技术领域本发明涉及一种融合蛋白，特别涉及CBLB502-Fc融合蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)在机体固有免疫和获得性免疫中发挥重要作用(AkiraS,TakedaK,KaishoT.[J].Natureimmunology,2001,2(8):675-80.)，目前在哺乳动物细胞中已经发现了13种TLR。TLRs通过特异性识别细菌、病毒等病原体相关模式分子，启动髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)依赖信号通路从而激活固有免疫(CPaulC,FaqiAS.[J].Reproductivetoxicology,2014,46(7):12-9.)，进一步引起炎症反应、抗病毒反应和免疫细胞的分化成熟，从而保护机体免受病原体的入侵。Toll样受体5(TLR5)是TLR家族成员之一，目前已知的唯一配体是沙门氏菌鞭毛蛋白。CBLB502的商品名为Entolimod，是由克利夫兰生物医药公司研究开发的来源于沙门氏菌鞭毛蛋白改构的多肽类药物，目前正在进行二期临床研究。经过结构优化设计后，CBLB502缺失了鞭毛蛋白具有高度免疫原性的中心球状结构域，包含了鞭毛蛋白N端和C端的功能结构域(YoonSI,KurnasovO,NatarajanV,etal.[J].Science,2012,335(6070):859-64.)。因此它比鞭毛蛋白具有更低的免疫原性，但保留了TLR5依赖的NF-κB诱导活性和抗辐射的能力(BurdelyaLG,KrivokrysenkoVI,TallantTC,etal.[J].Science,2008,320(5873):226-30.)。CBLB502能够有效地减少辐射引起的骨髓和胃肠道等组织的损伤，并且能促进其再生，是一种目前正在被研究开发的安全、有效的抗辐射药物。CBLB502对小鼠头部和颈部局部的上皮组织和粘膜组织具有良好的辐射防护作用，但其组织保护作用不会延伸至肿瘤(BurdelyaLG,GleibermanAS,ToshkovI,etal.[J].InternationalJournalofRadiationOncologyBiologyPhysics,2012,83(1):228-34.)。除了对辐射具有防护作用，CBLB502对于小鼠肾脏缺血再灌注损伤的组织具有非常有效地保护作用(FukuzawaN,PetroM,BaldwinWM,etal.[J].TheJournalofImmunology,2011,187(7):3831-9.)，并且可以缓解修复化学药物引起的骨髓和胃肠道损伤。另外有研究发现，CBLB502对于表达TLR5的肿瘤细胞具有直接细胞毒作用(CaiZ,SanchezA,ShiZ,etal.[J].Cancerresearch,2011,71(7):2466-75.)，并能通过激活固有免疫对肝转移癌产生抗肿瘤作用。因此可见随着研究得不断深入，CBLB502的应用前景十分广阔。目前，文献报道中的CBLB502均是原核表达(YoonSI,KurnasovO,NatarajanV,etal.[J].Science,2012,335(6070):859-64.)，其蛋白以包涵体形式表达，导致纯化工艺复杂且热源或内毒素不易除去。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，通过构建CBLB502与免疫球蛋白IgGFc融合的真核表达载体，在哺乳动物细胞系中表达纯化得到CBLB502-Fc融合蛋白，并进行初步生物活性实验，以克服CBLB502由原核表达的缺点，从而完成了本发明。本发明的目的在于提供以下方面：(1)CBLB502-Fc融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括CBLB502蛋白和免疫球蛋白Fc片段。(2)根据上述(1)所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核苷酸包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。(3)根据上述(1)或(2)所述的融合蛋白，其中，所述Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白或者它们的亚型。(4)根据上述(1)至(3)之一所述的融合蛋白，其中，所述Fc片段选自人免疫球蛋白IgG，优选IgG1。