本发明涉及一种高转染效率、低细胞毒性的功能化纳米肝素钠 -PEI-Ca2+基因导入材料及制备方法。
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背景技术：
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随着人类基因图谱测定的完成，我们对人类疾病发病机制的认识在基因水平上取得了突破性的进展。目前研究表明，有许多疾病的发生及发展与基因密切相关。如果可以筛查出与疾病特异相关的基因片段或者基因突变，就可以有针对性地在基因水平上进行特异治疗，如通过导入相关缺失基因或沉默基因，以增强相关缺失功能或者沉默致病基因，从而达到彻底治疗的目的。将目的基因安全有效地导入生物体内是目前此研究领域中的关键和难点。
基因导入系统或方法可以分为两类：病毒型基因导入系统，以逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒为载体；非病毒型基因导入，如显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、阳离子脂质体法、以及新兴的纳米基因导入材料。由于病毒型基因导入系统存在许多严重的不足，如病毒转染有可能激活原癌基因等，故非病毒型转染方式是目前的研究热点，在上述非病毒式转染中，显微注射一次只能处理一个细胞；基因枪穿透力十分有限；磷酸钙共沉淀法结果不稳定；仅阳离子脂质体法表现了良好的转染效率，但是过高的毒性又限制了它的应用。
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技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种功能化纳米肝素钠-PEI-Ca2+基因导入材料及制备方法，其基因导入材料的生物相容性好，且由低毒的材料组成的复合材料，它是属于非病毒型载体，表现出良好的细胞相容性，稳定且较高的转染效率。
为了实现上述目的，本发明的纳米肝素钠-PEI-Ca2+基因导入材料技术方案为：一种纳米肝素钠-PEI-Ca2+基因导入材料，它为肝素钠、聚醚酰亚胺（PEI）、氯化钙组合成平均直径为100nm左右的肝素钠-PEI-Ca2+纳米球形材料，肝素钠含量为0.54g/g，聚醚酰亚胺（PEI）含量为0.16g/g，钙离子含量为0.30g/g。
所述纳米肝素钠-PEI-Ca2+基因导入材料能和绿色荧光蛋白质粒基因pGFP以非共价方式结合，形成无机纳米基因导入系统，用于基因转染。
制备功能化纳米肝素钠-PEI-Ca2+基因导入材料的方法包括如下步骤：（1）取材料：氯化钙、聚醚酰亚胺（PEI）、肝素钠，分析纯；使用时无进一步纯化步骤，所有的制备用玻璃器皿，均在乙醇中超声 5分钟，然后双蒸水清洗，并用洗液H20/HNO3（65%）/H2O2（35%）（1：1：1，v/v/v）清洗，之后再用双蒸水、丙酮依次清洗，最后在空气中晾干。（2）材料的制备：用去离子水溶解氯化钙制备0.1M新制的氯化钙溶液；用去离子水稀释肝素钠溶液制备2g/L新制的肝素钠溶液；制备4g/L新制的PEI溶液；首先，在10ml去离子水中加入 4mL2g/L新制的肝素钠溶液、+1mL4g/L新制的PEI溶液，+2mL0. 1M新制的氯化钙溶液，置于25mL的烧杯中，充分搅拌3天后，静置 1天，在8000r/m速度离心，之后用双蒸水洗至PH=7，最终样品在室温下晾干。
钙离子本身可以用于基因转染，即磷酸钙共沉淀法。但是转染效率受温度、浓度、操作环境等众多因素影响，很不稳定，我们将钙离子固定在这种功能化的肝素钠-PEI-Ca2+材料表面，再与DNA中的磷酸根发生作用，可以达到更加稳定的转染效率，并且也同时降低了高浓度钙离子可能导致的活性，这将是其以后在体内得到进一步应用的前提。
本发明具有以下的优点：
1.具有较高的转染效率，在人乳腺癌细胞中可以达到40%左右。
2.毒性低，因为肝素钠、氯化钙具有良好的生物相容性，细胞生存率很高；
3.材料分散性良好，符合对转染的要求。
4.非常低的成本，聚醚酰亚胺（PEI）是一种综合性能优良的热塑性工程塑料；肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐；另外实验中使用的化学药品，如氯化钙等都是常见易得的廉价试剂；材料制备反应简单易操作，可重复性好。
