用于诱导细胞因子的环状二核苷酸的制作方法

本发明属于免疫治疗领域。它涉及式i、ii和iii的环状二核苷酸(cdn)。特别地，它涉及氟化脱氧核糖-cdn及其可药用盐和前药，它们能够在人细胞和动物细胞中诱导i型干扰素产生。这些环状二核苷酸的细胞因子诱导活性需要真核细胞受体干扰素基因刺激物(sting)的存在，如体外所展示的。

发明背景

细胞因子诱导免疫疗法

免疫疗法是快速扩张的医学治疗领域，其中为治疗益处而人为激活、抑制或否则调节患者的免疫系统。免疫治疗剂包括细胞、抗原(例如细菌或病毒的片段)、抗体、核酸、肽、蛋白质、天然存在的配体和合成分子。细胞因子是主要因其借助复杂信号传导网络协调免疫应答的作用而知名的小分子糖蛋白信使，不过它们还执行非免疫功能。已经将它们作为免疫治疗剂广泛地探索。然而，直接施用细胞因子作为免疫治疗药受多种因素限制，包括细胞因子在血液中的半寿期非常短，这必须采用频繁给药和高剂量予以补偿。一个高度有前景的免疫疗法方案是细胞因子诱导法，因而患者用根据需要在其身体中触发一种或多种治疗有益性细胞因子产生的免疫调节剂治疗。

sting、细胞因子和免疫应答

细胞因子生理产生的主要参与者是干扰素基因刺激物(sting；也称作eris、mita、mpys或tm173)，一种在天然免疫中最重要的跨膜受体蛋白。人sting由基因tmem173编码。sting的激活通过irf3(干扰素调节因子3)途径导致i型干扰素(例如ifn-α和ifn-β)产生并且通过致瘤性转录因子nf-κb(活化型b细胞核因子κ-轻链增强子)途径导致促炎细胞因子(il-1α、il-1β、il-2、il-6、tnf-α等)产生。另外，研究者最近报道，响应于病毒性感染，sting激活stat6(信号传导者和转录激活物6)以诱导(th2型)、增加(il-12)或减少(il-10)各种细胞因子(包括趋化因子ccl2、ccl20和ccl26)的产生(chen等人,2011)。

sting激动剂

目前已知人sting以三种方式激活：通过结合正在侵入的细菌或古细菌释放的外源(3’,3)环状二核苷酸(c-digmp、c-diamp和c-gamp)是通过(参见(gomelsky,2011)及其中参考文献)；通过结合(2’,3’)环状鸟苷单磷酸–腺苷单磷酸酯((2’,3’)c-gamp)(一种最近发现的由环状gmp-amp合酶(cgas；也称作c6orf150或mb21d1)在外源双链dna(例如由正在侵入的细菌、病毒或原虫释放的)或哺乳动物中的自我-dna存在下产生的内源环状二核苷酸)(参见，例如(ablasser等人,2013)和(zhang等人,2013))；或通过结合合成性配体，如前述天然存在的环状二核苷酸的类似物(参见，例如(dubensky,kanne和leong,2013)和(li等人,2014))。

sting在免疫疗法中的调节作用

受到sting、细胞因子和免疫应答之间互作的鼓舞以及受到关于sting及其突变之临床意义的知识体系日益增长鼓舞，研究者最近已经开始探索sting作为多种适应症的治疗靶。正在寻求新的sting激动剂作为多种领域(如癌症或传染性疾病)中人和动物健康的治疗剂。已知的环状二核苷酸sting激动剂是一类优异的作为碱基类似物之基础的化合物，所述化合物可能显示出令人感兴趣的生物学活性或合乎需要的药物样特性。本发明包括治疗性用于人类和动物健康中的新环状二核苷酸。

本发明的具体实施例

cdnsting激动剂

在us/2014/0329889和wo/2014/189805中描述了环状二核苷酸(cdn)sting激动剂的一些示例。然而，作者仅化学合成了从他们提供的非常上位的化学结构图中理论可能的很少数的化合物并对其进行生物测试。他们没有公开任何详细的结构-活性关系或没有描述特定cdn结构类别的任何类别效应。因此，作者为所需的sting相关应用提供单薄基本原理以确证根据实际sting活性或其他特性(例如药物样特性)，选择一个结构类别的cdn胜过另一个类别。最近，wo/2015/077354(pct/us2014/066436)探索了sting激动剂，包括cdn，所述激动剂均是其中两个核苷酸含有核糖糖部分并且两个核苷酸由硫代磷酸酯二酯键连接的(2’,3’)-cdn。

cdnsting激动剂的知识鸿沟

对不同结构类别的cdn的生物学活性知之甚少。具体而言，关于根据cdn结构类别的类别效应在先申请的专利稀少，也没有关于这些类别效应可能怎样特别用于与sting活性相关的特定治疗应用、诊断应用或研究应用的在先申请的任何专利。这种信息将对基于操作sting活性，发现并利用具有治疗应用、诊断应用或研究应用需要之特性的新cdnsting激动剂至关重要。

发明简述

考虑缺乏已报道的sting激动剂结构-活性关系，sting激动剂领域的发明时机成熟。在这种情况下，本发明涉及氟化脱氧核糖-cdnsting激动剂，所述激动剂相对于其相应非氟化类似物显示出独特、非显而易见和先前未报道的类别效应。

在我们探索环状二核苷酸(cdn)作为免疫调节性化合物和sting潜在激动剂的工作中，我们最初力图合成并分析以下式(i)、(ii)和(iii)的cdn：

其中：

·x1是h、oh或f；

·x2是h、oh或f；

·z是oh、or1、sh或sr1，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在体内提供oh或sh的酶不稳定基团，如新戊酰氧基甲基；

·b1和b2是选自以下的碱基：

条件是：

-在式(i)中：x1和x2不是oh，

-在式(ii)中：当x1和x2是oh时，b1不是腺嘌呤并且b2不是鸟嘌呤，并且

-在式(iii)中：当x1和x2是oh时，b1不是腺嘌呤，b2不是鸟嘌呤，并且z不是oh。

在本发明中，术语“环状二核苷酸”(缩写为“cdn”)代表一类在两个核苷之间具有两个磷酸二酯键或两个硫代磷酸酯二酯键或一个磷酸二酯键和一个硫代磷酸酯二酯键的环状分子。这包括(3’,5’)-(3’,5’)核苷酸键(缩写为(3’,3’))；(3’,5’)-(2’,5’)核苷酸键(缩写为(3’,2’))；(2’,5’)-(3’,5’)核苷酸键(缩写为(2’,3’))；和(2’,5’)-(2’,5’)核苷酸键(缩写为(2’,2’))。

术语“核苷”指包含氮碱基和五碳糖的糖基胺，其中含氮碱基通过β-糖苷键与五碳糖结合。

术语“核苷酸”指在糖部分的位置5’、3’或2’连接到磷酸酯基团的任何核苷。

“可药用盐”包括从可药用无机或有机碱和酸衍生的那些盐。合适的盐包括衍生自碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁的那些，连同制药技术中熟知的许多其他酸。

术语“可药用前药”在本文指这样的化合物，其中所述化合物在宿主(即接受化合物的人类或动物受试者)中经代谢例如水解或氧化以形成本发明的化合物。前药的常见示例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不稳定保护基的化合物。前药包括可以氧化、还原、胺化、去胺化、羟化、去羟化、水解、去水化、烷基化、去烷基化、酰化、去乙酰化、磷酸化或去磷酸化以产生活性化合物的化合物。

如本文所用，术语“前药”指由如上文定义的结构式(i)、(ii)或(iii)或其任一个具体实施方案代表的化合物的无活性或活性衍生物，所述衍生物在动物(例如哺乳动物，如人类)的身体内部经历自发或酶促转化，以释放药理活性形式的化合物。关于综述，参见(rautio等人,2008)。

特别地出于本发明的目的，由结构式(i)、(ii)或(iii)代表的前药化合物，包括其任一个上述具体实施方案，可以如(hecker和erion,2008)中详述那样形成。

磷酸酯前药可以采取酯、尤其酰氧基烷基酯(例如新戊酰氧基甲基酯(pom))或s-酰基硫代乙基(sat)酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺如氨基酸前药的形式。

表达“酶不稳定保护基”指这样的基团，所述基团设计成借助电荷掩蔽而令化合物跨细胞膜或寄生物膜被动扩散成为可能，从而一旦在细胞或寄生物内部，化合物发生提供oh或sh基的酶促转化(或去保护)。例如，酶不稳定保护基的示例包括酰氧基烷基如新戊酰氧基甲基(pom)或s-酰基硫代乙基(sat)或氨基酸基团。

在本说明书中，认为表述“式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸”还包括所述式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸的可药用盐或可药用前药。

当b1或b2是鸟嘌呤时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当b1或b2是腺嘌呤时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当b1或b2是次黄嘌呤时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当b1和b2独立地选自鸟嘌呤或腺嘌呤时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当b1或b2独立地选自鸟嘌呤或次黄嘌呤时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当b1和b2独立地选自腺嘌呤或次黄嘌呤时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当z是oh时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当z是sh时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

z是oh或sh时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当z是sr1时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在体内提供oh或sh的酶不稳定基团，如新戊酰氧基甲基。

当b1和b2独立地选自腺嘌呤或次黄嘌呤并且x1和x2相同时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。优选地，x1和x2是oh或氟原子。在一个具体实施方案中，z是oh或sh。

当b1和b2独立地选自鸟嘌呤或次黄嘌呤并且x1和x2相同时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。优选地，x1和x2是oh或氟原子。在一个具体实施方案中，z是oh或sh。

当b1和b2独立地选自腺嘌呤或鸟嘌呤并且x1和x2相同时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。优选地，x1和x2是oh或氟原子。在一个具体实施方案中，z是oh或sh。

当x1和x2不是氟原子时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。

当x1和x2当中至少一者是氟原子时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。在一个具体实施方案中，x1和x2均是氟原子。

一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸是以下环状二核苷酸(每者赋予格式为“cl###”的五字符代码)：

或其可药用盐或前药。

当一个或两个核苷在2’位置受修饰时是一个特定类别的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸。这个类别包括以下化合物：

我们鉴定了这些cdn的一个在结构上前所未有的亚群，所述亚群显示令人惊讶的生物学活性及先前从未曾作为sting激动剂报道。这些cdn形成本发明的基础并且区别于先前报道的cdnsting激动剂(参见，例如：us/2014/0329889和wo/2014/189805)。因此，在一个方面，本发明提供由以下全部结构标准限定的cdn：首先，不同于其中每个核苷酸的糖部分是核糖的天然存在的cdn，在本发明的cdn中，每个核苷酸的糖部分是2'-脱氧核糖；其次，在本发明的cdn中，在两个核苷酸中糖部分的2’位置必须以氟原子取代，或一个核苷酸的糖部分的2’位置必须以氟原子取代，而另一个核苷酸的糖部分的2’位置必须以氢原子取代；再者，在本发明的cdn中，每个核苷酸中的碱基优选地选自鸟嘌呤、腺嘌呤或次黄嘌呤，条件是cdn的两个核苷酸不能含有相同的碱基。

因此，在一个实施方案中，本发明提供根据权利要求1所述的式(i)的cdn，即式(i)的化合物：

其中：

·x1是h或f；

·x2是h或f；

·x1和x2当中至少一者是氟原子；

·z是oh、or1、sh或sr1，其中：

i)r1是na或nh4，或者

ii)r1是在体内提供oh或sh的酶不稳定基团，如新戊酰氧基甲基；

·b1和b2是选自以下的碱基：

并且b1是与b2不同的碱基，

或其可药用盐。

表达“b1是与b2不同的碱基”包括b1是鸟嘌呤并且b2是腺嘌呤，或b1是鸟嘌呤并且b2是次黄嘌呤，或b1是腺嘌呤并且b2是鸟嘌呤，或b1是腺嘌呤并且b2是次黄嘌呤，或b1是次黄嘌呤并且b2是鸟嘌呤，或b1是次黄嘌呤并且b2是腺嘌呤。

