-葡萄糖-鼠李糖)以及与所述葡萄糖残基之一相连的两鼠李糖残基的侧链构成。迪优坦胶的结构细节见 Chowdhury, T.A.，B.Lindberg, U.Lindquist 和 J.Baird, CarbohydrateResearchl64(1987) 117-122。迪优坦显示每个重复单元具有两个乙酰基取代基,参见Diltz等，Carbohydrate Research331 (2001) 265-270。两篇参考文献均通过引用全文纳入本文。制备迪优坦胶的细节可参见通过引用全文纳入本文的美国专利号5，175，278。可采用标准发酵技术，例如利用碳水化合物源(非限制性例子如葡萄糖、麦芽糖等)、氮源和其它盐类从鞘氨醇单孢菌菌株制备迪优坦。
[0007]某些工业需要各种野生型迪优坦生物胶赋予的物理特征，特别是其粘度改进特性和/或保水特性。不幸的是，已证实产生迪优坦的成本效率低。此外，目前这些成本问题妨碍了迪优坦的广泛应用，因为这种生物胶所表现出的粘度不足以替代其它更便宜但有效的生物胶(例如，黄原胶)。因此，需要提供至少能以较低成本生产这种有效迪优坦的方法，和/或提供生产物理特性显示明显改进的迪优坦型生物胶的方式。目前，对任何类型的相关结冷胶类多糖(sphingan)生产的唯一描述(对于迪优坦未证明有任何特异性)涉及较高的产率(见上述Pollock等的专利)。现在还没有任何方式讨论或合理地提出能提供某种方法来生产分子量较高的迪优坦胶，借助这种生产方法，所述迪优坦胶在粘度测量值会体现出改善。
[0008]发明简述
[0009]现已知道，在宿主鞘氨醇单孢菌微生物内扩增迪优坦生物合成所用的某些新分离的DNA序列不仅能提高迪优坦胶产量，还产生了表现出粘度特性增加的迪优坦胶。因此，这种新的DNA序列(通过任何熟知的方法，例如但不限于利用质粒引入宿主微生物内)提供了迪优坦合成方法所寻求的所需结果。采用质粒扩增这些基因的这种方法的明显优点在于将这种分离DNA序列掺入迪优坦合成过程较为简单。另一优点是能产生这种粘度特性较高的靶迪优坦胶，同时还 可能提高发酵生产效率(如果需要的话)。
[0010]因此，本发明包括在许多不同的粘度测试中表现出改进的迪优坦胶。其中:i)固有粘度高于150，优选高于155，更优选高于160dL/g ；ii)海水3rpm粘度高于35，优选高于37,更优选高于40,最优选高于42表盘读数(dialreading) ；iii)海水0.3rpm粘度高于35，000，优选高于39，000，更优选高于40，000，最优选高于41，000厘泊(cP) ；PEG低剪切率粘度高于3500，优选高于3700，更优选高于3900，最优选高于4000cP。如以上术语所定义的，本发明还包括产生这种迪优坦胶的方法，所述方法通过将特定的基因簇引入宿主鞘氨醇微生物并发酵所述微生物以产生迪优坦胶。此外，本发明包括特定的DNA序列和任何载体(例如质粒)来提供基因的多个拷贝或利用更强的启动子来提高这些基因表达，等等。另外，还包括遗传修饰的鞘氨醇菌株，所述菌株含有这种独特的分离DNA序列所确定的迪优坦生物合成基因的多个拷贝。
[0011]本发明的另一方面提供了一种生产迪优坦胶的方法，所述方法包括:
[0012]将至少一种迪优坦生物合成酶的编码序列引入产生迪优坦的鞘氨醇单孢菌宿主微生物；
[0013]在发酵条件下培养该宿主微生物，从而使得该宿主微生物产生至少显示以下特征之一的迪优坦胶:
[0014]a)固有粘度大于150dL/G ；
[0015]b)海水3rpm粘度高于35表盘读数；[0016]c)海水0.3rpm粘度高于35，000厘泊；和
[0017]d)聚乙二醇分散剂存在时的低剪切率粘度高于3500厘泊。
[0018]发现这种独特的分离DNA序列需要至少一种迪优坦生物合成酶，即DpsG聚合酶。在另一可能的实施方式中，这种迪优坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶；和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶。在还有另一可能的实施方式中，这种迪优坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和鼠李糖基转移酶IV ;β-1，4-葡糖醛酸基转移酶II ;葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I ;和葡糖基转移酶III。