基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断引物对、探针及方法与流程

本发明涉及分子生物学和核酸检测
技术领域：
，具体涉及一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断引物对、探针及方法。
背景技术：
：妊娠诊断是奶牛繁殖工作中至关重要的一部分，快速、准确并且简捷地对奶牛进行早期妊娠诊断可以提前排查空怀牛，减少空怀导致的饲料、能源、人力等方面的消耗，同时也可以对妊娠牛实施精准饲养，减少早期流产事件的发生。利用分子生物学技术对奶牛进行妊娠诊断，由于该技术具有采样方便、经济可靠、可批量化操作等诸多优越性而被生产者接纳并逐步广泛使用，其中比较成熟的商业化试剂盒是妊娠相关糖蛋白(PAG)ELISA检测试剂盒。但是，该方法最早在奶牛人工授精后28天才能准确判断奶牛是否受孕，而实际生产中，部分奶牛在人工授精后如果没有成功受配，一个情期(即21天)之后会出现返情，因此，如何利用分子生物学的技术在奶牛人工授精后21天之前进行妊娠诊断逐渐成为广大奶牛养殖者以及科研工作者关注的重点。目前，定量PCR技术由于其反应时间短、灵敏性高等特点越来越受到人们的青睐。专利号为2014106572061的发明专利提供了奶牛早期妊娠的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该发明通过荧光定量PCR技术检测奶牛人工授精后18天外周血白细胞中基因的表达水平来进行妊娠诊断，实现在奶牛人工授精后一个情期内判别妊娠牛和空怀牛。但是，该发明局限于单重荧光定量PCR技术，即单管扩增一次只能检测一种基因：目的基因或者内参基因，同一个血液样本至少需要分两次检测两个基因的表达量，这无疑增加了工作量，而且需要提供的样本量也会增加，检测的成本也会加大。技术实现要素：针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断引物对、探针及方法，可降低反应实际成本，节省反应时间。为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断的引物对，包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin的特异性引物对，其中：所述牛ISG15基因的引物对是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物对是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列；所述内参基因β-Actin的引物对是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示序列。本发明还公开了一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断的探针，包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin的特异性探针，其中：所述牛ISG15基因的探针是SEQIDNO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探针是SEQIDNO:6所示序列；所述内参基因β-Actin的探针是SEQIDNO:9所示序列。本发明还公开了一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法，采用TaqMan探针法对两种目的基因和内参基因进行双重荧光定量PCR检测，在单个PCR管内同时进行一种目的基因与内参基因的PCR反应，并在同一块PCR反应板中同时进行两种目的基因的PCR反应，根据两种目的基因的表达差异判断奶牛早期妊娠。在上述技术方案的基础上，其中一种所述目的基因为牛ISG15基因，另一种所述目的基因为牛RSAD2基因，所述内参基因为β-Actin。在上述技术方案的基础上，包括以下步骤：S1，收集血液样本，采集奶牛发情后人工授精后0天和人工授精后18天的血液样本1.5-2mL，抗凝，低温冷藏；S2，提取血液样本RNA，血液样本采集后2小时内，用血液总RNA提取试剂盒提取血液样本中总RNA，并分析RNA样本浓度与纯度，同时检测RNA完整性，通过质检的样本分装后，低温保存备用；S3，逆转录反应成cDNA，采用逆转录试剂盒进行逆转录反应将从血液样本中提取的RNA逆转录成cDNA；S4，设计与合成引物对和探针，所述牛ISG15基因的引物对是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物对是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列；所述内参基因β-Actin的引物对是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示序列；所述牛ISG15基因的探针是SEQIDNO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探针是SEQIDNO:6所示序列；所述内参基因β-Actin的探针是SEQIDNO:9所示序列；S5，进行双重荧光定量PCR检测血液样本中牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin，在单个PCR管内同时检测牛ISG15基因和内参基因β-Actin，并同时在同一块PCR反应板中同时检测牛RSAD2基因和内参基因β-Actin；S6：双重荧光定量PCR完成后，根据各基因的循环阈值(Ct)计算出基因ISG15和基因RSAD2的相对表达量，并根据相对表达量进行奶牛早期妊娠诊断。