当b1和b2不同并且x1和x2均是f时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是oh时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定义的or1时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定义的sh时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同，x1和x2均是f，并且z是如上文定义的sr1时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同并且x1和x2不同(即x1＝h和x2＝f或x1＝f和x1＝h)时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是oh时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定义的or1时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定义的sh时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

当b1和b2不同，x1和x2不同，并且z是如上文定义的sr1时是一个特定类别的如上文定义的式(i)的环状二核苷酸。

本发明的环状二核苷酸在体外在人细胞、动物细胞和人血中诱导i型干扰素和/或促炎细胞因子。这些环状二核苷酸的细胞因子诱导活性需要sting的存在，如人细胞或动物细胞中体外实验所证实的。

本发明的环状二核苷酸是受体sting的激动剂。

术语“激动剂”指在体外或在体内激活生物受体以诱发生理反应的任何物质。

“sting”是“干扰素基因刺激物”的缩写，其也称作“内质网干扰素刺激物(eris)”、“irf3激活中介物(mita)”、“mpys”或“跨膜蛋白173(tm173)”。sting是人类中由基因tmem173编码的跨膜受体蛋白。sting由环状二核苷酸(cdn)激活导致irf3途径和nf-κb途径的激活及后续导致分别诱导i型干扰素和促炎细胞因子。响应于病毒性感染，sting激活stat6(信号传导者和转录激活物6)以诱导(th2型)、增加(il-12)或减少(il-10)各种细胞因子(包括趋化因子ccl2、ccl20和ccl26)的产生(chen等人,2011)。

术语“sting激动剂”在本文中指在体外或在体内激活受体sting的物质。根据本发明，如果符合以下情况，则认为某化合物为sting激动剂：

-它在体外在含有活性sting的人细胞或动物细胞中诱导i型干扰素；并且

-它在体外在不含有活性sting的人细胞或动物细胞中不诱导i型干扰素。

确定某配体是否为sting激动剂的常见试验是在野生型人细胞系或动物细胞系中和已经通过碱基小缺失或长缺失以遗传方式失活sting编码基因的相应细胞系(例如纯合的sting敲除细胞系)中孵育配体。sting的激动剂将在野生型细胞中诱导i型干扰素，但是在sting编码基因已经失活的细胞中将不诱导i型干扰素。

本发明的环状二核苷酸在体外在含有活性sting的人细胞或动物细胞中诱导i型干扰素。然而，它们不在体外在不含有活性sting的人细胞或动物细胞中诱导i型干扰素。

本发明涉及氟化脱氧核糖-环状二核苷酸(cdn)。具体而言，它涉及(3’,3’)-2’(单氟化或双氟化)-2'-脱氧核糖-(cdn)。

其中x1和x2当中至少一者是氟原子，尤其x1和x2均是氟原子并且z是oh的式(i)、(ii)或(iii)环状二核苷酸在人细胞系和鼠细胞系中比其非氟化对应物诱导更多的i型干扰素和nf-κb活性。

如与其相应的非氟化cdn相比，其中x1和x2当中至少一者是氟原子，尤其x1和x2均是氟原子并且z是oh或sh的式(i)、(ii)和(iii)的环状二核苷酸在小鼠中静脉内注射后显示从血液消除较慢，即动力学清除过程较长，并且在体外显示出更大的抗酶剪切性。

环状二核苷酸的盐或前药形式

可药用盐包括从可药用无机或有机碱和酸衍生的那些盐。合适的盐包括衍生自碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁的那些，连同制药技术中熟知的许多其他酸。术语“可药用前药”指这样的化合物，其中所述化合物在宿主(即接受化合物的人类或动物受试者)中经代谢例如水解或氧化以形成本发明的化合物。前药的常见示例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不稳定保护基的化合物。前药包括可以氧化、还原、胺化、去胺化、羟化、去羟化、水解、去水化、烷基化、去烷基化、酰化、去乙酰化、磷酸化或去磷酸化以产生活性化合物的化合物。

可以施用本文所述的cdn前药以额外地增加活性、生物利用率或稳定性，或否则改变cdn单磷酸酯的特性。

多种cdn前药配体是已知的。通常而言，磷酸酯部分上的烷基化、酰化或其他亲脂修饰或使用核苷的其他类似物将增加核苷酸的稳定性。

可以代替在磷酸酯部分上一个或多个氢的取代基的示例是烷基、芳基、类固醇、糖，包括但不限于糖、1,2-二酰甘油和醇类。许多示例在(jones,1995)中描述。

本发明化合物的用途

本发明的另一个目的是用于人类或动物中治疗性疗法的式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸。

特别地，本发明的化合物可以用于人类或动物健康中的治疗性或诊断性应用。以下示例起到显示本发明的不同可能应用的作用；然而，这些示例不意在限制本发明的范围。

术语“治疗剂”指向人类或动物施用的一种或多种物质，其旨在人类或动物中实现某种治疗作用，包括旨在阻止、治愈或缓和感染或疾病的结果和/或否则旨在改善人类或动物的健康。

术语“单药疗法”指在任何临床或医疗情境下使用单一物质和/或策略治疗人类或动物，而与相同临床或医疗情境下使用多种物质和/或策略治疗人类或动物相反，无论多种物质和/或策略是否以任何顺序依次或同时使用。

术语“化疗药”在本文中指向人类或动物施用旨在杀伤肿瘤或减缓或终止肿瘤生长和/或减缓或终止癌细胞分裂和/或防止或减慢转移的一种或多种化学物质。经常施用化疗药以治疗癌症，但是还适用于其他疾病。

术语“化疗”指用一种或多种化疗药(参见上文定义)医学治疗人类或动物。

术语“化学免疫疗法”指化疗物质和/或策略和免疫疗法物质和/或策略的合并使用，无论是否以任何顺序依次或同时进行。化学免疫疗法经常用来治疗癌症，但是也可以用来治疗其他疾病。

术语“免疫系统”指涉及在身体内预防感染、在感染期间或疾病期间保护身体和/或辅助身体在感染或疾病后恢复的分子、物质(例如体液)、解剖结构(例如细胞、组织和器官)和生理过程的全体或其任一种或多种组分。“免疫系统”的完整定义超出本专利的范围；然而，这个术语应当由本领域的任何普通执业者理解。

术语“免疫介质”指可以与任一种或多种免疫系统组分相互作用的任何内源或外源物质。术语“免疫介质”包括抗体、抗原、疫苗及其构成组分、核酸、合成性药物、天然或合成性有机化合物、细胞因子、天然或修饰的细胞、其合成性类似物和/或其片段。

术语“免疫疗法”指其中人为调节人免疫系统或动物免疫系统的一种或多种组分以直接或间接实现某种治疗益处(包括全身性和/或局部效果和预防性和/或治愈性效果)的任何医学治疗。免疫治疗可以包括通过任何途径(例如口服、静脉内、皮肤、通过注射、通过吸入等)(无论是否为全身途径、局部途径或这两种途径)，单独或以任何组合施用一种或多种免疫介质(参见上文定义)至人类或动物受试者。“免疫治疗”可以包括激发、增加、减少、制止、阻止、阻断或否则调节细胞因子的产生，和/或激活或失活细胞因子或免疫细胞，和/或调节免疫细胞水平，和/或输送一种或多种治疗性或诊断性物质至身体内特定部位或至特定类型的细胞或组织，和/或摧毁特定细胞或组织。免疫治疗可以用来实现局部效果、全身性效果或二者的组合。

术语“免疫抑制”描述任何人类或动物受试者的状态，所述受试者的免疫系统在功能上削弱、失活或否则受损，或在所述受试者中一种或多种免疫组分在功能上削弱、失活或否则受损。“免疫抑制”可以是疾病、感染、衰竭、营养不良、医学治疗或某种其他生理或临床状态的原因、结果或副产物。

本文中同义使用的术语“免疫调节性物质”、“免疫调节物质”、“免疫调节剂”和“免疫调节剂”指施用至人类或动物时直接影响人类或动物免疫系统运行的任何物质。常见免疫调节剂的示例包括但不限于抗原、抗体和小分子药物。

术语“疫苗”指施用至人类或动物以激发或增强针对人类或动物中一种或多种抗原的特异性免疫系统应答和/或保护作用的生物学制品。

术语“接种”指用疫苗治疗人类或动物或指向人类或动物施用疫苗的行为。

术语“辅药”指与主要治疗性物质一起(或者以任何顺序依次或与其同时)施用以实现不能通过单独使用主要治疗性物质实现的某种互补性、协同性或其他有益作用的次要治疗性物质。辅药可以与疫苗、化疗或某种其他治疗性物质一起使用。辅药可以增强主要治疗性物质的功效、减少主要治疗性物质的毒性或副作用或向接受主要治疗性物质的受试者提供某种保护，如但不限于改善免疫系统的运行。

在一个实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸可以作为免疫疗法施用人类或动物，以体内诱导对人类或动物有治疗益处的一种或多种细胞因子的产生。这种类型的免疫治疗可以单独使用或与其他治疗策略组合使用，无论是否以任何顺序依次或同步使用。它可以用来防止、治愈、和/或缓和人类或动物中感染或疾病的影响，和/或用来调节人类或动物的免疫系统以实现某种其他治疗益处。

在一个具体实施方案中，本发明的环状二核苷酸可以用于免疫抑制的个体的细胞因子诱导免疫疗法。

在这个示例中，式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸将施用至免疫抑制的人类或动物受试者，以体内诱导直接或间接增强人类或动物免疫系统的一种或多种细胞因子的产生。可能从这种治疗中获益的受试者包括患有自体免疫疾病、免疫系统缺损或缺陷、微生物感染或病毒性感染、传染性疾病或癌症的那些。

本发明因此公开了一种在免疫抑制的个体中诱导细胞因子的方法，所述方法包括向有需要的患者施用式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸或其可药用盐或前药。

在另一个实施方案中，本发明的环状二核苷酸可以用于与化疗组合的细胞因子诱导免疫疗法。

在这个示例中，式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸将与一种或多种化疗药一起以任何顺序依次或同时施用至癌症患者，以终止患者中肿瘤的生长、使其收缩和/或摧毁之。因本发明化合物提供的细胞因子诱导和化疗药提供的细胞毒性组合产生的化学免疫疗法可能对患者的毒性较小，在患者中造成更少的副作用和/或比化疗药作为单药疗法使用时显示更大的抗肿瘤功效。

本发明因此公开一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用：

-化疗药；和

-式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸或其可药用盐或前药。

在另一个实施方案中，本发明的环状二核苷酸可以作为疫苗辅助疗法用于细胞因子诱导免疫疗法。

在这个示例中，式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸将施用至已经接受、正在接受或将要接受接种的人类或动物受试者。本发明提供的益处可能包括增强接种对靶抗原的功效，降低接种的毒性、减少接种的不良副作用或增强人类或动物受试者的免疫保护作用。

本发明的另一个目的是用于治疗细菌性感染、病毒性感染或癌症的式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸。

如本文所用，“癌症”指受试者中以细胞生长或死亡不受调节或失调节为特征的生理状况。术语“癌症”包括实体瘤和血液源肿瘤，无论是否为恶性或良性。

在优选的实施方案中，癌症从以下群组：膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌和尿路上皮癌。

在一个具体实施方案中，癌症是胰腺实体瘤。

本发明因此公开一种用于治疗细菌性感染、病毒性感染或癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用式(i)、(iii)或(iii)的环状二核苷酸或其可药用盐或前药。

本发明的另一个目的是用于治疗可以借助sting途径诱导免疫应答而减轻的病理学的式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸。

本发明的另一个目的是一种包含式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸和化疗药的组分套装，其用于治疗胰腺实体瘤。

术语“组分套装”在本文中指合用制品，其中对于通过同时施用或依次施用至患者用于合并治疗的有效成分在物理上分离。

因此，根据本发明，化疗药和环状二核苷酸或其可药用盐或前药以分离的形式同时、独立或依次地以任何顺序施用至患者，以治疗癌症。

在一个实施方案中，所述化疗药是吉西他滨。

合成环状二核苷酸的脱氧核苷

天然核苷2'-脱氧-腺苷(da)、2'-脱氧-鸟苷(dg)或2'-脱氧-肌苷(di)可以用于合成式(i)和(ii)的cdn。

用于式(ii)和(iii)的cdn的3’-脱氧-腺嘌呤、3’-脱氧-鸟苷或3’-脱氧-肌苷指具有糖部分(例如在3'位置经如此修饰从而羟基(3'-oh)由氢基团替换的核糖基部分或木糖基部分)的核苷单元。