在还有另一可能的实施方式中，这种迪优坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和多糖输出蛋白DpsD、DpsC和DpsE。在还有另一可能的实施方式中，这种diutab生物合成酶包括鼠李糖基转移酶IV ； β -1, 4-葡糖醛酸基转移酶II ；葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I;葡糖基转移酶in ;葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP_D-葡萄糖-4，6-脱水酶；和dTDP_6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶。本发明方法和属于本发明产物的迪优坦生物合成酶一般选自--聚合酶；裂合酶；鼠李糖基转移酶IV ； β -1, 4-葡糖醛酸基转移酶II ;葡糖基转移酶III ;多糖输出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I;葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶；dTDP_6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶和它们的组合。本发明还包括分离的核酸分子(除靶染色体上可能存在的DNA外)，其编码如以下SEQIDN0所示的至少一种迪优坦生物合成酶:5、7、9、11、13、
15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 和 43 ;或编码与以下 SEQIDN0 有至少 95%相同的酶 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 和 43。
[0019]在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶。
[0020]在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶和多糖输出蛋白。
[0021]在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶和鼠李糖基转移酶IV ;葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I ;β-1，4-葡糖醛酸基转移酶II ;和葡糖基转移酶III。
[0022]在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP_D-葡萄糖-4，6-脱水酶；和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖_脱氢酶。
[0023]在某些实施方案中，所述核酸分子可编码迪优坦聚合酶；裂合酶；鼠李糖基转移酶IV ;β-1，4-葡糖醛酸基转移酶II ;葡糖基转移酶III ;多糖输出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-异戊二烯基磷酸转移酶I ;葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶；dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3-5-差向异构酶；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶；和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶。
[0024]在某些实施方案中，所述核酸分子可包含SEQIDN0:1所示核酸序列。
[0025]本发明的又一方面提供了一种制备结冷胶类多糖胶的方法，所述结冷胶类多糖的平均聚合物长度较长，所述方法包括:
[0026]将至少一种结冷胶类多糖聚合酶的编码序列引入产生结冷胶类多糖的鞘氨醇单孢菌宿主微生物；
[0027]在发酵条件下培养该宿主微生物，从而使得该宿主微生物产生的结冷胶类多糖胶的平均聚合物长度长于引入所述编码序列前该鞘氨醇微生物产生的。[0028]因此，本发明方法(以及由此制备的产品)涉及结冷胶类多糖胶，特别是迪优坦型，包括但不限于:S88、S60和S657。
