植物表达载体、蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用的制作方法与工艺

本发明涉及昆虫双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默的领域。更具体地，本发明涉及遗传构建体，其被设计用来在植物中表达蚜虫基因的dsRNA。这些构建体可被用于产生转基因植物，对取食该植物的蚜虫具有潜在的抑制或杀伤作用。

背景技术：
蚜虫危害棉花、小麦、油菜等多种作物。化学杀虫剂是目前主要的控制手段。但化学杀虫剂存在副作用，它们不仅污染环境，也没有特异性，除了对蚜虫杀伤外，也会对作物及其它昆虫造成伤害。化学杀虫剂在环境中代谢缓慢，会进入食物链中，在高级的捕食物种中积累，并产生毒性。因为生物杀虫剂可以避免化学杀虫剂的这些危险，而受到青睐。例如，Bacillusthuringiensis(B.t.)细菌作为一种环境安全的生物杀虫剂已经市场化应用超过30年了。生物杀虫剂除了能保持土壤和水清洁外，也会因化学杀虫剂使用量的降低而使田间有益昆虫的数量增加。RNAi对靶基因mRNA抑制的特异性和高效性使之成为一种控制基因表达的有力工具。RNAi是由小干扰RNA（siRNA）介导的序列特异性的转录后基因沉默过程。RNAi由dsRNA触发，细胞中的dsRNA被Dicer核酸酶水解为21～23nt的siRNA，siRNA再引导核酸内切酶对细胞内的与之序列配对的mRNA进行降解。有些动物的消化道可以吸收来自食物的dsRNA，并诱导消化道细胞产生RNAi现象，或进一步地引起系统性的基因沉默。通过饲喂表达dsRNA的细菌，以成功建立了线虫基因沉默的方法。如果dsRNA引发沉默的基因是害虫生存所必需的，则该dsRNA就可能研制为杀虫剂。dsRNA能否达到杀虫的效果，与dsRNA能否被昆虫中肠有效吸收和在昆虫细胞中能否引发强烈的RNAi效应有关。为此，dsRNA首先必须在昆虫中肠达到较高的浓度。本发明提供了一种RNAi载体，可以使转基因植物在韧皮组织中表达棉蚜的dsRNA和ToMV的CP蛋白，该dsRNA由于包含OAS而可以被CP包装，从而降低在消化道的降解，在中肠形成较高的浓度。