合成cdn的氟取代的核苷

由于sting位于内质网并且检测细胞质中的环状二核苷酸，所以注定治疗性使用的任何sting激动剂必须能够渗入细胞。另外，化合物的更大细胞摄取量转换成更高的生物利用率，这是合乎临床使用需要的特性。在本发明中，设计氟化的化合物以探索以下可能性：一个或两个氟原子赋予的更大细胞摄取量将导致比不含有任何氟原子的参考化合物c-aimp更大的i型干扰素诱导活性。

在本发明中，我们令人惊讶地发现，作为sting激动剂，全部含有至少一个氟原子的主题cdn比其相应的非氟化类似物更有活性。具体而言，本发明的cdn在人类细胞、动物细胞和人血中比其相应的非氟化类似物显示出更大的sting依赖性细胞因子诱导活性。

药物在身体内酶促降解更迅速，其半寿期越短并且因此，其活性越小。因此，意图治疗性使用的化合物的合乎需要特性是抗酶降解性。存在体外酶促切割试验可以提供给定化合物抵抗常见酶的某种指示，所述的常见酶降解在结构上与正在测试的化合物类似的化合物。在我们工作中，我们非常惊讶发现了本发明主题cdn的又一个区别型特征：与它们的相应非氟化核糖-cdn相比，这些氟化脱氧核糖-cdn始终显示优越的蛇毒磷酸二酯酶(svpd)或核酸酶p1(np1)切割抗性。

单氟-核苷

式(i)和(ii)的cdn的腺苷、鸟苷或肌苷的2'-脱氧-2'-氟指在2'位置经如此修饰，从而羟基(2'-oh)由氟基团(2'-f)替换的核苷。

可以通过本领域已知的任何方法制备合成式(i)和(ii)的cdn的2'-氟核苷衍生物(参见，例如：(herdewijna,1989；thomas,1994)和(ross,1997))。

式(ii)和(iii)的cdn的腺苷、鸟苷或肌苷的3'-脱氧-3'-氟指在3'位置经如此修饰，从而羟基(3'-oh)由氟基团(3'-f)替换的核苷。

硫代磷酸酯核苷酸间键

硫代磷酸酯核苷酸间键指用p＝s基团替换p＝o基团，并且包括二硫代磷酸酯核苷间键。环状二核苷酸中存在的一个或两个核苷酸间键可以是硫代磷酸酯核苷酸间键。

可以将cdn的磷酸二酯键中的磷原子描述为具有“前手性”。一旦替换或修饰磷酸二酯键的非成键氧原子，则生成手性糖-磷酸酯键。所得到的糖间键是sp糖间键或rp糖间键。为获得硫代磷酸酯键，用硫原子替换天然磷酸二酯键中的非成键氧原子产生了手性中心并且因此提供sp和rp非对映异构体。其中糖主链中基本上全部磷原子为sp或rp的分子在本文中称作“手性纯的”。

环状二核苷酸由核酸酶和/或磷酸二酯酶以酶促方式降解(参见，例如：(li等人,2014)(diner等人,2013)(danilchanka和mekalanos,2013)(shanahan,gaffney,jones和strobel,2013)(simm,morr,kader,nimtz和romling,2004))，并且因此，当作为治疗剂使用时，这些化合物可以遭遇半寿期削弱。选择化合物cl655和cl656以使得最大半寿期成为可能，以及可能令活性在体内更高，因为它们含有硫代磷酸酯(也称作“p(s)”或“硫代磷酸酯”)核苷酸间键。使用这类键是酶促水解的已知规避策略(参见，例如：us2014/0205653a1)。比其磷酸二酯类似物更抵抗酶促水解的硫代磷酸酯化合物的示例是(2’,3’)c-g^sa^smp或(2’,3’)c-gamp(s)(invivogen目录代码：tlrl-scga；li,2014)。硫代磷酸酯键在磷原子上引入额外的手性中心，所述手性中心在每个硫代磷酸酯键产生非对映异构体对([rp]和[sp])。在本发明中，将cl655和cl656作为外消旋混合物获得并测试。

制备活性化合物的一般方案

简单制备本文公开的环状二核苷酸或其前药的方法可以如下文详述中那样制备或通过其他本领域技术人员已知的方法制备。本领域普通技术人员将理解，这些方案无论如何将不起限制作用并且可以作出细节的变化而不脱离本发明的精神和范围。

如本文所用和除非另有限定，术语“保护基”指与氧、氮或磷原子连接以防止该原子进一步反应或用于其他目的的化学官能团。氧和氮的多种类型保护基是有机合成领域技术人员已知的，并且例如在(wuts,greene和greene,2014)中描述。

通常，通过以下方式制备式(i)、(ii)或(iii)的环状二核苷酸或其前药：首先制备相应的核苷，随后准备5’-羟基，在2’位置或3’位置的官能团(oh)，并且如果需要，随后保护嘌呤碱基的环外胺。随后，将适当保护的核苷转化成相应的3’-磷酰亚胺、2’-磷酰亚胺、3’-h-膦酸酯或2’-h-膦酸酯，它们构成制备本文所述的环状二核苷酸的原料。

下文显示的反应方案适用于合成式i的cdn并且可以用于合成式(ii)和(iii)的cdn：

方案1是合成本发明活性化合物的非限制性示例，并且尤其是式(i)的cdn的合成方案，其中b1、b2、x1、x2和z如上文限定。str是三苯甲基衍生物，如二甲氧基三苯甲基(dmtr)，p是保护基，r2是烷基如异丙基，r3是保护基如氰基乙基，r4是保护基如烯丙基，并且x3是o或s。

方案2是合成本发明活性化合物的非限制性示例，并且尤其是式(i)的cdn的替代性合成方案，其中b1、b2、x1、x2和z如上文限定。str是三苯甲基衍生物，如二甲氧基三苯甲基(dmtr)，p是保护基，r2是烷基如异丙基，r4是保护基如氰基乙基，r5是保护基如烯丙基，并且x3是o或s。

制备式(i)和(ii)的cdn，通过首先制备适当保护的式(ia)的磷酰亚胺或式(if)的h-膦酸酯：

方案3是合成式(ia)的磷酰亚胺或式(if)的h-膦酸酯的非限制性示例，其中b2、yp、xp、r7、r8和str如上文限定。

可以通过首先制备适当保护的式(iv)的核苷，合成式(ia)的磷酰亚胺或式(if)的h-膦酸酯，其可以由本领域普通技术人员完成。首先，保护具有环外胺的碱基，并且随后同时地或选择性地保护3’-和5’-羟基。最终保护置换x2，当x2是羟基时使用保护基如tbdms或四氢吡喃(thp)。最后，切去在3’-和5’-羟基的保护基，并且随后用三苯甲基衍生物保护5’-羟基以产生式(iv)的核苷：

方案4是合成适当保护的式(iv)的核苷的非限制性示例，其中b2、x2、p和str如上文限定。r5和r6是保护基。

式(iva)的核苷可以通过chu,2002；rajagopalan,2003；schinazi,2004；vorbrüggen,2001中略述的方法制备。

附图简述

图1.细胞中的sting信号传导。sting由环状二核苷酸(cdn)激活导致irf3途径和nf-κb途径的激活及后续导致分别诱导i型干扰素和促炎细胞因子。

图2.thp1-dual^tm细胞培养物中的体外i型干扰素诱导活性：非氟化对氟化的环状二核苷酸。

图3.thp1-dual^tm细胞培养物中的体外nf-κb通路诱导作用：非氟化对氟化的环状二核苷酸。

图4.野生型b16细胞与sting敲除b16细胞中的体外i型干扰素诱导活性。它显示了在野生型b16细胞培养物(图左侧)或sting-敲除的b16细胞(图右侧)培养物中孵育24小时的非氟化环状二核苷酸对氟化环状二核苷酸的相对isg54活性(作为i型干扰素诱导作用的间接量度)。wt：野生型；sko：sting敲除(纯合)。

图5.野生型raw细胞与sting敲除raw细胞中的体外i型干扰素诱导活性。它显示了在野生型raw细胞培养物(图左侧)或sting-敲除的raw细胞(图右侧)培养物中孵育24小时的非氟化环状二核苷酸对氟化环状二核苷酸的相对isg54活性(作为i型干扰素诱导作用的间接量度)。wt：野生型；sko：sting敲除(纯合)。

图6：小鼠中环状二核苷酸的i型干扰素诱导活性。来自处理后4小时的小鼠的血清中i型干扰素诱导作用的测量。

图7.小鼠中环状二核苷酸的il-6诱导活性。来自处理后4小时的小鼠的血清中il-6诱导作用的测量。

图8.小鼠中环状二核苷酸的体内消除。处理的小鼠中环状二核苷酸的血浆浓度的时间变化。

图9.人全血中cdn的细胞因子诱导活性。

图10a-d.不同cdn随时间推移对svpd和np1酶切割作用的抗性，如通过hplc监测。就svpd(a)或np1(b)的抗性，将cl614和cl656与c-aimp比较。就svpd(c)或np1(d)的抗性，相对于c-gamp比较cl603和cl656。

图11.thp-1dual^tm细胞中与酶svpd和np1孵育之前和之后不同cdn的体外活性。

本发明将由以下非限制性实施例说明。

实施例

作为本发明代表的特定化合物按照以下实施例制备并且通过说明方式提供以辅助理解本发明。它们不应当解释成以任何方式限制在后续权利要求书中所述的本发明。本发明的化合物也可以用作后续实施例中的中间体以产生本发明的额外化合物。并不必然作出尝试以优化在任何反应中获得的产率。本领域技术人员将知道怎样通过反应时间、温度、溶剂、试剂和其他化学合成参数的例行变化增加这种产率。

本发明在显示用于合成cdn的制备性方法的实施例1中及在显示用于生物学评价这些cdn的方法的实施例2中进一步说明。本领域普通技术人员将理解，这些实施例无论如何不起限制作用并且可以作出细节的变化而不脱离本发明的精神和范围。

描述本发明中使用的术语是常用的并且是本领域技术人员已知的。如本文所用，以下缩略语具有所示的意思：

℃为摄氏度；a为腺苷；acn为乙腈；aq.为水质；cdcl3为氘化氯仿；c18为十八烷基碳链结合的二氧化硅；d为二重峰；da为脱氧腺苷；dd为二重峰的二重峰；di为脱氧肌苷；d2o为氧化氘；dca为二氯乙酸；dcm为二氯甲烷；dmso-d6为氘化二甲基亚砜；dmtrcl为4,4′-二甲氧基三苯甲基氯化物；equiv.为当量；es为电喷雾电离；et2o为二乙醚；etoac乙酸乙酯；etoh为乙醇；et3n·3hf为三乙胺三氟化氢；g为克；¹h为质子；h为小时；hz为赫兹；hplc为高效液相色谱；i为肌苷；ifn为干扰素；ifn-α为干扰素α；ifn-β为干扰素β；iproh为异丙醇；irf3为干扰素调节因子3；isg(或isg54)为干扰素刺激基因；isre为干扰素刺激反应元件；i.v.为静脉内；lc为液相色谱；m为多重峰；m为摩尔；m/z为质荷比；meoh为甲醇；mg为毫克；mgso4为硫酸镁；mhz为兆赫兹；min为分钟；ml(或ml)为毫升；mmol为毫摩尔；mol/l为摩尔/升；ms为质谱法；nahco3为碳酸氢钠；nahso3为硫代硫酸钠；nh4oh为氢氧化铵；nf-κb为活化型b细胞核因子κ-轻链增强子；nmr为核磁共振；pads为苯乙酰基二硫化物；ppm为百万分之一；ppts为对甲苯磺酸吡啶鎓；rt为室温；seap为分泌型胚碱性磷酸酶；s为单峰；sl为大单峰；t为三重峰；sko为纯合sting敲除；sting为干扰素基因刺激物；tbaf为四正丁基氟化铵；thf为四氢呋喃；tbdmscl为叔丁基二甲基氯硅烷；teaa为三乙基乙酸铵；tfa为三氟乙酸；tipscl2为1,3-二氯-1,1,3,3-四异丙基二硅氧烷；wt为野生型；μg为微克；μl(或μl)为微升；μm为微米；δ为化学位移。