[0029]如上所述，本发明是发展的顶点，并且实现了将多拷贝的特定DNA序列引入某些鞘氨醇单孢菌菌株增加高粘度迪优坦多糖的生物合成产量。与非工程改造的细菌相比，含有用于提高产量的这些基因的工程改造细菌产生的迪优坦多糖量明显较高，同时产生了上述的高粘度特性。
[0030]按照本发明，可通过本领域熟知的技术分离、回收和克隆引入宿主微生物中的DNA序列(采取任何熟知的形式，例如非限制性的例子还是质粒)，从而产生上述产量增加和粘度增加的特性(不想依赖于任何具体的科学理论，但据信这是经由分子量范围特性增加所致)。然后，将多拷贝的所述DNA递送入鞘氨醇单孢菌属细菌中(借助质粒，其它已知的方式)或借助合适的例如更强启动子提高基因表达。插入靶细菌后，可通过发酵该工程改造细菌并根据所产生的数量和质量来比较产量从而测定迪优坦的生产情况。通过比较本发明方法所得的迪优坦产量和野生型迪优坦生产菌株(ATCC53159)的可同时测定产量增加和粘度增加(量)。
[0031]发明详述
[0032]与本发明有关的以下术语用于通篇说明书中，其意义如下所示:
[0033]通篇说明书利用术语“鞘氨醇单孢菌”指鞘氨醇单孢菌属的革兰氏阴性细菌菌株。
[0034]通篇说明书利用术语“提高的生产者”或“提高的生产”描述含有多拷贝DNA序列的工程改造细菌，所述DNA序列分离自与野生型细菌的相同菌株相比产生显著较高(以重量计至少高约5%) 迪优坦多糖的相同菌株。
[0035]利用术语“分离的”描述从某微生物中取出并经历至少一定程度纯化，即一步或多步纯化步骤的DNA，可利用限制性酶切割所述DNA并将其克隆或插入质粒载体，或者插入或掺入细菌中。
[0036]利用术语“序列”描述根据其核苷酸单位鉴定的具体DNA区段。通篇说明书利用术语“插入”描述将从生产迪优坦的鞘氨醇单孢菌菌株的染色体DNA分离的DNA区段转移入鞘氨醇单孢菌菌株的过程和结果(非限制性例子是借助质粒)。首先可采用本领域熟知的技术将这种分离的DNA引入(依然是非限制性的可能性)所需质粒(此处是PLAFR3)，然后通过，例如接合或迁移将其转移入受者鞘氨醇单孢菌细菌。插入受者鞘氨醇单孢菌细菌后，含有相关DNA序列的质粒在受:者细胞中复制，从而获得广生闻粘度(仍然相/[目是闻分子量范围的)迪优坦多糖所需的DNA区段的若干(至少两个，一般是4-10个)拷贝。采用接合或迁移将所述质粒载体转移入受者细菌通常是有效的。还可利用纯化的DNA以电穿孔或化学转化感受态细胞。可利用其它载体或噬菌体将DNA转移入宿主细胞中。在产生迪优坦的受者鞘氨醇单孢菌中，无需使DNA区段维持在质粒(或其它熟知的递送载体)上。将其它的数拷贝DNA区段引入细菌染色体是惯常的，从而可通过复制细菌DNA的相同机制复制各代区段。或者，可利用更强的启动子元件提高基因表达。
[0037]利用术语“基因扩增”表示例如通过将靶基因克隆到多拷贝质粒上(例如，4-10个拷贝)或将基因的多个拷贝(例如，4-10个)插入细菌基因组中来增加基因的拷贝数，或者表示通过修饰启动子元件来增加基因表达。这些方法和其它方法均可增加所编码蛋白质的数量。[0038]通篇说明书利用术语“生物合成”描述通过鞘氨醇单孢菌细菌生物学产生或合成迪优坦。通过许多细菌酶所调控的一系列步骤从单个碳水化合物单元合成迪优坦多糖。
[0039]可以任何选择的形式(例如仍然优选质粒形式，但不一定)掺入受者细菌的相关DNA序列编码已知对迪优坦多糖的产量增加和分子量增加有益或必需的遗传信息。此外，不依赖于具体的科学理论，虽然据信本发明具体DNA序列(例如质粒pS8中的)能诱导，而不只是提高产量，但还增加了在迪优坦本身的各聚合物内聚合的重复单元数量。因此，据信重复单元的这种增加使得迪优坦胶提供的粘度特性出乎意料地高。由于检测到固有粘度增加，因而可假定分子量增加，二者有幂定律关系。因此，已知线形聚合物(如迪优坦胶)的固有粘度实际上以那种关系与分子量成比例。
[0040]采用标准技术和方法分离相关DNA序列，所述DNA序列是本发明方法的基础并产生了粘度增加的迪优坦多糖。因此，可采用标准方法培养产生迪优坦的鞘氨醇单孢菌菌株，进而从中产生这些序列。然后可通过，例如先将细菌细胞离心并重悬，再经纯化柱洗脱DNA进行DNA提取。纯化完成后，可用限制性核酸内切酶消化分离的DNA，克隆入所需质粒或其它递送载体中，然后转移至受者菌株。可采用本领域已知的其它技术而不作具体限定。
[0041]在本发明中，DNA的克隆取决于本领域标准的常规技术和方法。应该注意，可采用任何方法克隆本发明DNA区段，本发明不限于，例如利用质粒克隆载体。例如，可通过插入噬菌体载体来克隆DNA片段。