在上述技术方案的基础上，步骤S5中基因ISG15和基因β-Actin的反应体系：2×PremixExTaqMix10μL，各基因采用浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物各0.2uL，各基因采用浓度为10μmol/L的探针各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH2O7.8μL，反应体系共20μL；基因RSAD2和基因β-Actin的反应体系：2×PremixExTaqMix10μL，各基因采用浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物各0.2uL，各基因采用浓度为10μmol/L的探针的各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH2O7.8μl，反应体系共20μl。在上述技术方案的基础上，步骤S5中的反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性15秒，61℃退火并延伸30秒，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。在上述技术方案的基础上，步骤S6的具体步骤为：S601：计算出检测血液样本中目的基因Ct均值与内参基因Ct均值的差值ΔCt；S602：计算出血液样本中目的基因的相对表达量2-△ΔCt，其中代表人工授精后0天或者18天血液样本目的基因的Ct均值，代表该血液样本对应的内参基因的Ct均值；S603：将奶牛人工授精后0天各基因的相对表达量校正为1，人工授精后18天的相对表达量校正为人工授精后0天时相对表达量的倍数；计算出人工授精后18天奶牛血液样本中牛ISG15基因的相对表达量为X1，牛RSAD2基因的相对表达量为X2；S604：将X1和X2带入公式P＝1/[1+e-(-6.53+2.830X1+0.866X2)]中，如果P值大于0.680时，即为妊娠。与现有技术相比，本发明的优点在于：1、本发明采用的牛ISG15基因的引物对如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，探针如SEQIDNO:3所示；牛RSAD2基因的引物对如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示，探针如SEQIDNO:6所示；内参基因β-Actin的引物对如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示，探针如SEQIDNO:9所示；采用上述引物对与探针进行双重荧光定量PCR反应时，目的基因牛ISG15基因或牛RSAD2基因与内参基因β-Actin在同一个PCR管内反应时相互干扰性极小，并且反应条件一致，从而使得目的基因和内参基因得以在同一个PCR管内反应并同时进行两种目的基因的PCR反应。2、本发明在同一个PCR管内检测目的基因与内参基因，减少了模板的使用量，节约模板制作的成本，在一定程度上还可以减轻采样对奶牛造成的损伤。同时，由于反应管的缩减，反应试剂的成本也会随之降低。3、本发明可以在同一块PCR反应板中同时检测目的基因ISG15和RSAD2的表达，缩短了反应时间；同时，由于双重定量PCR技术的检测时间为传统的SYBOGreen单重荧光定量PCR技术的反应时间的二分之一，提高了检测的效率。附图说明图1为本发明实施例中基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法的流程示意图；图2为本发明实施例中引物琼脂糖凝胶检测电泳结果图，其中M：DNA相对分子质量标准DL2000；泳道1-2:内参基因β-Actin的PCR扩增产物；泳道3-4：牛ISG15基因的PCR扩增产物；泳道5-6：牛RSAD2基因的PCR扩增产物；图3为本发明实施例中双重荧光定量PCR与单重荧光定量PCR反应扩增曲线对比图；图4为本发明实施例中妊娠牛双重荧光定量PCR扩增曲线；图5为本发明实施例中空怀牛双重荧光定量PCR扩增曲线。具体实施方式以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。本发明公开了一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断的引物对：包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin的特异性引物对，其中：所述牛ISG15基因的引物对是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物对是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列；所述内参基因β-Actin的引物对是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示序列。