购买适于合成核苷和核苷酸的无水溶剂和试剂并且在干燥氩气或氮气下使用无水技术操作。亚酰胺(amidite)偶联反应和环化在无水乙腈或吡啶中在干燥氩气或氮气下进行。无水吡啶中全部反应的原料通过从吡啶浓缩(3次)而干燥。使用二氯甲烷中的甲醇梯度，使用fluka高纯度级或merck9385级二氧化硅进行制备性硅胶快速色谱。在agilent1290uhplc系统上进行分析性lc/esms，所述系统连接至二极管阵列探测器(dad)agilent1260infinity和配备电喷雾电离源(esi)并受chemstation软件控制的agilent6130四极质谱仪。使用流量为300μl/分钟的10mm甲酸铵和乙腈梯度，lc系统配备aquitycshc1850×2.1mm1.7μm柱。uv检测波长是254nm。质谱仪以esi正模式和负模式运行。使用流量为60ml/分钟的10mm甲酸铵和乙腈梯度在sunfireprepc185μmobd30x150mm柱上，在254nm监测的waters制备性150qhplc系统上进行制备性hplc。在bruker300mhz(fourrier300)上在室温获得¹hnmr谱并且以ppm低磁场报告。在真空下250℃干燥商业供应的产品12小时后，使用分子筛(ms)商业核苷磷酰亚胺从chemgenes供应。

以下实施例起到说明本发明的作用。这些实施例无论如何不意在限制本发明范围。

实施例1：合成本发明的化合物

实施例1.a：制备磷酸三酯的一般方案：

将适当保护的磷酰亚胺或市售磷酰亚胺与无水acn一起共蒸发3次，并且将所产生的固体在分子筛存在下溶解于(0.1mol/l，2当量)的溶液中。向溶液添加烯丙醇(2当量)并且将所得到的混合物搅拌30分钟。

对于磷酸三酯键：

将癸烷中的叔丁基过氧化氢(5.5m，2当量)添加至混合物，将所述混合物搅拌40分钟。将溶液过滤并且用dcm洗涤分子筛。滤液在真空下浓缩。

对于硫代磷酸酯三酯键：

将混合物在真空下浓缩并且将残留物溶解于无水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5当量)内。将混合物在室温搅拌45分钟。将溶液过滤并且用dcm洗涤分子筛。滤液在真空下浓缩并且随acn共蒸发3次。

将残留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10当量)处理15分钟。借助添加meoh和吡啶猝灭反应。在真空下移除溶剂，并且使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化残留物。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.b：制备h-膦酸酯的一般方案：

将适当保护的磷酰亚胺或商业磷酰亚胺溶解于acn的溶液中。向溶液添加水(2当量)和吡啶tfa(1.2当量)，并且将混合物搅拌15分钟。随后，在真空下移除溶剂。将残留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10当量)处理15分钟。借助添加meoh和吡啶猝灭反应。在真空下移除溶剂，并且使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化残留物。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.c：合成二核苷酸的方案：

在分子筛存在下，向溶液中实施例1.a的化合物或适当保护的化合物的溶液(0.1mol/l，2当量)一次性添加适当保护的磷酰亚胺或商业磷酰亚胺。将混合物搅拌30分钟。

对于磷酸三酯键：

将癸烷中的叔丁基过氧化氢(5.5m，2当量)添加至混合物，将所述混合物搅拌40分钟。将溶液过滤并且用dcm洗涤分子筛。滤液在真空下浓缩。

对于硫代磷酸酯三酯键：

将混合物在真空下浓缩并且将残留物溶解于无水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5当量)内。将混合物在室温搅拌45分钟。将溶液过滤并且用dcm洗涤分子筛。滤液在真空下浓缩并且随acn共蒸发3次。

将残留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10当量)处理15分钟。通过添加meoh和吡啶猝灭反应。在真空下移除溶剂，并且使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化残留物。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.d：合成二核苷酸的备选方案：

在分子筛存在下，向(0.1mol/l，2当量)溶液中实施例1.b的化合物的溶液一次性添加适当保护的磷酰亚胺或商业磷酰亚胺。将混合物搅拌30分钟。

对于磷酸三酯键：

将癸烷中的叔丁基过氧化氢(5.5m，2当量)添加至混合物，将所述混合物搅拌40分钟。将溶液过滤并且用dcm洗涤分子筛。滤液在真空下浓缩。

对于硫代磷酸酯三酯键：

将混合物在真空下浓缩并且将残留物溶解于无水吡啶中的0.2mpads溶液(2.5当量)内。将混合物在室温搅拌45分钟。将溶液过滤并且用dcm洗涤分子筛。滤液在真空下浓缩并且随acn共蒸发3次。

将残留物在水存在下用dca/dcm溶液(3％)(10当量)处理15分钟。借助添加meoh和吡啶猝灭反应。在真空下移除溶剂，并且使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化残留物。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.e：移除烯丙基的方案：

向来自实施例1.c的二核苷酸在丙酮中的溶液添加碘化钠(10当量)，并且将所产生的悬液在回流下搅拌2小时。通过过滤收集所产生的无色沉淀物并且用冷丙酮洗涤。这种沉淀物具有高度吸湿性并且因此立即用于下一个程序中。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.f：移除烯丙基的备选方案：

向来自实施例1.c的二核苷酸在无水thf中的溶液添加n-甲基苯胺(3当量)和四(三苯基膦)钯(0)(0.2当量)。将所得到的悬液在室温搅拌15分钟。随后，在真空下移除溶剂并且将残留物随二乙醚一起粉碎。通过过滤收集所产生的无色沉淀物并且用冷二乙醚洗涤。使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化这种沉淀物。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.g：二核苷酸环化的方案：

将实施例1.e或1.f中获得的固体随无水吡啶并且随后随无水acn一起共蒸发3次。将残留物悬浮于thf中，并且向所产生的不均匀混合物连续添加n-甲基咪唑(10当量)和2,4,6-三异丙基苯磺酰氯(10当量)。将所产生的混合物在25℃搅拌3小时至36小时。随后，在真空下移除溶剂并将残留物随etoac一起粉碎。通过过滤收集所产生的无色沉淀物并且用冷etoac洗涤。这种沉淀物在不作任何进一步纯化的情况下用于下一个步骤中。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.h：二核苷酸环化的备选方案：

从实施例1.e或1.f中获得的固体随无水吡啶一起共蒸发3次。将残留物悬浮于无水吡啶中，并且向所得溶液添加1-(均三甲苯-2-磺酰)-3-硝基-1,2,4-三唑(msnt)(5当量)。将所产生的混合物在25℃搅拌3小时至18小时。随后，在真空下移除溶剂，并且将所产生的产物在不作任何进一步纯化的情况下用于下一个步骤中。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.i：二核苷酸环化的备选方案：

将实施例1.d中获得的固体或适当保护的化合物随无水吡啶一起共蒸发3次。将残留物悬浮于无水吡啶中，并且向所得溶液添加5,5-二甲基-2-氧代-2-氯-1,3,2-二氧磷杂环己烷(dmocp)(3当量)。将所产生的混合物在25℃搅拌3小时至18小时。

对于磷酸二酯键：

添加碘(1.3当量)和水(30当量)至混合物。在10分钟后，直接添加nahso3(0.15％)水溶液直至观察到完全褪色，并且随后添加nahco3水溶液。将水层用etoac/et2o的1:1(v/v)混合物提取3次。将有机层汇集，在mgso4上干燥，过滤并且随后在真空下浓缩。

对于硫代磷酸酯三酯键：

添加元素硫(5当量)。将混合物在室温搅拌45分钟。随后将混合物在真空下浓缩并且随甲苯一起共蒸发3次，在acn中沉淀以移除过量硫并浓缩至干燥。

残留物在不作任何进一步纯化的情况下用于下一个步骤中。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.j：环状二核苷酸去保护和纯化的方案：

将实施例1.g、1.h或1.i的受保护环状二核苷酸用etoh中的甲胺溶液(33％)处理，并且将所产生的混合物在50℃搅拌4小时。将反应混合物浓缩，并且将所产生的残留物真空干燥。将干燥的材料与et3n·3hf(25当量)混合并且在25℃搅拌6小时。向这种混合物添加1m甲酸铵缓冲溶液，并且将混合物在30℃至40℃剧烈搅拌10分钟。将所得到的沉淀物过滤，并且使用c18sunfire柱(19x150mm，5μm)和甲酸铵/acn作为洗脱液，对滤液进行制备性hplc。将含有所需化合物的级分汇总并冻干。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

实施例1.k：环状二核苷酸去保护和纯化的方案：

将实施例1.g、1.h或1.i的受保护环状二核苷酸用etoh中的甲胺溶液(33％)处理，并且将所产生的混合物在50℃搅拌4小时。将反应混合物浓缩，并且使用c18sunfire柱(19x150mm，5μm)和甲酸铵/acn作为洗脱液，对所产生的残留物进行制备性hplc。将含有所需化合物的级分汇总并冻干。通过lc-es/ms分析以[m-h]^-和/或[m+h]⁺时的离子证实化合物的结构。

使用与实施例1.b中所述相似的程序，从市售的腺苷磷酰亚胺制备中间体1，以提供6.20g(93％产率)中间体1。lc-ms：rt＝4.41分钟，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用与实施例1.d中所述相似的程序，从中间体1和市售的肌苷磷酰亚胺制备中间体2，以提供8.04g(68％产率)中间体2。lc-ms：rt＝5.22分钟，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用与实施例1.i中所述相似的程序，从中间体2制备中间体3，以提供8.04g(68％产率)中间体3。lc-ms：rt＝5.41分钟，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

向在无水吡啶(200ml)中的肌苷(10.0g，37.2mmol)溶液添加tipscl2(14.1g，44.7mmol)。将溶液在室温搅拌18小时。随后，通过添加meoh(50ml)猝灭反应并且在真空下移除溶剂。将残余物溶解于etoac中并且用饱和nahco3水溶液、水和盐水洗涤。将有机层在mgso4上干燥，过滤并且随后在真空下浓缩。使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化粗制化合物，以产生13.5g(70％产率)中间体4。lc-ms：rt＝5.32分钟，m/z＝511[m+h]⁺，m/z＝509[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)13.04(s,1h),8.10(s,1h),8.03(s,1h),5.99(s,1h),4.93(t,1h),4.50(d,1h),4.11(m,3h),1.83(m,4h),1.09(m,32h)。

向中间体4(5g，9.79mmol)在无水dcm(75ml)中的溶液添加3,4-二氢-2h-吡喃(24.7g，293.7mmol)和ppts(7.38g，29.37mmol)。将溶液在室温搅拌18小时。随后，通过饱和nahco3溶液猝灭反应。分离不同的层，并且将有机层用水和盐水洗涤，在mgso4上干燥，过滤并且随后在真空下浓缩。使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化粗制化合物，以产生4.71g(80％产率)中间体5。lc-ms：rt＝6.72分钟，m/z＝595[m+h]⁺，m/z＝593[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.89(d,1h),8.12(s,1h),8.09(s,1h),8.04(d,1h),6.05(d,1h),5.07(t,1h),4.76(m,1h),4.53(m,2h),4.40-4.05(m,5h),1.85-1.55(m,10h),1.04(m,32h)。

向中间体5(4.71g，7.92mmol)在thf(100ml)中的溶液添加硅胶上的tbaf(10.56g，15.84mmol)。将溶液在室温搅拌3小时。随后，过滤反应，用thf洗涤硅胶，并且在真空下浓缩滤液。使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化粗制化合物，以产生2.7g(96％产率)中间体6。lc-ms：rt＝4.32分钟，m/z＝353[m+h]⁺，m/z＝351[m-h]^-。