(5)根据上述(1)至(4)之一所述的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)获得编码CBLB502-Fc融合蛋白的核苷酸序列；2)构建CBLB502-Fc融合蛋白的表达载体；3)将构建的表达载体转染适宜宿主细胞；4)培养转染细胞，分离CBLB502-Fc融合蛋白。(6)根据上述(5)所述的制备方法，其中，CBLB502的正向扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，反向引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。(7)根据上述(5)或(6)所述的制备方法，其中，包含编码融合蛋白的核苷酸序列的表达载体为真核载体或原核载体，其中，所述真核载体优选哺乳动物细胞表达载体。(8)根据上述(6)至(7)之一所述的制备方法，其中，所述宿主细胞为真核细胞。(9)根据上述(5)至(8)之一所述的制备方法，其中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，优选CHO细胞。(10)根据上述(1)所述的融合蛋白用于辐射防护、缓解修复化学药物引起的骨髓和胃肠道损伤，以及抗肿瘤方面的用途。根据本发明提供的CBLB502-Fc融合蛋白及其制备方法，具有以下有益效果：(1)本发明通过构建CBLB502和IgGFc融合的真核表达载体，表达的蛋白拥有相应的生物学活性，可直接纯化得到较高纯度的目的蛋白，极大简化了蛋白纯化工艺；(2)融合Fc片段后增大了目的蛋白分子量，从而降低肾清除率，并且在新生免疫球蛋白Fc受体(FcRn)的保护下，延长了融合蛋白的血浆半衰期；(3)融合蛋白可以通过二硫键形成稳定的二聚体或多聚体，能够提高蛋白分子的稳定性；(4)本发明中获得的融合蛋白活性高，在辐射防护等方面具有极大应用前景。附图说明图1示出PCR扩增CBLB502基因序列电泳图；图2示出pcDNA3.1-CBLB502-Fc重组质粒的酶切鉴定；图3示出CHO-S/pcDNA3.1-CBLB502-Fc转基因细胞中融合蛋白的表达；图4示出ProteinA纯化CBLB502-Fc融合蛋白的洗脱峰；图5示出纯化的CBLB502-Fc融合蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定；图6示出CBLB502-Fc对γ射线全身照射后小鼠存活率的影响；图7示出CBLB502-Fc对JNK的磷酸化水平。具体实施方式下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。目前，文献报道中的CBLB502均是原核表达，其蛋白以包涵体形式表达，包涵体的复性已经成为制约生物制药发展的瓶颈，处理过程包括：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容庞杂，导致纯化工艺十分复杂。本发明的目的是通过构建CBLB502-Fc融合蛋白的真核表达载体，转染宿主细胞，纯化得到具有生物活性的目的蛋白，减低制备工艺的复杂性。本发明中CBLB502-Fc融合蛋白包括CBLB502蛋白和免疫球蛋白Fc片段，其中，Fc片段选自人或动物的免疫球蛋白或者它们的亚型，优选人免疫球蛋白IgG，更优选IgG1。融合蛋白包括SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核苷酸包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本发明中所述Fc指免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fc片段可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。已知免疫球蛋白有IgA、IgD、IgE、IgM和IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，本领域技术人员可从特定免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区。CBLB502与免疫球蛋白Fc融合，可选择多种连接序列，例如可以选择长度约为20个氨基酸残基，也可选择CBLB502与免疫球蛋白Fc的铰链区直接融合，制备的融合蛋白Fc序列位于CBLB502氨基端。