[附图说明]
图1为本发明基因导入材料HS-PEI-Ca2+的扫描电镜图片。
图2为转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图片。
图3为转染后的细胞生存率图片。
图4为细胞生存率图。
[具体实施方式]
一、本发明基因导入材料的制备：
1、取材料：主要材料：氯化钙、聚醚酰亚胺（PEI）、肝素钠，分析纯，Aldrich公司产品；使用时无进一步纯化步骤，Aldrich公司产品。所有的制备用玻璃器皿，均在乙醇中超声5分钟，然后双蒸水清洗，并用洗液H20/HNO3（65%）/H2O2（35%）（1：1：1，v/v/v）清洗，之后再用双蒸水、丙酮依次清洗，最后在空气中晾干。
2、材料的制备：用去离子水溶解氯化钙制备0.1M新制的氯化钙溶液；用去离子水稀释肝素钠溶液制备2g/L新制的肝素钠溶液；制备4g/L新制的PEI溶液。首先，在10ml去离子水中加入4mL2g/L 新制的肝素钠溶液、+1mL4g/L新制的PEI溶液，+2mL0.1M新制的氯化钙溶液，置于25mL的烧杯中，充分搅拌3天后，静置1天，在8000r/m速度离心，之后用双蒸水洗至PH=7，最终样品在室温下晾干。参阅图1、2分别为HS-PEI-Ca2+的扫描电镜SEM和透射电镜TEM 图。
二、结合性能的测定
1、主要材料
绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-C1）；HEPES平衡盐溶液（自配）；电泳缓冲液（0.5×TBE，自配）；DNA上样缓冲液；溴化乙啶（EB）。
2、主要方法
1μLHS-PEI-Ca2+溶液（5mgHS-PEI-Ca2+溶解在500μL双蒸水中）与 1μLpEGFP-C1水溶液（0.1μg/μL）以及8μl双蒸水（pH=7.4water）在1.5mL离心管中混合，置于室温下30分钟让其充分结合。 HS-PEI-Ca2+和pEGFP-C1的质量比分别用100:1，50:1，30:1，10:1， 1:1。在5000rpm的速度下离心5min。将沉淀物加载到1%的琼脂糖（EB0.1μg/mL）在TAE的缓冲下，在100V电压下跑40min，然后在 320nm处观察条带。
3、结果
结果观察，有多种条带出现，这是因为pEGFP-C1有多种构型所致。在质量比30:1，10:1，1:1处条带清晰明显，说明在这些质量比之下，DNA和纳米颗粒结合不是很好，到了100:1，50:1条带消失，说明结合完全了。
这些结果表明：带正电荷的pEGFP-C1和HS-PEI-Ca2+有一个最佳的结合比，超出50:1以后过多的纳米颗粒显得不再重要，所以使用 50:1进行转染。
三、转染
1、主要材料
人乳腺癌细胞；PEI@pEGFP-C1联合体（上述制备）；DMEM培养基；胎牛血清FBS；6孔培养板。
2、主要方法
（1）细胞的培养：将人乳腺癌细胞用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入到6孔板中（5×106/孔）,用含FBS10%的DMEM溶液并加转染优化试剂培养至细胞密度为60%～70%的融合度。
（2）细胞转染实验：将培养好的细胞上清除去，换新的培养液并加入质量比50:1的HS-PEI-Ca2+@pEGFP-C1联合体，培养48小时后分别对其荧光（图3）、细胞存活率（碘化吡啶标识，流式细胞仪检测）（图4）、转染效率（流式细胞仪检测）进行测定。
3、结果分析
荧光图可以看出有明显绿色荧光，并且覆盖面比较大。细胞生存率图分别为无添加物、HS-PEI-Ca2+@pEGFP-C1联合体、lipofectamine 2000@pEGFP-C1联合体的生存率，可以看到HS-PEI-Ca2+@pEGFP-C1 联合体对细胞生存率的影响是很小的。比lipofectamine2000@ pEGFP-C1联合体的影响小很多。转染效率图可以看到 HS-PEI-Ca2+@pEGFP-C1联合体可以达到约40%的转染效率，这是在保证了细胞生存率的前提下达到了一个如此的转染效率。虽然不及 lipofectamine2000高，但是其高细胞相容性是lipofectamine2000所无法比拟的。表现出了HS-PEI-Ca2+做为转染试剂的巨大潜力。