[0042]然后可利用质粒或其它递送载体将克隆的DNA序列引入鞘氨醇单孢菌菌株。然后可通过发酵，利用遗传修饰的鞘氨醇单孢菌菌株产生迪优坦。适于发酵的培养基基本上是水性培养基，其通常含有碳源，例如包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖或麦芽糖糊精在内的碳水化合物；氮源，例如无机铵，有机硝酸酯，有机氨基酸或蛋白物质，如水解酵母菌、大豆粉或酪蛋白、蒸馏酒厂废液浓缩物或玉米浆；和无机盐。各种发酵培养基支持产生本发明迪优坦。
[0043]发酵肉汤中可含有各种含量的碳水化合物，但以重量计通常在发酵培养基的约1-10%之间(优选2-8%)。可先加入碳水化合物，再发酵，或者可在发酵期间加入。以重量计，水性培养基中的氮含量在约0.01%-约0.4%。可使用一种碳源或氮源，也可使用这些碳氮源的混合物。发酵鞘氨醇单孢菌细菌可用的无机盐是含有钠、钾、铵、硝酸根、钙、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根和相似离子的盐类。还优选包含痕量金属，例如镁、锰、钴、铁、锌、铜、钥、碘化物和硼酸盐。
[0044]发酵可在约25V -40°C之间，优选约27°C -35°C的温度范围进行。可通过体积放大的标准方法制备接种物，包括摇瓶培养和小规模的深层搅拌发酵。制备接种物的培养基可以与生产培养基相同，或者可以是本领域熟知的几种标准培养基中的任一种，例如Luria肉汤或YM培养基。可采用多个种子阶段(seed stage)以获得所需的接种体积。典型的接种体积范围是最终发酵总体积的约0.5%-约10%。
[0045]发酵容器可装有搅拌器来搅拌内含物。该容器还可装有自动pH和气泡控制装置。可将生产培养基加入容器中，通过加热来适当灭菌。或者，可先将碳水化合物或碳源单独灭菌再加入容器中。可将经培养的种子培养液加入冷却的培养基中(通常在约27°C -约35°C的优选发酵温度)，搅拌发酵培养液约48-约110小时，从而产生高粘度的肉汤。通过用醇，一般是异丙醇沉淀等标准方法从肉汤中回收迪优坦多糖。[0046]本发明的优选实施方式
[0047]提供以下实施例是为说明本发明。实施例的描述不应误解为以任何方式限制了本发明的范围。
[0048]DNA序列分离/质粒产牛
[0049]为首先分离和测定上述创造性结果的合适序列，如下所示构建ATCC53159微生物的基因文库:分离鞘氨醇单孢菌ATCC53159的染色体DNA，用Sau3AI限制性核酸内切酶部分消化。用琼脂糖凝胶纯化15-50kb范围内的DNA片段，将这些片段连接入BamHI消化的粘粒克隆载体pLAFR3(根据Staskawicz等,“分子表征丁香假单胞菌大豆致病变种群 O 和群 I 的克隆无毒力基因”(Molecular characterization of cloned avirulencegenes from raceOand racelof Pseudomonas syrinae pv.Glycinea), J.Bacteriology.1987.169:5789-94),该载体分离自大肠杆菌(Eschericia coli)菌株 JZ279 (Harding 等，“在野油菜黄单孢菌中生物合成黄原胶必需的基因簇的遗传学和物理分析”(Genetic andphysical analysis of a cluster of genes essential for xanthan gum biosynthesisin Xanthomonas campestris), J.Bacteriology.1987.169:2854-61)。将连接反应(产物)包装入λ噬菌体颗粒(利用吉格帕克III金包装提取物(Gigapack III Gold packagingextract),斯特拉基因公司(Stratagene),拉霍亚，加利福尼亚州)，并转染入文库效率(Library Efficiency)大肠杆菌 DH5 a MCR 细胞中(生命技术公司(Life Technologies),罗克维尔，马里兰州)。合并约10，000个四环素耐受性菌落以形成基因文库。然后分离该文库的各序列。该实施例所进行的这项工作包括从鞘氨醇单孢菌ATCC53159微生物分离用于多糖生物合成的特定基因。