本发明中将CBLB502与IgFc片段进行融合，主要考虑到以下几点：首先，Fc片段能够特异性结合到ProteinA亲和柱，可直接纯化得到较高纯度的目的蛋白，简化融合蛋白的纯化步骤；其次，融合Fc片段可以增大蛋白分子量，从而降低肾清除率，并且在FcRn的保护下，Fc融合蛋白可以延长其血浆半衰期；再次，Fc融合蛋白可以通过二硫键形成稳定的二聚体，能够提高蛋白分子的稳定性；最后，蛋白融合Fc片段能够提高其在哺乳动物细胞内的表达。本发明构建了CBLB502与免疫球蛋白Fc片段融合蛋白的真核表达载体。在一优选实施方式中，用限制性内切酶AvrII、BamHI双酶切pUC57-CBLB502和pUC57-Fc，用T4DNA连接酶连接，得到pUC57-CBLB502-Fc，用限制性内切酶EcoRV、HindIII双酶切真核载体pcDNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc，将CBLB502-Fc克隆至pcDNA3.1载体，构建pcDNA3.1-CBLB502-Fc真核质粒。用真核表达载体转染真核细胞，表达得到具有生物活性的蛋白。本发明的另一目的是提供CBLB502-Fc融合蛋白的制备方法，即通过获得编码CBLB502-Fc融合蛋白的核苷酸序列，构建CBLB502-Fc融合蛋白的表达载体，将构建的表达载体转染适宜宿主细胞，培养转染细胞，分离得到具有生物活性的CBLB502-Fc融合蛋白。在一优选实施方式中，根据已知CBLB502基因序列设计扩增引物502F和502R，以合成的pUC57-CBLB502质粒为模板，利用DNA聚合酶PCR扩增出CBLB502基因片段。其中，CBLB502蛋白对应的全长核苷酸序列以pUC57-CBLB502质粒的形式提供，PCR扩增引物502F和502R的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。在一优选实施方式中，用限制性内切酶AvrII、BamHI双酶切目的基因片段和pUC57-Fc，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，切胶后回收目的片段。酶切后的PCR产物与载体用DNA连接酶连接后转化感受态大肠杆菌，挑选阳性单克隆至氨苄青霉素抗性的LB培养基，培养后取菌液进行PCR验证并送测序。其中，正向引物P57YF核苷酸序列为5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3’，反向引物P57YR核苷酸序列为5’-GCAGGACAGGGAGGACAAGTG-3’，PCR反应体系如表1所示。菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。测序方法采用双脱氧链终止法。表1PCR反应体系菌液1μLP57YF1μLP57YR1μL2×TaqPCRMasterMix10μLddH2O7μL在一优选实施方式中，用限制性内切酶EcoRV、HindIII双酶切真核载体(优选pcDNA3.1)和pUC57-CBLB502-Fc，将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆并测序。将重组质粒转染至宿主细胞，优选真核细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，用遗传霉素G418加压筛选培养，后将细胞转移至无血清培养基中培养。收集细胞培养上清，稀释后进行ELISA法检测细胞蛋白表达水平，筛选高表达细胞系。采用免疫印迹鉴定表达情况，ProteinA亲和柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE鉴定目的蛋白，用小鼠辐射试验和JNK激活试验验证目的蛋白的生物学活性。本发明中制备的CBLB502-Fc融合蛋白在对全身辐射的小鼠存活率实验中体现出了优良的防辐射能力，表明CBLB502与Fc融合后，其抗辐射功能不受影响，且该融合蛋白能够激活JNK，显著提高其磷酸化水平，确定了融合蛋白制备方法的可行性。在融合蛋白的制备过程中，Fc片段能够特异性结合到ProteinA亲和柱，可直接纯化得到较高纯度的目的蛋白，简化了融合蛋白的纯化步骤。