本发明还公开了一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断的探针：包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin的特异性探针，其中：所述牛ISG15基因的探针是SEQIDNO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探针是SEQIDNO:6所示序列；所述内参基因β-Actin的探针是SEQIDNO:9所示序列。采用上述引物对与探针进行双重荧光定量PCR反应时，目的基因牛ISG15基因或牛RSAD2基因与内参基因β-Actin在同一个PCR管内反应时相互干扰性极小，并且反应条件一致，从而使得目的基因和内参基因得以在同一个PCR管内反应并在同一块PCR反应板中同时进行两种目的基因的PCR反应。本发明还公开了一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法：采用TaqMan探针法对两种目的基因和内参基因进行双重荧光定量PCR检测，在单个PCR管内同时进行一种目的基因与内参基因的PCR反应，并在同一块PCR反应板中同时进行两种目的基因的PCR反应，根据两种目的基因的表达差异判断奶牛早期妊娠。其中一种所述目的基因为牛ISG15基因，另一种所述目的基因为牛RSAD2基因，所述内参基因为β-Actin。【实施例1】基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法参见图1所示，包括以下步骤：S1，收集血液样本，采集奶牛发情后人工授精后0天和人工授精后18天的血液样本1.5-2mL，抗凝，低温冷藏；S2，提取血液样本RNA，血液样本采集后2小时内，用血液总RNA提取试剂盒提取血液样本中总RNA，并分析RNA样本浓度与纯度，同时检测RNA完整性，通过质检的样本分装后，低温保存备用；S3，逆转录反应成cDNA，采用逆转录试剂盒进行逆转录反应将从血液样本中提取的RNA逆转录成cDNA；S4，设计与合成引物对和探针，所述牛ISG15基因的引物对是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物对是SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示序列；所述内参基因β-Actin的引物对是SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示序列；所述牛ISG15基因的探针是SEQIDNO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探针是SEQIDNO:6所示序列；所述内参基因β-Actin的探针是SEQIDNO:9所示序列；S5，进行双重荧光定量PCR检测血液样本中牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin，在单个PCR管内同时检测牛ISG15基因和内参基因β-Actin，并同时在同一块PCR反应板中同时检测牛RSAD2基因和内参基因β-Actin；S6：双重荧光定量PCR完成后，根据各基因的循环阈值(Ct)计算出基因ISG15和基因RSAD2的相对表达量，并根据相对表达量进行奶牛早期妊娠诊断。步骤S5中基因ISG15和基因β-Actin的反应体系：2×PremixExTaqMix10μL，各基因采用浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物各0.2uL，各基因采用浓度为10μmol/L的探针各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH2O7.8μL，反应体系共20μL；基因RSAD2和基因β-Actin的反应体系：2×PremixExTaqMix10μL，各基因采用浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物各0.2uL，各基因采用浓度为10μmol/L的探针的各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH2O7.8μL，反应体系共20μL。步骤S5中的反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性15秒，61℃退火并延伸30秒，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。步骤S6的具体步骤为：S601：计算出检测血液样本中目的基因Ct均值与内参基因Ct均值的差值ΔCt；S602：计算出血液样本中目的基因的相对表达量2-△ΔCt，其中代表人工授精后0天或者18天血液样本中目的基因的Ct均值，代表该血液样本对应的内参基因的Ct均值；S603：将奶牛人工授精后0天各基因的相对表达量校正为1，人工授精后18天的相对表达量校正为人工授精后0天时相对表达量的倍数；计算出人工授精后18天奶牛血液样本中牛ISG15基因的相对表达量为X1，牛RSAD2基因的相对表达量为X2；S604：将X1和X2带入公式P＝1/[1+e-(-6.53+2.830X1+0.866X2)]中，如果P值大于0.680时，即为妊娠。本发明在同一个PCR管内检测目的基因与内参基因，减少了模板的使用量，节约模板制作的成本，在一定程度上还可以减轻采样对奶牛造成的损伤。同时，由于反应管的缩减，反应试剂的成本也会随之降低。本发明可以在同一块PCR反应板中同时检测目的基因ISG15和RSAD2的表达，缩短了反应时间；同时，由于双重荧光定量PCR技术的检测时间为传统的SYBOGreen单重荧光定量PCR技术的反应时间的二分之一，提高了检测的效率。