[0050]通过与多糖合成缺 陷型突变体，特别是第一个步骤，即葡糖基转移酶I被阻断的那些突变体互补来鉴定用于多糖生物合成的这些基因。由于最初未获得ATCC53159的转移酶I缺陷型突变体，利用与伊乐藻鞘氨醇单孢菌和野油菜黄单孢菌的转移酶I缺陷型突变体互补来鉴定用于迪优坦多糖生物合成的基因。可利用提供IncP转移功能的辅助质粒，通过三-亲本接合(tr1-parental conjugation)将质粒pLAFR3从其大肠杆菌宿主转移至其它革兰氏阴性细菌(根据Ditta等，“革兰氏阴性细菌的广谱宿主性DNA克隆系统:构建苜猜根瘤菌的基因库”(Broad host range DNA cloning system forgram-negative bacteria:construction of a gene bank of Rhizobium meliloti),Proc.Natl.Acad.Sc1.1980.77:7347-51.)。大肠杆菌中每个染色体的RK2型质粒拷贝数估计有5-7个(Figurski等，“利用体外构建的杂交质粒中的IncP-1质粒RK2抑制ColEl复制特性，，(Suppression of CoIEl replication properties by the Inc P-1 plasmid RK2inhybrid plasmids constructed in vitro), J.Mo1.Biol.1979133:295-318.)。
[0051]通过三亲本接合将大肠杆菌中的ATCC53159染色体DNA的基因文库转移入伊乐藻鞘氨醇单孢菌ATCC31461的非黏液突变体(nonmucoid mutant) (GPS2),选择四环素和氯霉素耐受性。所用的辅助质粒是pRK2013(大肠杆菌菌株JZ279中)，其含有窄宿主性复制起点，但显示出迁移PLAFR3所需的反式作用功能(trans acting function)。质粒pRK2013在鞘氨醇单孢菌菌株中不复制。伊乐藻鞘氨醇单孢菌ATCC31461产生多糖结冷胶。结冷胶和迪优坦多糖均具有由[—4) - a -L-鼠李糖-(I — 3) - β -D-葡萄糖-(I — 4) - β -D-葡糖醛酸-(I — 4)-13-D-葡萄糖-(I —]构成的相同四糖重复单元。然而，迪优坦还包含与所述葡萄糖残基之一相连的两个鼠李糖分子构成的侧链，该侧链经乙酰基修饰，而结冷胶不具有侧链糖并经乙酰基和甘油基修饰。突变型GPS2在多糖生物合成的第一步中有缺陷，即通过葡糖基转移酶I将葡萄糖-1-磷酸从m)P-D-葡萄糖转移至细菌异戊二烯基(bactoprenyl)磷酸脂质载体。以非黏液菌落为背景，从四环素选择平板分离产生多糖(黏液)的菌落。推测恢复产生多糖的克隆包含编码葡糖基转移酶I的ATCC53159基因加上约20-25kb毗连DNA。从8个黏液GPS2转接合子分离质粒DNA，通过电穿孔转移至大肠杆菌菌株DH5ci (生命技术公司)。从大肠杆菌分离质粒以而获得用于限制性核酸内切酶HindIII/Ec0RI(切割多接头中BamHI限制性核酸内切酶位点的任一侧)进行双重消化的足够DNA，进而从载体上切下插入的DNA。通过凝胶电泳测定克隆中插入DNA的大小。通过从侧接载体的BamHI位点的质粒序列的特异性引物开始测序来测定几种质粒的终序列。利用BLASTX比较计算机数据库中的序列来分析各序列。类似地，通过三亲本接合将ATCC53159基因文库转移入转移酶I缺陷的利福平耐药性非黏液野油菜黄单孢菌突变体(CXC109)中(例如，上述Harding等的参考文献所述)，选择四环素和利福平耐药性。野油菜黄单孢菌产生黄原胶多糖，转移酶I将葡萄糖-1-磷酸从M)P-D-葡萄糖转移至细菌异戊二烯基磷酸脂质载体也能启动其合成(Ielpi等，“在野油菜黄单孢菌中顺序装配和聚合黄原胶多糖的聚异戍烯醇连接的五糖重复单兀”(Sequential assembly and polymerization of thepolypreno1-1 inked pentasaccharide repeating unit of the xanthan polysaccharidein Xanthomonas campestris), J.Bacteriology.1993.175:2490-500)。如上所述从黏液转接合子纯化质粒并如上所述测定末端序列。