向中间体6(2.70g，7.66mmol)在无水吡啶(40ml)中的溶液逐滴添加dmtrcl(2.17g，6.42mmol)在dcm(5ml)中的溶液。将溶液置于室温2小时。随后，通过添加5％nahco3水溶液(110ml)猝灭反应，将水层用dcm提取3次。将有机层汇集并在mgso4上干燥，过滤并且随后在真空下浓缩。使用dcm/meoh中的1％吡啶作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化残余物，以产生4.78g(95％产率)中间体7。lc-ms：rt＝6.80分钟，m/z＝655[m+h]⁺，m/z＝653[m-h]^-。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.80(s,1h),8.02(s,1h),8.00(s,1h),7.71(m,2h),7.73(m,2h),7.24(m,9h),6.20(d,1h),5.07(t,1h),4.83(m,1h),4.35(m,2h),3.78(s,6h),3.45-3.30(m,4h),1.77-1.56(m,6h)。

向中间体7(4.78g，7.30mmol)在无水吡啶(40ml)中的溶液添加咪唑(1.29g，18.98mmol)和tbdmscl(1.43g，9.49mmol)，将反应在室温搅拌18小时。随后，用dcm(100ml)稀释反应，用饱和nahco3水溶液、水和盐水洗涤溶液。将有机层在mgso4上干燥，过滤并且随后在真空下浓缩。使用dcm/meoh中的1％吡啶作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化残余物，以产生5.12g(91％产率)中间体8。lc-ms：rt＝8.15分钟，m/z＝769[m+h]⁺，m/z＝767[m-h]^-。1hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)12.70(s,1h),8.02(s,1h),7.97(s,1h),7.40(m,2h),7.26(m,11h),6.09(d,1h),4.80(m,1h),4.36(m,1h),4.16(m,2h),3.72(s,6h),3.45-3.26(m,4h),1.61-1.37(m,8h),0.81(s,9h),0.09(dd,6h)。

将中间体8(4.93g，6.41mmol)溶解于znbr2(0.5m)在dcm/iproh(1/1)(40ml，19.3mmol)中的溶液中。将溶液在室温搅拌40分钟。用1nnahco3溶液中和反应。分离不同的层，并且将有机层用水和盐水洗涤，在mgso4上干燥，过滤并且随后在真空下浓缩。使用dcm/meoh作为洗脱液，通过硅胶柱色谱纯化残留物，以产生2.68g(90％产率)中间体9。lc-ms：rt＝6.22分钟，m/z＝467[m+h]⁺，m/z＝465[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体9和市售的腺苷磷酰亚胺制备中间体10，以产生1.9g(64％产率)中间体10。rt＝6.99分钟，m/z＝1068[m+h]⁺，m/z＝1066[m-h]^-。

向中间体10(1.9g，1.78mmol)在无水吡啶(20ml)中的溶液添加二苯基亚磷酸酯(1.25g，5.34mmol)。将反应在室温搅拌2小时。向反应添加0.1mteaa溶液(53ml，5.34mmol)。将反应在室温搅拌45分钟。随后，在真空下移除溶剂并将残留物溶解于dcm(100ml)中。将有机层用nahco3(5％)水溶液，水和盐水洗涤，在mgso4上干燥，过滤并且随后在真空下浓缩，以产生2.0g(99％产率)粗制中间体11。这种中间体在不作任何进一步纯化的情况下用于下一个步骤中。lc-ms：rt＝6.06分钟，m/z＝1132[m+h]⁺，m/z＝1130[m-h]^-。

将中间体11(2.0g，2.12mmol)用dca10％在dcm(50ml)中的溶液处理。将反应在室温搅拌2小时。随后，通过添加吡啶(17ml)中和反应。在真空下移除溶剂以产生2.2g(100％产率)粗制中间体12。这种中间体在不作任何进一步纯化的情况下用于下一个步骤中。lc-ms：rt＝7.38分钟，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用与实施例1.i中所述相似的程序，从中间体12制备中间体13，以提供1.73g(83％产率)中间体13。lc-ms：rt＝7.20分钟，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体9和市售的腺苷磷酰亚胺制备中间体14，以提供1.9g(60％产率)中间体14。rt＝7.08分钟，m/z＝1068[m+h]⁺，m/z＝1066[m-h]^-。

向中间体14(1.9g，1.78mmol)在无水吡啶(20ml)中的溶液添加二苯基亚磷酸酯(1.25g，5.34mmol)。将反应在室温搅拌2小时。向反应添加0.1mteaa溶液(53ml，5.34mmol)。将反应在室温搅拌45分钟。随后，在真空下移除溶剂并将残留物溶解于dcm(100ml)中。将有机层用nahco3(5％)水溶液，水和盐水洗涤，在mgso4上干燥，过滤并且随后在真空下浓缩，以产生2.0g(99％产率)粗制中间体15。这种中间体在不作任何进一步纯化的情况下用于下一个步骤中。lc-ms：rt＝6.11分钟，m/z＝1132[m+h]⁺，m/z＝1130[m-h]^-。

将中间体15(2.0g，1.76mmol)用dca10％在dcm(50ml，85.0mmol)中的溶液处理。将反应在室温搅拌2小时。随后，通过添加吡啶(17ml，177.0mmol)中和反应。在真空下移除溶剂以产生1.8g(100％产率)粗制中间体16。这种中间体在不作任何进一步纯化的情况下用于下一个步骤中。lc-ms：rt＝5.39分钟，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用与实施例1.i中所述相似的程序，从中间体16制备中间体17，以提供1.5g(75％产率)中间体17。lc-ms：rt＝5.41分钟，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用与实施例1.b中所述相似的程序，从市售的腺苷磷酰亚胺制备中间体18，以提供1.1g(94％产率)中间体18。lc-ms：rt＝4.47分钟，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用与实施例1.d中所述相似的程序，从中间体18和市售的肌苷磷酰亚胺制备中间体19，以提供410mg(44％产率)中间体19。rt＝4.70分钟，m/z＝1048[m+h]⁺，m/z＝1046[m-h]^-。

使用与实施例1.i中所述相似的程序，从中间体19制备中间体20，以提供364mg(89％产率)中间体20。lc-ms：rt＝5.66分钟，m/z＝1046[m+h]⁺，m/z＝1044[m-h]^-。

使用与实施例1.d中所述相似的程序，从中间体1和市售的肌苷磷酰亚胺制备中间体21，以提供1.05g(65％产率)中间体21。lc-ms：rt＝5.42和5.52分钟，m/z＝1064[m+h]⁺，m/z＝1062[m-h]^-。

使用与实施例1.i中所述相似的程序，从中间体21制备中间体22，以提供579mg(55％产率)中间体22。lc-ms：rt＝5.61和5.71分钟，m/z＝1078[m+h]⁺，m/z＝1076[m-h]^-。

使用与实施例1.a中所述相似的程序，从市售的2’-脱氧腺苷磷酰亚胺制备中间体23，以提供1.84g(95％产率)中间体23。lc-ms：rt＝4.31分钟，m/z＝529[m+h]⁺，m/z＝527[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体23和市售的2'-脱氧肌苷磷酰亚胺制备中间体24，以提供500mg(32％产率)中间体24。rt＝5.28分钟，m/z＝896[m+h]+，m/z＝894[m-h]-。

使用与实施例1.e中所述相似的程序，从中间体24制备中间体25，以提供390mg(83％产率)中间体25。lc-ms：rt＝3.35分钟，m/z＝856[m+h]⁺，m/z＝854[m-h]^-。

使用与实施例1.g中所述相似的程序，从中间体25制备中间体26，以提供0.38g(99％产率)中间体26。lc-ms：rt＝3.91分钟，m/z＝838[m+h]⁺，m/z＝836[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体23和市售的2’-脱氧-2’-氟肌苷磷酰亚胺制备中间体27，以提供3.16g(62％产率)中间体27。rt＝4.27分钟，m/z＝914[m+h]⁺，m/z＝912[m-h]^-。

使用与实施例1.e中所述相似的程序，从中间体27制备中间体28，以提供1.10g(69％产率)中间体28。lc-ms：rt＝3.52分钟，m/z＝874[m+h]⁺，m/z＝872[m-h]^-。

使用与实施例1.h中所述相似的程序，从中间体28制备中间体29，以提供1.01g(99％产率)中间体29。lc-ms：rt＝4.23和4.07分钟，m/z＝856[m+h]⁺，m/z＝854[m-h]^-。

使用与实施例1.a中所述相似的程序，从市售的2'-脱氧-2'-氟腺苷磷酰亚胺制备中间体30，以提供2.68g(85％产率)中间体30。lc-ms：rt＝4.50分钟，m/z＝547[m+h]⁺，m/z＝545[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体30和商业的2’-脱氧-2’-氟肌苷磷酰亚胺制备中间体31，以提供2.53g(55％产率)中间体31。rt＝4.39分钟，m/z＝932[m+h]⁺，m/z＝930[m-h]^-。

使用与实施例1.e中所述相似的程序，从中间体31制备中间体32，以提供4.4g(92％产率)中间体32。lc-ms：rt＝3.58和3.59分钟，m/z＝892[m+h]⁺，m/z＝891[m-h]^-。

使用与实施例1.g中所述相似的程序，从中间体32制备中间体33，以提供1.40g(99％产率)中间体33。lc-ms：rt＝4.21和4.42分钟，m/z＝874[m+h]⁺，m/z＝872[m-h]^-。

使用与实施例1.a中所述相似的程序，从市售的2'-脱氧-2'-氟腺苷磷酰亚胺制备中间体34，以提供647mg(55％产率)中间体34。lc-ms：rt＝5.06分钟，m/z＝563[m+h]⁺，m/z＝561[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体34和市售的2’-脱氧-2’-氟肌苷磷酰亚胺制备中间体35，以提供447mg(35％产率)中间体35。rt＝6.20分钟，m/z＝964[m+h]⁺，m/z＝962[m-h]^-。

使用与实施例1.e中所述相似的程序，从中间体35制备中间体36，以提供232mg(43％产率)中间体36。lc-ms：rt＝4.25和4.55分钟，m/z＝924[m+h]⁺，m/z＝922[m-h]^-。

使用与实施例1.g中所述相似的程序，从中间体36制备中间体37，以提供35mg(36％产率)中间体37。lc-ms：rt＝5.00和5.32分钟，m/z＝906[m+h]⁺，m/z＝904[m-h]^-。

使用与实施例1.b中所述相似的程序，从市售的腺苷2’-磷酰亚胺制备中间体38，以提供1.81g(95％产率)中间体38。lc-ms：rt＝4.53分钟，m/z＝550[m+h]⁺，m/z＝548[m-h]^-。

使用与实施例1.d中所述相似的程序，从中间体38和市售的2’-脱氧-2’-氟肌苷磷酰亚胺制备中间体39，以提供340mg(55％产率)中间体39。rt＝4.28分钟，m/z＝935[m+h]⁺，m/z＝933[m-h]^-。

使用与实施例1.i中所述相似的程序，从中间体39制备中间体40，以提供340mg(95％产率)中间体40。lc-ms：rt＝4.44分钟，m/z＝933[m+h]⁺，m/z＝931[m-h]^-。

使用与实施例1.a中所述相似的程序，从市售的2’-脱氧-2’-氟肌苷磷酰亚胺制备中间体41，以提供600mg(98％产率)中间体41。lc-ms：rt＝3.78分钟，m/z＝444[m+h]⁺，m/z＝442[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体41和市售的2’-脱氧-2’-氟肌苷磷酰亚胺制备中间体42，以提供610mg(55％产率)中间体42。rt＝5.50分钟，m/z＝829[m+h]⁺，m/z＝827[m-h]^-。

使用与实施例1.f中所述相似的程序，从中间体42制备中间体43，以提供580mg(90％产率)中间体43。lc-ms：rt＝3.40分钟，m/z＝789[m+h]⁺，m/z＝787[m-h]^-。