技术实现要素：
本发明提供了一种植物表达载体、蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用。一种植物表达载体，用于构建dsRNA植物表达载体，dsRNA序列与番茄花叶病毒（ToMV）的起始组装序列（originalassemblysequence，OAS）相连，因此转录的RNA分子能够被ToMV的外壳蛋白（CP）所包装；所述的植物表达载体还包含了ToMV的CP基因的表达框架，其编码的CP能包装含OAS的RNA分子，dsRNA编码序列和CP基因序列均置于一个韧皮部优势表达的启动子之下，使dsRNA和CP蛋白能在转基因植物的筛管中积累。将棉蚜靶标基因序列与ToMV的OAS相连，并同时表达ToMV的CP蛋白；CP蛋白可以识别OAS，并从OAS开始对RNA包装；蛋白质的包装可以降低RNA与RNA酶的接触，从而减少降解的风险；另外，蚜虫取食于植物的筛管，本发明用韧皮部特异性的启动子使RNA和CP能在筛管中形成较高的浓度，而在其它组织中表达很低。本发明载体在OAS两侧提供了两组由同尾酶（XbaI/AvrII和XmaI/BspEII）组成的插入位点，当靶标序列的两侧分别为XbaI和XmaI及其同尾酶时，均可被克隆到上述两个位点。本发明载体以pCAMBIA2300为骨架，可以用农杆菌介导法对目标植物进行转化，转化细胞用卡那霉素筛选。在实施例中，用于产生dsRNA的靶标序列是从棉蚜中分离的V-型质子泵ATPase的A亚基基因的同源片段。但靶标序列可以不限于该基因以及棉蚜。本发明载体中，dsRNA的转录是由韧皮部特异性启动子驱动的，使dsRNA主要在筛管中积累。其潜在的害虫防治对象为用刺吸式口器取食的蚜虫、粉虱、介壳虫等。附图说明图1为pBiRolCPOAS载体图；图2为PRNAiAV2载体图；图3为PCR产物电泳；图4转基因拟南芥抑制取食棉蚜AV2基因的表达。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1：载体构建所需DNA片段的制备载体（图1）构建所需ToMVCP、ToMVOAS和NOS终止子等DNA片段均通过PCR获得，两端克隆所需的酶切位点通过PCR引物引入，所用引物如下：ToMVOAS和ToMVCP的扩增，以ToMV的基因组RNA为模板，分别用引物对OAS_F/OAS_R和CP_F/CP_R进行RT-PCR。RT-PCR采用IIIOne-StepRT-PCRSystemwith（目录编号12574018，Invitrogen）试剂按说明书操作完成。NOS终止子的扩增以pBI221为模板，用引物NOS_F/NOS_F进行PCR。PCR产物均采用琼脂糖凝胶电泳分离。NOS终止子扩增产物大小为272bp，ToMVOAS的扩增产物大小为414bp，ToMVCP的扩增产物大小为495bp（图3）Rol启动子（SEQIDNO:2）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并克隆到pUC57载体。实施例2：pBiRolCPOAS载体构建下列过程中酶切产物的分离均采用琼脂糖凝胶电泳方法，用QIAquickGelExtractionKit纯化，DNA片段的连接用T4DNA连接酶（promega，目录号M1801）按说明书进行。RNAi载体的构建流程为：1.将实施例1中ToMVCP通过限制性内切酶BamHI/SacI位点克隆到pBi221，构建为载体p221CP；2.用BamHI/PstI双酶切将Rol启动子从pUC57载体上切下（图4），经琼脂糖凝胶电泳分离，和回收后，克隆到p221CP的BamHI/PstI位点，构建为载体p221-Rol-CP；3.将实施例1中NOS终止子通过限制性内切酶HindIII/PstI位点克隆到p221-Rol-CP，构建为载体p221-RolCPNOS；4.将实施例1中ToMVOAS通过限制性内切酶BspEI/PstI位点克隆到p221-RolCPNOS，构建为载体p221RolCPOAS；5.将p221RolCPOAS的HindIII/EcoRI酶切片段克隆到pCAMBIA2300的相应位点，构建成表达载体pBiRolCPOAS。实施例3：pRNAiAV2载体构建本实施例是应用载体pBiRolCPOAS构建棉蚜V型质子泵基因(AV2)dsRNA表达载体的方法。棉蚜AV2基因片段是根据桃蚜的同源基因序列（XM_001950855）设计兼并引物，从棉蚜cDNA扩增而来。扩增片段克隆到pGEM-Teasy载体（promega），经测序确定序列为SEQIDNO:1。pRNAiAV2载体构建流程如下：1.用引物AV2_F（CCCGGGTTCATACAGTAAATATACAA）和AV2_R(TCTAGATATAACTGATCAAAGTCAGCACGG)扩增AV2的部分片段，在片段的两端分别引入XmaI和XbaI位点；将扩增的片段克隆到pGEM-Teasy载体（promega）测序；2.用XmaI和XbaI从1.中T载体上把AV2片段切下，命名为AV2_XX；3.用XmaI和XbaI消化pBiRolCPOAS，回收载体片段，并与AV2_XX连接，构建得到载体pRolAV；4.用BspEII和AvrII消化pRolAV，回收载体片段，并与AV2_XX连接，构建得到载体pRNAiAV2。实施例4：获得转基因拟南芥用电击转化法将质粒pRNAiAV2导入农杆菌GV3101中，用于转化拟南芥。拟南芥转化采用蘸花法。哥伦比亚生态型拟南芥被用于转化：将拟南芥种在蛭石和草炭土（1:1）的盆钵中，置到短日照（光照8h/16h黑暗）培养室里，22℃培养1个月；将光周期改为（16h光照/8h黑暗），继续培养1～2周，待花薹抽出后即可用于转化。使用200μl的移液器将准备好的农杆菌浸染液滴在花上。浸染后的拟南芥植株用保鲜膜覆盖保湿，24小时后去除保鲜膜。隔一周后重复处理1次。浸染后的植株在同样的生长条件使其正常生长，收获种子。将上述转化的拟南芥种子播种在含有50μg/ml的卡那霉素的1/2MS固体培养基上。经16h光照/8h黑暗的培养室里培养约10～14天，选择绿色、生长良好的植株（T1代转基因植株）移栽到含有蛭石和草炭土（1:1）的盆钵中，收获自交种子；将自交种子继续播种在卡那霉素培养基中，筛选抗卡那霉素植株，自交收获种子，每个T1植株收获8个自交二代植株种子；每个自交T2植株播种100粒种子于卡那霉素培养基上，观察幼苗（T3植株）是否存在抗性分离，留取不分离的（纯合）株系。实施例5：转基因植物对取食棉蚜基因的抑制作用随机选取3个转基因拟南芥株系，每个株系取9株用接种棉蚜。每株接种20只蚜虫，用防虫网隔离，放置在光照培养箱中培养，饲喂7天后，收集棉蚜，用Trizol按照说明书提取棉蚜总RNA，再经过DNAI消化后，按照FermentRevetAidTMH-MinusFirstStandCDNASynthesisKit说明书合成cDNA的。荧光定量PCR试剂；FermentRevetAidTMH-MinusFirstStandCDNASynthesisKit购自Ferment公司。表2.棉蚜基因表达分析所用引物引物名称核酸序列AG.AV2O598FGGCACGTCATGTTGTTGAGTAG.AV2O714RGGGTCCTTGAACTTCATGGAAg.Rpl7.38FTGCCGGAGTCTGTACTCAAAg.Rpl7.292RTCACACCACGAATACGCA棉蚜基因的转录表达分析采用实时荧光定量PCR方法。PCR预混试剂为Roche公司的LightCyclerSYBRGREENIMaster。内参基因为棉蚜Rp17基因，引物见表2。反应程序：94℃预变性5min；94℃15s，58℃30s，72℃20s，共40个循环；72℃下延伸10min。基因表达量采用2-△△CT法进行计算。结果显示，与喂食野生型拟南芥的蚜虫相比，取食转基因拟南芥的蚜虫，其AV2基因的表达受到明显抑制（图4）。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。