[0052]德克萨斯州休斯顿市的拉克技术公司(Lark Technologies Inc.,Houston,TX)采用双链鸟枪测序对克隆在质粒PS8和pX6中的S657DNA进行了完全测序。分析了这些序列以鉴定用于迪优坦生物合成的基因。根据与数据库中其它基因，特别用于S-88结冷胶类多糖(例如，上述‘516Pollock等的专利所述的)、GeneBan k登录号U51197和结冷胶(GenBankAY217008和AY220099)生物合成的公布基因的同源性指定基因功能。鉴定了编码主链中四种糖的转移酶的基因和用于dTDP-鼠李糖合成的4种基因。用于多糖分泌的基因基于与生物合成其它多糖的基因的同源性。两种基因编码与参与蛋白质分泌的蛋白质同源的蛋白质。推测两种基因编码聚合酶和裂合酶。质粒PX6中的插入物含有17种基因，包括编码转移酶I (启动迪优坦合成的第一步)的基因dpsB，用于分泌的基因和用于dTDP-鼠李糖合成的4种基因，但缺乏转移酶I1、III和IV的基因，和聚合酶及裂合酶的推测基因。质粒pS8含有dps基因簇的20种基因，包括所有4种主链糖转移酶的基因，用于dTDP-鼠李糖合成的四种基因，用于多糖分泌的基因，包括聚合酶和连接酶的推测基因，但缺乏功能未知的基因，orf6和orf7。质粒pS6含有用于分泌和4种糖转移酶的基因，但不含用于dTDP-鼠李糖合成的所有基因或聚合酶的基因。质粒PX4只含有dps区域的一小部分，但包含Pollock等报道的用于dTDP-鼠李糖合成的4种基因和编码转移酶I的基因，从而足以导致鞘氨醇菌株中多糖产量增加。
[0053]菌株产牛
[0054]然后通过上述的三亲本接合将上述四种质粒引入鞘氨醇单孢菌ATCC53159号菌株中，从而形成新的S657工程改造菌株(S657/pS8、S657/pS6、S657/pX6和S657/pX4)。然后如上所述进行发酵，从而产生了下述的生物胶物质。所有4种质粒对迪优坦生产量均产生有益作用；然而，PS8质粒还出乎意料地极大提高了迪优坦粘度并增加了其分子量。提供了 pS8的DNA序列(26278bp) (I号DNA序列)，下表1中以表格的形式列出了编码的基因。质粒pS8中的插入物DNA包含基因DpsG到rmlD和基因dpsS和orf7的一部分。
[0055]以下基因列表基本上是质粒pS8中插入物的DNA序列所代表基因的清单。
[0056]表1
[0057]
【权利要求】
1.一种迪优坦胶，其显示固有粘度高于约150deciL/g多至约170.7deciL/g。
2.如权利要求1所述的迪优坦胶，其显示固有粘度高于约155deciL/g多至约170.7deciL/g。
3.如权利要求2所述的迪优坦胶，其显示固有粘度高于约160deciL/g多至约170.7deciL/g。
4.一种迪优坦胶，其显示海水3rpm粘度高于约35表盘读数多至约47表盘读数。
5.如权利要求4所述的迪优坦胶，其显示海水3rpm粘度高于约37表盘读数多至约47表盘读数。
6.如权利要求5所述的迪优坦胶，其显示海水3rpm粘度高于约40表盘读数多至约47表盘读数。
7.如权利要求6所述的迪优坦胶，其显示海水3rpm粘度高于约42表盘读数多至约47表盘读数。
8.—种迪优坦胶,其显示海水0.3rpm粘度高于约35，OOOcp多至约41，500cp。
9.如权利要求8所述的迪优坦胶,其显示海水0.3rpm粘度高于约38，OOOcp多至约41，500cp。`
10.如权利要求9所述的迪优坦胶,其显示海水0.3rpm粘度高于约39，OOOcp多至约41，500cp。
11.如权利要求10所述的迪优坦胶,其显示海水0.3rpm粘度高于约40，OOOcp多至约41，500cp。
12.如权利要求11所述的迪优坦胶，其显示海水0.3rpm粘度高于约41，OOOcp多至约41，500cp。
13.—种迪优坦胶，其在聚乙二醇分散剂存在下显示低剪切率粘度高于约3500cp多至约 4980cp。
14.如权利要求13所述的迪优坦胶，其在聚乙二醇分散剂存在下显示低剪切率粘度高于约3700cp多至约4980cp。
15.如权利要求14所述的迪优坦胶，其在聚乙二醇分散剂存在下显示低剪切率粘度高于约3900cp多至约4980cp。
16.如权利要求15所述的迪优坦胶，其在聚乙二醇分散剂存在下显示低剪切率粘度高于约4000cp多至约4980cp。
【文档编号】C08B37/00GK103772520SQ201310209621
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2006年10月31日 优先权日:2005年11月1日
【发明者】Y·N·帕特尔, R·科尔曼, S·马茨克 申请人:Cp凯尔科美国股份有限公司