实施例实施例中，所用试剂来源如下：SPF级C57BL/6雌性小鼠24只，6周龄，购自军事医学科学院实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK-(军)2012-0004；A549细胞为本实验室保存；CBLB502蛋白对应的全长核苷酸序列由金斯瑞公司合成，以pUC57-CBLB502质粒的形式提供；pUC57-Fc质粒由本实验室构建保存；pcDNA3.1质粒购自美国Invitrogen公司；KODFXDNA聚合酶、dNTP、2×PCR缓冲液购自日本TOYOBO公司；引物502F、502R、P57YF和P57YR，由美国Invitrogen公司设计合成；琼脂糖购自美国Amresco公司；DNA胶回收试剂盒、DNAmarkerIII购自北京天根生化科技公司；T4DNA连接酶以及限制性内切酶AvrII、BamHI、EcoRV、HindIII购自美国NEB公司；DNA上样缓冲液、2×TaqMasterMix、TNF-α购自近岸蛋白质科技有限公司；Lipofectamine2000脂质体转染试剂购自美国Invitrogen公司；遗传霉素G418购自德国Merck公司；CDFortiCHO培养基购自美国Gibco公司；Proteinaseinhibitor(PI)、PVDF膜购自瑞士Roche公司；Proteinphosphataseinhibitor(PPI)购自北京博迈德生物技术有限公司；山羊抗人IgG/HRP、山羊抗兔HRP、山羊抗小鼠HRP、Anti-GAPDH抗体购自中杉金桥公司；硅藻土购自北京中原公司；ProteinA填料、DEAE-Sepharose柱填料、Q-SepharoseHP柱填料购自美国GE公司；PierceTMBCA蛋白检测试剂盒、PageRulerTMPlus预染蛋白Marker购自美国Thermo公司；Enlight化学发光试剂购自北京英格恩生物科技公司；考马斯亮蓝G250快速染色试剂购自北京索莱宝科技公司；Anti-Phospho-JNK、Anti-JNK购自英国Abcam公司。实施例1CBLB502基因的扩增根据CBLB502基因序列设计引物502F和502R，以载体pUC57-CBLB502为模板，利用DNA聚合酶PCR扩增得到目的基因片段。其中，502F的碱基序列(5’-3’)为GATATCCCTAGGCCACCATGGAA，酶切位点为AvrII、EcoRV；502R的碱基序列(5’-3’)为GGATCCCAGCAGGCTCAGGACG，酶切位点为BamHI。PCR反应体系(50μL)包括：40ng模板DNA样品，1.5μL正向引物组502F(0.3μM)，1.5μL反向引物组502R(0.3μM)，25μL2×PCR缓冲液，10μLdNTP(2mM)，1μLKODFXDNA聚合酶(1U)，ddH2O补充至50μL。PCR反应条件包括：94℃预变性2min，98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环，然后68℃延伸7min。将PCR扩增所得产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，并用DNA胶回收试剂盒纯化1000bp的扩增片段，与预期大小一致，如图1所示，M表示DNAmarker，1表示pUC57-CBLB502PCR扩增产物。实施例2pUC57-CBLB502-Fc质粒的构建及鉴定限制性内切酶AvrII、BamHI双酶切目的基因片段和pUC57-Fc，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，切胶后用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。用T4DNA连接酶连接后转化感受态大肠杆菌，挑选阳性单克隆，用引物P57YF、P57YR验证并测序。所述P57YF的碱基序列(5’-3’)为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC，P57YR的碱基序列(5’-3’)为GCAGGACAGGGAGGACAAGTG。阳性菌落鉴定方法为：挑选阳性单克隆至氨苄青霉素抗性的LB培养基，37℃恒温摇床摇菌6h，取菌液进行PCR验证。PCR反应体系(20μL)：1μL菌液，1μLP57YF，1μLP57YR，10μL2×TaqMasterMix，7μLddH2O。PCR反应条件包括：94℃预变性90s，94℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸90s，30个循环，然后72℃延伸5min。