使用与实施例1.h中所述相似的程序，从中间体43制备中间体44，以提供500mg(99％产率)中间体44。lc-ms：rt＝3.86分钟，m/z＝771[m+h]⁺，m/z＝769[m-h]^-。

使用与实施例1.a中所述相似的程序，从市售的2’-脱氧-2’-氟鸟苷磷酰亚胺制备中间体45，以提供3.75g(60％产率)中间体45。lc-ms：rt＝4.25分钟，m/z＝529[m+h]⁺，m/z＝527[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体45和市售的2’-脱氧-2’-氟鸟苷磷酰亚胺制备中间体46，以提供1.07g(67％产率)中间体46。rt＝4.80分钟，m/z＝999[m+h]⁺，m/z＝997[m-h]^-。

使用与实施例1.f中所述相似的程序，从中间体46制备中间体47，以提供610mg(99％产率)中间体47。lc-ms：rt＝4.05分钟，m/z＝959[m+h]⁺，m/z＝957[m-h]^-。

使用与实施例1.h中所述相似的程序，从中间体47制备中间体48，以提供580mg(96％产率)中间体48。lc-ms：rt＝4.77分钟，m/z＝941[m+h]⁺，m/z＝939[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体45和市售的2'-脱氧-2'-氟腺苷磷酰亚胺制备中间体49，以提供4.96g(68％产率)中间体49。rt＝4.98分钟，m/z＝1017[m+h]⁺，m/z＝1015[m-h]^-。

使用与实施例1.e中所述相似的程序，从中间体47制备中间体50，以提供4.4g(92％产率)中间体50。lc-ms：rt＝4.36分钟，m/z＝977[m+h]⁺，m/z＝975[m-h]^-。

使用与实施例1.g中所述相似的程序，从中间体50制备中间体51，以提供4.30g(99％产率)中间体51。lc-ms：rt＝5.72分钟，m/z＝838[m+h]⁺，m/z＝836[m-h]^-。

使用与实施例1.a中所述相似的程序，从市售的2’-脱氧-2’-氟鸟苷磷酰亚胺制备中间体52，以提供632mg(50％产率)中间体52。lc-ms：rt＝5.86分钟，m/z＝545[m+h]⁺，m/z＝543[m-h]^-。

使用与实施例1.c中所述相似的程序，从中间体52和市售的2'-脱氧-2'-氟腺苷磷酰亚胺制备中间体53，以提供310mg(25％产率)中间体53。rt＝6.60分钟，m/z＝1049[m+h]⁺，m/z＝1047[m-h]^-。

使用与实施例1.e中所述相似的程序，从中间体53制备中间体54，以提供100mg(33％产率)中间体54。lc-ms：rt＝4.58和4.70分钟，m/z＝1009[m+h]⁺，m/z＝1007[m-h]^-。

使用与实施例1.g中所述相似的程序，从中间体54制备中间体55，以提供75mg(76％产率)中间体55。lc-ms：rt＝5.32和5.54分钟，m/z＝991[m+h]⁺，m/z＝989[m-h]^-。

中间体56：特戊酸碘甲酯

将特戊酸氯甲酯(1.0g，6.64mmol)在无水acn(15ml)中的溶液用碘化钠(1.9g，13.28mmol)处理。将混合物在室温在黑暗下搅拌过夜。随后在真空下移除溶剂并将残留物溶解于dcm中。将溶液用水、5％nahso3溶液和盐水洗涤。将有机层在mgso4上干燥，过滤并且在真空下浓缩以提供1.22g粗制中间体53，所述中间体在不作任何进一步纯化的情况下用于下一个步骤中。¹hnmr(cdcl3-d1,300mhz)δ(ppm)5.86(s,2h),1.12(s,9h)。

使用与实施例1.j中所述相似的程序，从中间体3制备实施例1.1，以提供2.4g(60％产率)实施例1.1。lc-ms：rt＝2.72分钟，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.34(s,1h),8.27(s,1h),8.10(s,1h),7.86(s,1h),5.94(s,2h),5.06-4.80(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

使用与实施例1.j中所述相似的程序，从中间体13制备实施例1.2，以提供22.5mg(21％产率)实施例1.2。lc-ms：rt＝2.46分钟，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.27(s,1h),8.15(s,1h),8.04(s,1h),7.88(s,1h),5.99(s,2h),4.95(m,2h),4.86(m,1h),4.42(m,4h),4.05(m,2h)。

使用与实施例1.j中所述相似的程序，从中间体17制备实施例1.3，以提供17.5mg(22％产率)实施例1.3。lc-ms：rt＝1.35分钟，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.44(s,1h),8.13(s,1h),8.08(s,1h),8.07(s,1h),6.20(d,1h),6.07(d,1h),5.22(m,1h),4.91(m,1h),4.79(m,2h),4.63(m,1h),4.56(m,1h),4.22(m,2h),4.07(m,2h)。

使用与实施例1.j中所述相似的程序，从中间体20制备实施例1.4，以提供50mg(19％产率)实施例1.4。lc-ms：rt＝1.53分钟，m/z＝660[m+h]⁺，m/z＝658[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.50(s,1h),8.14(s,1h),8.13(s,1h),8.09(s,1h),6.24(d,1h),6.08(s,1h),5.20(m,1h),4.83-4.73(m,2h),4.58(d,1h),4.40(m,2h),4.26(m,2h),4.04(m,2h)。

使用与实施例1.j中所述相似的程序，从中间体22制备实施例1.5，以提供7mg(20％产率)实施例1.5。lc-ms：rt＝3.45分钟，m/z＝692[m+h]⁺，m/z＝690[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.54(s,1h),8.37(s,1h),8.22(s,1h),7.97(s,1h),6.65(dd,1h),6.15(dd,1h),4.60-4.50(m,4h),4.45(m,4h),4.05(m,2h)。

使用与实施例1.k中所述相似的程序，从中间体26制备实施例1.6，以提供90mg(31％产率)实施例1.6。lc-ms：rt＝2.47分钟，m/z＝628[m+h]⁺，m/z＝626[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.37(s,1h),8.32(s,1h),8.13(s,1h),8.05(s,1h),7.26(sl,2h),6.28(m,2h),4.68(m,2h),4.08(m,2h),3.85(m,2h),2.83(m,2h)。

使用与实施例1.k中所述相似的程序，从中间体29制备实施例1.7，以提供40mg(21％产率)实施例1.7。lc-ms：rt＝1.97分钟，m/z＝646[m+h]⁺，m/z＝644[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.29(s,1h),8.12(s,1h),7.98(s,1h),7.88(s,1h),6.25(m,2h),5.54(m,1h),5.07(m,2h),4.37(m,4h),4.06(m,2h)。

使用与实施例1.k中所述相似的程序，从中间体33制备实施例1.8，以提供104mg(10％产率)实施例1.8。lc-ms：rt＝2.78分钟，m/z＝664[m+h]⁺，m/z＝662[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.37(s,1h),8.35(s,1h),8.14(s,1h),7.95(s,1h),6.23(m,2h),5.45(m,2h),5.39(m,1h),4.95(m,2h),4.50(m,2h),4.06(m,2h)。

使用与实施例1.k中所述相似的程序，从中间体37制备实施例1.9，以提供10mg(18％产率)实施例1.9。lc-ms：rt＝3.41分钟，m/z＝696[m+h]⁺，m/z＝694[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.55(s,1h),8.38(s,1h),8.20(s,1h),7.99(s,1h),6.63(dd,1h),6.15(dd,1h),5.16-4.95(m,4h),4.52(m,4h),4.07(m,2h)。

使用与实施例1.j中所述相似的程序，从中间体40制备实施例1.10，以提供50mg(19％产率)实施例1.10。lc-ms：rt＝2.25分钟，m/z＝662[m+h]⁺，m/z＝660[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.58(s,1h),8.35(s,1h),8.12(s,1h),7.97(s,1h),6.65(d,1h),6.16(d,1h),4.50(m,2h),5.15(m,2h),4.41(m,4h),4.02(m,1h),3.73(m,1h)。

使用与实施例1.k中所述相似的程序，从中间体44制备实施例1.11，以提供157mg(35％产率)实施例1.11。lc-ms：rt＝1.48分钟，m/z＝665[m+h]⁺，m/z＝663[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.34(s,2h),8.08(s,2h),7.85(s,2h),6.21(m,2h),5.66(m,1h),5.49(m,1h),5.20(m,2h),4.97(m,4h),4.06(m,2h)。

使用与实施例1.k中所述相似的程序，从中间体48制备实施例1.12，以提供15mg(5％产率)实施例1.12。lc-ms：rt＝1.58分钟，m/z＝695[m+h]⁺，m/z＝693[m-h]^-.1hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.70(s,2h),6.05(d,2h),5.06-4.05(m,8h),4.08(m,2h)。

使用与实施例1.k中所述相似的程序，从中间体51制备实施例1.13，以提供320mg(31％产率)实施例1.13。lc-ms：rt＝2.48分钟，m/z＝679[m+h]⁺，m/z＝677[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.17(s,1h),7.83(s,1h),7.63(s,1h),6.09(d,1h),5.94(d,1h),5.62(m,1h),5.50(m,1h),5.15(m,2h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

使用与实施例1.k中所述相似的程序，从中间体55制备实施例1.14，以提供15mg(28％产率)实施例1.14。lc-ms：rt＝2.66分钟，m/z＝711[m+h]⁺，m/z＝709[m-h]^-。¹hnmr(d2o,300mhz)δ(ppm)8.58(s,1h),8.35(s,1h),7.97(s,1h),6.65(d,1h),6.19(d,1h),4.94(d,1h),4.62-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h)。

向实施例1.14(7mg，9.85μmol)在水(200μl)中的溶液逐滴添加中间体56(19mg，79.0μmol)在丙酮(500μl)中的溶液。将混合物在黑暗下搅拌过夜。随后，将混合物用na2s2o3饱和溶液(15μl)中和并随后用水(10ml)稀释。水层用etoac(3x10ml)提取3次。将有机层汇集，在mgso4上干燥，过滤并且在真空下浓缩以提供4mg(45％产率)实施例1.15。lc-ms：rt＝4.11分钟，m/z＝907[m+h]⁺，m/z＝905[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.61(s,1h),8.37(s,1h),8.00(s,1h),6.70(d,1h),6.22(d,1h),4.70-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h),3.77(s,4h),1.20(s,18h)。

向实施例1.9(5mg，7.19μmol)在水(200μl)中的溶液逐滴添加中间体56(17mg，70μmol)在丙酮(500μl)中的溶液。将混合物在黑暗下搅拌过夜。随后，将混合物用na2s2o3饱和溶液(15μl)中和并随后用水(10ml)稀释。水层用etoac(3x10ml)提取3次。将有机层汇集，在mgso4上干燥，过滤并且在真空下浓缩以提供5mg(78％产率)实施例1.16。lc-ms：rt＝4.55分钟，m/z＝892[m+h]⁺，m/z＝890[m-h]^-。¹hnmr(dmso-d6,300mhz)δ(ppm)8.61(s,1h),8.37(s,1h),8.00(s,1h),6.70(d,1h),6.22(d,1h),4.70-4.50(m,4h),4.42(m,4h),4.03(m,2h),3.77(s,4h),1.20(s,18h)。

实施例2：生物学测定法

我们已经确定本发明的几种环状二核苷酸在人类或动物细胞中诱导多种细胞因子的产生。具体而言，这些环状二核苷酸诱导i型干扰素和/或促炎细胞因子的产生。本文报告一组代表性的这些环状二核苷酸的体外细胞因子诱导活性需要真核细胞受体干扰素基因刺激物(sting)的存在。

体外细胞因子诱导作用

已经通过使用不同报告细胞系展示了本发明中公开的非氟化环状二核苷酸对氟化环状二核苷酸的细胞因子诱导活性。下文解释细胞系和实验。

细胞系

全部细胞系均从invivogen获得。本文描述它们并提供其相应的invivogen目录代码。

thp1-dual^tm(invivogen目录代码：thpd-nfis)：通过稳定整合两个诱导型报道构建体，从人单核细胞系thp-1衍生这些细胞。它们使得同时研究sting的两个主要信号传导途径成为可能：通过监测分泌型胚碱性磷酸酶(seap)活性研究nf-κb途径；和通过评估分泌性萤光素酶(lucia)的活性研究irf途径。