【实施例2】基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法的准确性试验1、引物验证将冷冻保存的双重荧光定量PCR的准确性试验的血液样本用步骤S4中的引物对和探针进行PCR扩增，其反应体系为：PremixTaqTM10uL,浓度为10μmol/L的上、下游引物各0.2uL，cDNA模板0.6μL，最后用ddH2O补至20μL。其反应条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒；72℃延伸25秒，共30个循环；最后72℃10分钟。用琼脂糖凝胶(1.2％)电泳检测PCR产物。结论：参见图2所示，定量PCR扩增的凝胶电泳图显示在扩增的过程中无引物二聚体，也没有杂带，可以用于下一步的定量PCR检测。2、双重荧光定量PCR反应与单重荧光定量PCR反应的准确性比较在同一块PCR反应板中同时检测每个血液样本中牛ISG15基因，牛RSAD2基因，内参基因β-Actin，牛ISG15基因和内参基因β-Actin,牛RSAD2基因和内参基因β-Actin。其中，单重荧光定量PCR反应体系为：2×PremixExTaqMix10μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各0.2uL，浓度为10μmol/L的探针0.4uL，cDNA模板0.6μL，最后用ddH2O补至20μL。双重荧光定量PCR反应体系：以牛ISG15基因和内参基因β-Actin为例，2×PremixExTaqMix10μL，浓度为10μmol/L的牛ISG15基因和内参基因β-Actin的上下游引物各0.2uL(10μmol/L)，浓度为10μmol/L的牛ISG15基因和内参基因β-Actin对应的探针0.4uL，cDNA模板0.6μL，最后用ddH2O补至20μL。于CFXConnect荧光定量PCR仪扩增，反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性15秒，61℃退火并延伸30秒，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。实时分析软件计算每个血液样本的循环阈值(Ct)，参见图3所示，比较相同血液样本单重荧光定量PCR检测与双重荧光定量PCR检测时的△Ct。根据步骤S604中的检测标准：即将ISG15(X1)和RSAD2(X2)基因的相对表达量代入公式P＝1/[1+e-(-6.53+2.830X1+0.866X2)]，当P大于0.680时为妊娠。对所有血液样本进行判断，并且与实验室广泛使用的SYBOGreen技术检测血液样本中单个牛ISG15基因和单个牛RSAD2基因的表达来进行妊娠诊断进行准确性比较。其中表1为单重荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因的检测结果，表2为双重荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因的检测结果。表1：单重荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因的Ct值样本ISG15RSAD2β-ActinΔCt(ISG15)ΔCt(RSAD2)126.0229.1922.913.116.28226.3629.7321.414.948.32326.8329.4219.567.279.86433.1835.5526.117.079.44531.1731.6723.008.178.67629.1832.2721.417.7710.85表2：双重荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因的Ct值结论：从表2中可以看出，同一样本在进行双重荧光定量PCR检测时，在牛ISG15基因和内参基因β-Actin以及牛RSAD2基因和内参基因β-Actin这两种组合下，内参基因β-Actin的Ct很稳定，差值小于0.6，说明本次试验的重复性比较好。比较表1和表2，结果显示，相同血液样本双重荧光定量PCR检测比单重荧光定量PCR检测的Ct值高0～2.36，但是，相同血液样本双重荧光定量PCR检测与单重荧光定量PCR检测的ΔCt(牛ISG15基因)值相差-0.84～0.02，ΔCt(牛RSAD2基因)值相差-1.23～0.04，表明双重荧光定量PCR反应的过程中，目的基因与内参基因的引物特异性较高，之间的相互竞争小；目的基因与内参基因的荧光探针交叉干扰比较小，整体结果显示，双重定量PCR检测方法比较稳定。3、利用双重荧光定量PCR进行妊娠诊断的准确性检测对经直肠检查确定为妊娠牛(19头)和空怀牛(17头)的血液样本进行了扩增，扩增曲线如图4和图5所示。以2-△ΔCt表示血液样本中目的基因mRNA相对表达量，根据本发明的早期妊娠诊断方法，对36头奶牛的样本进行了检测。利用双重荧光定量PCR方法检测经直肠检查确定为妊娠的19头牛，结果为：18头为妊娠，1头为空怀，妊娠牛检测的准确性为94.73％；利用双重荧光定量PCR方法检测经直肠检查确定为空怀的17头牛，结果为16头为空怀，1头为妊娠，空怀牛的准确性为94.12％。结论：本发明应用于奶牛的早期妊娠诊断，检测的灵敏性与单重荧光定量PCR技术一致，检测的准确性为94.12％，能满足奶牛生产中对于妊娠诊断的要求。本发明不局限于上述实施方式，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。当前第1页1 2 3