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳验证。取验证正确的菌液样品送去Invitrogen公司进行测序，测序方法为双脱氧链终止法。实施例3pcDNA3.1-CBLB502-Fc质粒的构建及鉴定用限制性内切酶EcoRV、HindIII双酶切pcDNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc，将酶切后得到的CBLB502-Fc基因片段克隆至载体，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性单克隆，用酶切验证并送测序，将构建的质粒命名为pcDNA3.1-CBLB502-Fc。约在1800bp处可见CBLB502-Fc特异性条带，如图2所示，与预期结果一致。将获得的重组质粒测序，测序结果正确，pcDNA3.1-CBLB502-Fc质粒构建成功。实施例4pcDNA3.1-CBLB502-Fc质粒转染CHO-S细胞及阳性克隆的筛选和验证采用Lipofectamine2000脂质体转染试剂盒，参照说明书将pcDNA3.1-CBLB502-Fc质粒转染CHO-S细胞，同时设置阴性对照组(只加入等量的脂质体试剂的CHO-S细胞)。转染48h后，用800μg/mL遗传霉素G418加压筛选培养2周，阴性对照组的细胞全部死亡。改用含400μg/mL遗传霉素G418的培养基继续培养2周。2周后，当细胞培养成团状，将其用胰酶消化并进行细胞计数，稀释细胞密度至8个/mL，96孔板每孔加入100μL细胞稀释液，继续培养2周后，将形成细胞克隆的培养基换成CDFortiCHO无血清培养基。24h后收集细胞培养上清，稀释后进行ELISA法检测细胞蛋白表达水平，挑选高表达细胞株。最终筛选得到2株高表达细胞株(OD405＞1.2)，如表2所示。表2细胞培养上清的ELISA检测结果编号OD405编号OD4051D40.8644D20.6421F61.0794E101.2731G120.5224F51.4712B10.1634G70.1442E70.5334G120.4643A60.3394H20.6313A111.1054H40.6673C70.9525B90.5833D11.0845E110.7143G50.8135G60.5263G110.5815G80.2344B90.178取编号为4F5的细胞培养上清，并以转染pcDNA3.1空载体的细胞培养上清作为阴性对照，进行免疫印迹检测验证(WesternBlot)。经10％SDS-PAGE蛋白电泳后，取下凝胶，用低温湿法转膜100V恒定电压90min，将蛋白质转印到PVDF膜上，5％脱脂奶粉的PBST溶液室温摇床封闭1h，PBST洗膜3次，用山羊抗人IgG/HRP(1：5000稀释)室温孵育1h，PBST洗膜3次，化学发光试剂进行显影，UVP凝胶成像系统进行成像拍照。显影结果显示，高表达细胞株培养上清在70kDa左右产生特异性条带，与预期分子量大小一致，如图3所示，其中，1表示pcDNA3.1空载体转染细胞的培养上清，2表示高表达细胞的培养上清。实施例5CBLB502-Fc融合蛋白的纯化及SDS-PAGE鉴定将筛选出的细胞株摇瓶扩大培养，收集培养上清，将培养上清用硅藻土混合，吸附细胞碎片和其他杂质，用0.22μm滤膜过滤去除硅藻土与细胞碎片。用5倍柱体积的结合缓冲液(22.5mmol/LNa2HPO4，2.5mmol/LNaH2PO4，0.5mol/LNaCl，pH7.6)处理ProteinA亲和柱，再将处理过的培养上清进行上样。上样完毕后，用平衡缓冲液(17.5mmol/LNa2HPO4，2.5mmol/LNaH2PO4，0.3mol/LNaCl，pH7.4)冲洗杂蛋白至基线，然后用洗脱液(0.5mol/LL-Arginine-HCl，0.9％NaCl，0.5％Tween-80，pH3.0)洗脱蛋白，洗脱峰如图4所示，最高紫外吸光值为1840mAu，用饱和精氨酸调节pH至7.0，保存于4℃。用BCA蛋白检测试剂盒测定洗脱蛋白的浓度。取样品加入6×上样缓冲液，95℃变性5min，以10％SDS-PAGE进行蛋白凝胶电泳，使用考马斯亮蓝G250快速染色试剂进行染色，凝胶成像仪拍照。结果表明，在55kDa至100kDa之间出现一条弥散的目的条带，如图5所示，其中，M表示蛋白marker；1表示纯化的CBLB502-Fc融合蛋白。