当使用quanti-blue^tm(invivogen目录代码：rep-qb1)(在seap存在下变成紫/蓝色的seap检测试剂(通过测量620nm至655nm的光密度定量))和quanti-luc^tm(invivogen；目录代码：rep-qlc1)(测量萤光素酶表达以报告isg54表达(作为ifn-α/β产生的指示物)的发光酶测定法)时，在细胞培养上清液中可容易地测量两种报道蛋白。

luciaisg细胞系：以下两个细胞系各自在irf诱导型启动子控制下表达分泌型萤光素酶(lucia)报道基因。这种复合启动子包含与人isg54基因的最小启动子融合的五个ifn-刺激反应元件(isre)，所述最小启动子不响应于nf-κb途径或ap-1途径的激活物。因此，这些细胞使得基于萤光素酶(lucia)活性监测irf途径成为可能。在本发明中，对irf途径的监测用来测量主题环状二核苷酸的sting激动剂活性。

1.raw-lucia^tmisg(invivogen目录代码：rawl-isg)：这些细胞从鼠raw264.7巨噬细胞细胞系产生。

2.raw-lucia^tmisg-ko-sting(invivogen目录代码：rawl-kostg)：通过sting基因的稳定纯合敲除，从raw-lucia^tmisg54细胞系(见上文)产生这些细胞。

b16blue^tmisg54细胞系：以下两个细胞系各自在启动子下表达seap报道基因：i-isg54报道分子，其包含由多聚体isre增强的ifn诱导型isg54启动子。用干扰素或i型干扰素的或nf-κb途径的诱导物刺激这些细胞，触发i-isg54启动子的激活(和因此产生seap)或ifn-β最小启动子的激活(和因此产生tnf-α)。可以使用quanti-blue^tm(invivogen目录代码：rep-qb1)(在seap存在下变成紫/蓝色的试剂)，通过测量620nm至655nm的光密度，轻易测定上清液中seap的水平。

1.b16-blue^tmisg(invivogen目录代码：bb-ifnabg)：这些细胞从鼠b16f1黑色素瘤细胞株系衍生。使用quanti-blue^tm测量这些细胞中i型干扰素的产生。

2.b16-blue^tmisg-ko-sting(invivogen目录代码：bb-kostg)：这些细胞通过sting基因的稳定纯合敲除，从b16-blue^tmisg细胞系(见上文)产生这些细胞。使用quanti-blue^tm测量这些细胞中i型干扰素的产生。

hek-blue^tm细胞系：以下三个细胞系也用于cdn的生物学评价。

1.hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting：这些细胞从其中sting基因已经失活的hek-blue^tmifn-α/β细胞(invivogen目录代码：hkb-ifnab)衍生。hek-blue^tmifn-α/β细胞能够实现通过监测isgf3途径活化检测生物活性的人i型ifn。通过用人stat2基因和irf9基因稳定转染hek293细胞以获得有完整活性的i型ifn信号传导途径，产生这些细胞。该途径的其他基因(ifnar1、ifnar2、jak1、tyk2和stat1)天然地以足够量表达。细胞进一步用ifn-α/β诱导型isg54启动子控制下的seap报道基因转染。用人ifn-α或ifn-β刺激hek-blue^tmifn-α/β细胞激活了jak/stat/isgf3途径并随后诱导seap的产生。使用quanti-blue^tm测量这些细胞中i型干扰素的产生。

2.hek-blue^tmil-1r(invivogen目录代码：hkb-il1r)：hek-blue^tmil-1r细胞设计成通过监测nf-κb途径和ap-1途径活化检测生物活性的人和鼠il-1β。另外，这些细胞检测来自食蟹猴、犬和大鼠的生物活性il-1β。实际上，hek-blue^tmil-1r细胞可以检测il-1α和il-1β，因为这些细胞因子与相同受体il-1r结合。这些细胞从其中阻断tnf-α反应的hek-blue^tmil-1β细胞衍生(invivogen目录代码：hkb-il1b)。因此，hek-blue^tmil-1r细胞特异性反应于il-1。这些细胞内源地表达人il-1受体并且用鼠il-1受体稳定转染，令其对人il-1β和鼠il-1β非常敏感。hek-blue^tmil-1r细胞表达在融合于5个nf-κb结合位点和5个ap-1结合位点的ifn-β最小启动子控制下的seap报道基因。il-1β与hek-blue^tmil-1r细胞表面上il-1r的结合触发了导致nf-κb激活和seap后续产生的信号传导级联。使用quanti-blue^tm测量这些细胞中il-1β的产生。

3.hek-blue^tmtnf-α(invivogen目录代码：hkb-tnfdmyd)：hek-blue^tmtnf-α细胞能够实现通过监测nf-κb途径活化而检测生物活性的人和鼠tnf-α。通过用融合于5个nf-κb结合位点和5个ap-1结合位点的ifn-β最小启动子控制下的seap报道基因稳定转染hek293细胞，产生这些细胞。通过敲除myd88基因，进一步使其不响应于il-1β。用tnf-α刺激hek-blue^tmtnf-α细胞触发了nf-κb诱导型启动子的激活和seap的产生。使用quanti-blue^tm测量这些细胞中tnf-α的产生。

实验中il-6的定量

根据制造商的说明(r&dsystems)使用酶联免疫测定法(elisa)，定量白介素-6。

在细胞培养物中

在将不同细胞培养物分别与环状二核苷酸孵育的多个实验，环状二核苷酸诱导这些细胞中i型干扰素和/或促炎细胞因子的产生，如通过isg54(干扰素刺激基因)报道分子测定法间接地测定(fensterl,white,yamashita和sen,2008)。这些实验如下文描述那样进行。

实施例2.1：测量处理的细胞培养物中的细胞因子诱导

·所用的细胞因子报告细胞系：thp1-dual^tm

·受检的环状二核苷酸：cl609、cl614、cl656、cl647、cl629、cl626、cl603、cl632和cl633

·参考化合物：c-aimp(invivogen制造)、c-digmp(invivogen目录代码：tlrl-cdg)、c-diimp(invivogen目录代码：tlrl-cdi)和c-gamp(invivogen目录代码：tlrl-cga)

·评价的活性：i型ifn诱导作用和nf-κb途径诱导作用。

向平底96孔板的每个孔添加20μl环状二核苷酸溶液(无菌水中100μg/ml)，随后添加180μl单细胞株系悬液(thp1-dual^tm：大约100,000个细胞/孔)。将平板在37℃在5％co2下孵育18小时至24小时。使用根据制造商的说明制备及使用的quanti-luc^tm间接定量ifn-α/β的水平。使用根据制造商的说明制备及使用的quanti-blue^tm间接定量nf-κb活性。

图2和图3中显示来自这个实验的结果，所述结果揭示三个重要发现：首先，全部受检的环状二核苷酸均在thp1-dual^tm细胞中诱导i型干扰素(图2)；其次，它们全部在这些细胞中诱导nf-κb途径(图3)；并且最后，对于这两种活性，大部分的氟化环状二核苷酸比相应的参考化合物(c-aimp、c-digmp、c-diimp和c-gamp)更有活性。

细胞因子诱导活性呈sting依赖性

本发明中公开的环状二核苷酸在体外未在缺少受体sting的细胞上清液中诱导细胞因子产生。

在野生型(wt)报告细胞和纯合sting敲除(stingko)报告细胞各自与环状二核苷酸独立孵育18小时至24小时的实验中，环状二核苷酸在wt细胞中诱导i型干扰素产生，但在stingko细胞中未诱导。这项发现显示，环状二核苷酸在体外在细胞中的细胞因子诱导活性需要sting。这些实验如下文描述那样进行。

实施例2.2：在cdn处理的野生型细胞或sting敲除细胞中测量细胞因子诱导作用

·所用的细胞因子报告细胞系：b16-blue^tmisg和raw-lucia^tmisg

·受检的环状二核苷酸：cl609、cl614、cl656、cl647、cl629、cl626、cl603、cl632和cl633

·参考化合物：c-aimp(invivogen制造)、c-digmp(invivogen目录代码：tlrl-cdg)、c-diimp(invivogen目录代码：tlrl-cdi)和c-gamp(invivogen目录代码：tlrl-cga)

·所用的细胞系：raw-lucia^tmisg、raw-lucia^tmisg-ko-sting、b16-blue^tmisg和b16-blue^tmisg-ko-sting(取决于实验)。

这些实验如实施例2.1中所述那样进行。

图4和图5中显示来自这个实验的结果，所述结果揭示了三个重要发现。首先，每种受检的环状二核苷酸均在wtb16细胞(图4)和wtraw细胞(图5)中诱导i型干扰素产生。其次，这些化合物无一在sting敲除的b16细胞(图4)或sting敲除的raw细胞(图5)中显示出这种活性，因而这表明，这种活性需要sting的存在。最后，大部分的氟化环状二核苷酸比相应的参考化合物(c-aimp、c-digmp、c-diimp和c-gamp)更有活性。

体内细胞因子诱导作用

本发明中公开的环状二核苷酸在体内在小鼠中诱导细胞因子。

实施例2.3：在cdn处理的小鼠中测量细胞因子诱导作用

·评价的物种：小鼠

·受检的环状二核苷酸：cl604、cl606、cl609、cl611和cl614

·参考化合物：c-aimp和盐水。

·评价的细胞因子：ifn-α/β(使用rawisg54报告细胞)和il-6(依据elisa)。

将21只小鼠(swiss；雌性；平均年龄：8周)分成7个组，每组三只：一个组充当对照(盐水)并且其他六个组各自用环状二核苷酸(或者c-aimp、cl604、cl606、cl609、cl611或cl614)处理。在第7天，从全部小鼠采集基础细胞因子水平的血液样品并且贮存在-20℃直至分析。在第1天，通过静脉内(i.v.)注射，用200μl生理血清(含有0.9％nacl)或200μl环状二核苷酸(剂量：10mg/kg)在生理血清(含有0.9％nacl)中的溶液处理小鼠。在注射后4小时从小鼠采集血液样品并且随后贮存在-20℃直至分析。在来自血液样品的血清中测量细胞因子诱导作用。

图6和图7中显示来自这个实验的结果，所述结果揭示了两个重要发现：首先，在所示的剂量，在处理后4小时范围内，全部受检的环状二核苷酸(cl611例外)均在小鼠中强烈地诱导i型干扰素(图6)；并且其次，全部环状二核苷酸(cl611例外)均诱导il-6(图7)。

实施例2.4：测量cdn在小鼠中的体内消除

我们已经测量了本发明的代表性环状二核苷酸在小鼠中的体内消除。

·受检的环状二核苷酸：cl603、cl609、cl614、cl626和cl656

·参考化合物：c-aimp(invivogen制造)。

将30只小鼠(c57bl/6)分成六个组，每组5只。在每个组内部，用不同的环状二核苷酸(50mg/kg；静脉内推注)处理每只小鼠。每个组的小鼠在处理后的不同时间点处死：2分钟、5分钟、15分钟、30分钟或1小时。紧邻处死前，采集血液样品(500μl)。将血液样品采集于肝素管中，并且随后离心。将上清液(血浆)贮存在–20℃直至分析。在通过高效液相色谱法-质谱法(hlpc/ms)分析之前，血浆样品如下加工：

血浆：将每种样品用甲醇按比率1:4处理、振摇和过滤(0.22μm)。将1μl处理的样品上样到hplc/ms柱上。

使用以下hplc梯度(a：10mm甲酸铵；b：乙腈；总时间：6分钟)：100％a1分钟；随后4分钟内100％a至100％b；随后100％b1分钟。在不同的时间洗脱每种环状二核苷酸并且通过测量254nm处的吸光度进行检测。

图8中显示这个实验的结果，所述结果揭示，氟化环状二核苷酸在小鼠血液中比非氟化环状二核苷酸更长地保留。

实施例2.5：比较氟化cdn和非氟化cdn在体外在来自健康人供体的全血中诱导细胞因子的能力

·所用的报告细胞系：hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting、hek-blue^tmil-1r和hek-blue^tmtnf-α