纯化得到的CBLB502-Fc融合蛋白分子量大于理论分子量59kDa，这种情况主要是由于CBLB502存在着多个糖基化修饰位点，进行真核表达后，修饰的糖链增加了其分子量。实施例6小鼠辐射实验验证CBLB502-Fc的抗辐射作用24只C57BL/6雌性小鼠随机分为生理盐水组(Control)、CBLB502组和CBLB502-Fc组，每组8只。在照射前30min，生理盐水组、CBLB502组和CBLB502-Fc组腹腔注射给药，分别注射生理盐水、CBLB502蛋白0.2mg/kg、CBLB502-Fc融合蛋白0.4mg/kg，给药体积为100μL。小鼠采用军事医学科学院放射与辐射医学研究所60Coγ射线8.0Gy一次全身照射，照射剂量率为188.88cGy/min。照射后，对小鼠进行为期30天存活情况的观察。CBLB502-Fc对8.0Gy60Coγ射线全身照射后小鼠存活率的影响如图6所示，其中，生理盐水组小鼠在照后10d全部死亡，30d后存活率为0，CBLB502组小鼠全部存活，30d后存活率为100％，CBLB502-Fc组小鼠在22d和23d各死亡1只，30d后存活率为75％。实验结果显示，CBLB502组与CBLB502-Fc组存活率较生理盐水组有显著提高(P＜0.05)，而CBLB502-Fc组与CBLB502组之间无显著性差异(P＞0.05)，说明CBLB502与IgGFc融合后依然具有抗辐射的作用，并不影响其生物学活性。本实施例中所用CBLB502蛋白为原核细胞表达并纯化处理后的CBLB502蛋白，其制备方法包括如下步骤：将CBLB502的菌种解冻，取10mL涂布于氨苄青霉素抗性的LB平板上，于30℃条件下培养48h产生单菌落。挑取单一菌落接入50mL氨苄青霉素抗性的LB培养基中，于30℃条件下，200rpm摇床培养16h，以此为一级种子液。将一级种子按1％接种量接到200mL氨苄青霉素抗性的YT培养基中，于30℃条件下，200rpm摇床培养10h，以此为二级种子液。将二级种子液接种于发酵罐进行培养，调整发酵罐控制器参数：pH为7，温度为30℃，转速为600rpm，溶氧为30％-50％，参数状态均为Auto。发酵结束后立即离心，收集沉淀物，称量沉淀物重量。按每克沉淀物加入10mL蒸馏水重悬，置冰浴中充分搅拌，600W冰浴超声30min。将超声破碎且离心沉淀得到的粗制包涵体用ddH2O充分洗涤，充分漩涡震荡后，于4℃，10000rpm离心15min，弃上清，重复洗涤一次。用含20mmol/LTris-HCl和0.25mol/L尿素的洗涤液(pH6.8)洗涤包涵体沉淀，充分漩涡震荡重悬沉淀，4℃，10000rpm离心5min，彻底弃去上清，重复洗涤一次。用含20mmol/LTris-HCl和6mol/L尿素的洗脱液(pH6.8)溶解包涵体，用ddH2O将尿素浓度缓慢稀释到2mol/L，室温搅拌溶解2-3h，于4℃，10000rpm离心15min。将包涵体溶解液用滤膜过滤后进行DEAE-Sepharose柱进行蛋白初步纯化，再使用Q-SepharoseHP柱进行精纯化。实施例7CBLB502-Fc对JNK的激活将经过饥饿处理的4瓶生长密度约为80％的A549细胞分别使用不含药物、含20ng/mL的TNF-α、10μg/mLCBLB502(原核表达)、20μg/mLCBLB502-Fc(真核表达)的无血清培养基刺激20min，再使用无菌PBS清洗一遍细胞后，每瓶细胞瓶中加入1mL含PI和PPI的RIPA细胞裂解液，冰上使用细胞刮刀将细胞刮至细胞瓶底部，将细胞裂解液转移至干净的EP管中，漩涡震荡后冰上静置30min，然后12000rpm低温离心15min，吸取上清转移至干净EP管中。经BCA法测定蛋白浓度后，进行WesternBlot检测，孵育一抗(Anti-Phospho-JNK、Anti-JNK、Anti-GAPDH抗体)，二抗(山羊抗小鼠HRP标记、山羊抗兔HRP标记，1∶5000稀释)室温孵育1h，洗膜后，使用化学发光试剂进行显影，UVP凝胶成像系统进行成像拍照。实验结果显示，A549细胞在经过TNF-α、CBLB502和CBLB502-Fc刺激后，其JNK的磷酸化水平相比阴性对照显著提高如图7所示。说明CBLB502-Fc能够有效刺激激活TLR5下游的信号通路，能够激活JNK，显著提高其磷酸化水平，可参与免疫等生理活动，CBLB502与IgGFc融合后并不影响CBLB502生物学活性。以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。