·受检的主题cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受检的参比(非氟化)cdn：c-gamp、2’,3’-c-gamp、c-aimp和c-aimp(s)

·评价的活性：i型ifn诱导作用(hek-blue^tmifn-α/β-ko-sting)、il-1诱导作用(hek-blueil-1r)和tnf-α诱导作用(hek-bluetnf-α)。

人血样品的获得和处置

在圣迭戈血库(3636gatewaycenterave,suite100；sandiego,ca92102；美国；www.sandiegobloodbank.org)从健康供体获得20份人血样品。简而言之，在捐赠时通过静脉穿刺，将样品采集入肝素钠(绿盖)管，并且随后贮存在4℃直至取件。将管在采集日取件，转运期间在冰上贮存，并且随后在同一日与cdn一起检验。

人血样品的处理和检验

每份血液样品在rpmi培养基中稀释(1:1)并等分入按六个不同浓度(30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml和0.1μg/ml)含有每种cdn的96孔板(180μl孔)。将平板在37℃在co2培养箱中孵育18至20小时。次日，将上清液收集，转移入圆底96孔板的相应孔，并贮存在-80℃。在后续日，为三个受检的报告细胞系的每一个如下制备新的96孔板：添加来自先前平板(含有孵育的cdn和血浆)的10μl上清液至新报告细胞平板中的相应孔。随后，将含有热灭活血清的培养基中事先收获并计数的所需报告细胞系的180μl等分细胞添加至每个孔(大约50,000个细胞/孔)，并将平板孵育大约20小时。如先前所描述那样，使用quanti-blue^tm测定法测定所需的细胞因子诱导活性。简而言之，转移来自先前孵育的平板中的20μl上清液至新96孔板的相应孔，所述孔中事先已经添加180μlquanti-blue^tm试剂。

图9中总结了来自这个实验的结果，所述结果显示本发明的代表性氟化cdn和相关的参考cdn的三种细胞因子诱导活性(i型ifn、il-1和tnf-α)。所示值是受检的整个浓度范围(30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml和0.03μg/ml)内全部20名供体的总平均数。cdn的活性依据术语“有效浓度”(本文限定为在所示浓度产生至少0.5的seap强度值的cdn)从7个受检浓度的最低者(0.03μg/ml)至受检浓度的最高者(30μg/ml)表述。该图揭示了两个主要发现：首先，在受检浓度范围内，每一个受检cdn均诱导每种所评估的细胞因子；并且其次，对于每种细胞因子诱导活性，每种氟化cdn比其相应的非氟化类似物更有活性(cl603与c-gamp；cl614与c-aimp；以及cl656与c-aimp[s]比较)。

实施例2.6：比较氟化脱氧核糖-cdn和非氟化核糖-cdn的抗svpd或np1酶切割性，如通过uhplc-ms监测

·所用的酶：蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)

·受检的主题cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受检的参比(非氟化)cdn：c-gamp和c-aimp

·性能评价：抗酶切割性

我们将每种cdn与已知切割核酸和cdn的两种酶中任一者孵育，并且随后通过测量与cdn相对应的峰的面积降幅，观察随时间推移受uhplc降解的迹象(根据ms鉴定)。具体而言，我们评估了cdn对蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)的抗性，所述两种酶均可以通过切割磷酸二酯核苷酸键降解cdn。实验如下进行：

每种cdn(7μg)分别在37℃的水浴中与(21μl)任一种酶(含有0.6mmmgcl2的pbs缓冲液中的160μgsvpd；或含有2mmzncl2的30mm乙酸盐缓冲液[ph5.3]中的2.5munp1)的溶液或与水(作为对照)孵育。在0小时至120小时的各个时间点收集等分量的反应混合物，在100℃加热2分钟，并且随后在0℃冷冻。最后，将10μl每种等分试样直接上样至hplc(配备uv-检测器的agilent1290infinityuhplc；柱：watersacquityuplccshc181.7μm[2.1mmx50mm；流量：0.3ml/分钟]；在254nm检测；自动进样器温度：25℃)供分析。使用以下梯度：100％a(10mm甲酸铵水溶液)1分钟；随后经5分钟100％a至100％b(乙腈)。

通过以下方式计算在每个时间点cdn的吸光度百分数：母cdn相对应的峰面积除以色谱图中全部峰面积总和，并且随后乘以100。

图10a-d中显示来自这个实验的结果，所述结果揭示了两个重要发现：首先，本发明的氟化脱氧核糖-cdn比其相应的非氟化核糖-cdn类似物更抵抗任一种酶的酶降解作用(在图10a和图10b中将cl656或cl614与c-aimp比较，并且在图10c和图10d中将cl603或cl632与c-gamp比较)；其次；在本发明的氟化脱氧核糖-cdn当中，含有两个硫代磷酸酯二酯键(cl656和cl632)的那些比其含有两个磷酸二酯键的相应类似物(分别是cl614和cl603)具有更多svpd抗性。

实施例2.7：在氟化脱氧核糖-cdn和非氟化核糖-cdn暴露于svpd或np1之前和之后，比较这些cdn的体外活性

·所用的报告细胞系：thp1-dual^tm

·受检的主题cdn：cl603、cl632、cl614和cl656

·受检的参比(非氟化)cdn：c-gamp和c-aimp

·评价的活性：i型ifn诱导作用

在这个实验中，本发明的四种代表性氟化脱氧核糖-cdn(cl603、cl632、cl614和cl656)及其相应的非氟化核糖-cdn类似物(分别是c-gamp和c-aimp)就其抵抗两种已知的cdn切割酶：蛇毒磷酸二酯酶(svpd)和核酸酶p1(np1)的切割作用的相对稳定性进行比较。它如下文描述那样进行。

如实施例2.6中所述那样，将每种cdn(7μg)与svpd、np1或水(作为对照)在水浴中在37℃孵育2小时，并且随后在100℃孵育10分钟。将所得的溶液冷却至室温。随后如实施例2.1中所述，将等分量(20μl)的每种溶液分别与thp1-dual^tm细胞(180μl；浓度：100,000个细胞/孔)孵育。如上文解释，用quanti-luc^tm定量isg54表达(作为ifn-α/β产生的指示物)。

图11中显示来自这个实验的结果，所述结果揭示了两个重要发现：首先，与任一种酶孵育之前或与单一的水(对照)孵育后，全部cdn均在细胞中诱导isg54表达；并且其次，与任一种酶孵育后，与非氟化核糖-cdn相对应的溶液完全丧失这种活性，而与氟化脱氧核糖-cdn相对应的那些溶液极大保留这种活性。这些结果显示，氟化脱氧核糖-cdn比其相应的非氟化核糖-类似物更抵抗svpd或np1的酶促切割。

氟化脱氧-环状二核苷酸的类别效应

我们确定，与其相应非氟化核糖-cdn相比，本发明的氟化脱氧核糖-cdn令人惊讶地显示出独特、非显而易见和先前未报道的类别效应，所述类别效应可以用于涉及操作sting活性的治疗应用、诊断应用和研究应用。例如，氟化cdn更有活性，如我们已经在体外通过在不同细胞系中和在全血中测量细胞因子诱导作用而确定。另外，它们在体内消除得更缓慢，如我们已经在小鼠中测定。最后，它们显示出优越的抗酶切割性。

参考文献

专利参考文献：

1.us2015/0056224a1

2.us2014/0329889a1

3.wo2015/077354a1

4.wo2014/189805a1

非专利参考文献：

1.ablasser,a.,goldeck,m.,cavlar,t.,deimling,t.,witte,g.,rohl,i.,hornung,v.(2013).cgasproducesa2'-5'-linkedcyclicdinucleotidesecondmessengerthatactivatessting.nature,498(7454),380-384。

2.chen,h.,sun,h.,you,f.,sun,w.,zhou,x.,chen,l.,jiang,z.(2011).activationofstat6bystingiscriticalforantiviralinnateimmunity.cell,147(2),436-446。

3.chu,c.k.(2002).recentadvancesinnucleosides:chemistryandchemotherapy:elsevier。

4.danilchanka,o.和mekalanos,j.j.(2013).cyclicdinucleotidesandtheinnateimmuneresponse.cell,154(5),962-970。

5.diner,e.j.,burdette,d.l.,wilson,s.c.,monroe,k.m.,kellenberger,c.a.,hyodo,m.,vance,r.e.(2013).theinnateimmunednasensorcgasproducesanoncanonicalcyclicdinucleotidethatactivateshumansting.cellrep,3(5),1355-1361。

6.dubensky,t.w.,jr.,kanne,d.b.和leong,m.l.(2013).rationale,progressanddevelopmentofvaccinesutilizingsting-activatingcyclicdinucleotideadjuvants.theradvvaccines,1(4),131-143。

7.fensterl,v.,white,c.l.,yamashita,m.和sen,g.c.(2008).novelcharacteristicsofthefunctionandinductionofmurinep56familyproteins.jvirol,82(22),11045-11053。

8.gomelsky,m.(2011).camp,c-di-gmp,c-di-ampandnowcgmp:bacteriausethemall！molmicrobiol,79(3),562-565。

9.hecker,s.j.和erion,m.d.(2008).prodrugsofphosphatesandphosphonates.jmedchem,51(8),2328-2345。

10.herdewijna,p.v.a.a.a.k.l.(1989).synthesisofnucleosidesfluorinatedinthesugarmoiety.theapplicationofdiethylaminosulfurtrifluoridetothesynthesisoffluorinatednucleosides.nucleosidesandnucleotides,8(1),65-96。

11.jones,r.b.,n.(1995).nucleotideprodrugs.antiviralresearch,27(1-2),1-17。

12.li,l.,yin,q.,kuss,p.,maliga,z.,millan,j.l.,wu,h.和mitchison,t.j.(2014).hydrolysisof2'3'-cgampbyenpp1anddesignofnonhydrolyzableanalogs.natchembiol,10(12),1043-1048。

13.rajagopalan,p.b.,f.d；chu,c.k.；tennant,b.c；baldwin,b.h.(2003).antiviralnucleosides:chiralsynthesisandchemotherapy:elsevier。

14.rautio,j.,kumpulainen,h.,heimbach,t.,oliyai,r.,oh,d.,jarvinen,t.和savolainen,j.(2008).prodrugs:designandclinicalapplications.natrevdrugdiscov,7(3),255-270。

15.ross,b.s.s.,r.h.；sprankle,k.g.和vasquez,g.(1997).anefficientandscalablesynthesisofarabinosylguanineand2′-deoxy-2′-fluoro-guanosine.nucleosidesandnucleotides,16(7-9),1645-1647。

16.schinazi,r.f.l.d.c.(2004).frontiersinnucleosides&nucleicacids:ihlpress。

17.shanahan,c.a.,gaffney,b.l.,jones,r.a.和strobel,s.a.(2013).identificationofc-di-gmpderivativesresistanttoanealdomainphosphodiesterase.biochemistry,52(2),365-377。

18.simm,r.,morr,m.,kader,a.,nimtz,m.和romling,u.(2004).ggdefandealdomainsinverselyregulatecyclicdi-gmplevelsandtransitionfromsessilitytomotility.molmicrobiol,53(4),1123-1134。

19.thomas,h.j.,tiwaria,k.n.；claytona,s.j.；secristj.a.；&montgomeryj.a.(1994).synthesisandbiologicactivityofpurine2′-deoxy-2′-fluoro-ribonucleosides.nucleosidesandnucleotides,13(1-3),309-323。

20.vorbrüggen,h.和ruh-pohlenz,c..(2001).handbookofnucleosidesynthesis.newyork:wiley。

21.wuts,p.g.m.,greene,t.w.和greene,t.w.(2014).greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis(第五版).hoboken,newjersey:johnwiley&sons,inc。

22.zhang,x.,shi,h.,wu,j.,zhang,x.,sun,l.,chen,c.和chen,z.j.(2013).cyclicgmp-ampcontainingmixedphosphodiesterlinkagesisanendogenoushigh-affinityligandforsting.molcell,51(2),226-235。