基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断引物对、探针及方法与流程

技术特征：

1.一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断的引物对，其特征在于：包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin的特异性引物对，其中：所述牛ISG15基因的引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物对是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列；所述内参基因β-Actin的引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列。

2.一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断的探针，其特征在于：包括牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin的特异性探针，其中：所述牛ISG15基因的探针是SEQ ID NO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探针是SEQ ID NO:6所示序列；所述内参基因β-Actin的探针是SEQ ID NO:9所示序列。

3.一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法，其特征在于：采用TaqMan探针法对两种目的基因和内参基因进行双重荧光定量PCR检测，在单个PCR管内同时进行一种目的基因与内参基因的PCR反应，并在同一块PCR反应板中同时进行两种目的基因的PCR反应，根据两种目的基因的表达差异判断奶牛早期妊娠。

4.如权利要求3所述的一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法，其特征在于：其中一种所述目的基因为牛ISG15基因，另一种所述目的基因为牛RSAD2基因，所述内参基因为β-Actin。

5.如权利要求4所述的一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，收集血液样本，采集奶牛发情后人工授精后0天和人工授精后18天的血液样本1.5-2mL，抗凝，低温冷藏；

S2，提取血液样本RNA，血液样本采集后2小时内，用血液总RNA提取试剂盒提取血液样本中总RNA，并分析RNA样本浓度与纯度，同时检测RNA完整性，通过质检的样本分装后，低温保存备用；

S3，逆转录反应成cDNA，采用逆转录试剂盒进行逆转录反应将从血液样本中提取的RNA逆转录成cDNA；

S4，设计与合成引物对和探针，所述牛ISG15基因的引物对是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列；所述牛RSAD2基因的引物对是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列；所述内参基因β-Actin的引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列；所述牛ISG15基因的探针是SEQ ID NO:3所示序列；所述牛RSAD2基因的探针是SEQ ID NO:6所示序列；所述内参基因β-Actin的探针是SEQ ID NO:9所示序列；

S5，进行双重荧光定量PCR检测血液样本中牛ISG15基因、牛RSAD2基因和内参基因β-Actin，在单个PCR管内同时检测牛ISG15基因和内参基因β-Actin，并同时在同一块PCR反应板中同时检测牛RSAD2基因和内参基因β-Actin；

S6：双重荧光定量PCR完成后，根据各基因的循环阈值(Ct)计算出基因ISG15和基因RSAD2的相对表达量，并根据相对表达量进行奶牛早期妊娠诊断。

6.如权利要求5所述的一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法，其特征在于：

步骤S5中基因ISG15和基因β-Actin的反应体系：2×Premix Ex TaqMix 10μL，各基因采用浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物各0.2uL，各基因采用浓度为10μmol/L的探针各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH₂O 7.8μL，反应体系共20μL；

基因RSAD2和基因β-Actin的反应体系：2×Premix Ex TaqMix 10μL，各基因采用浓度为10μmol/L的上游引物和下游引物各0.2uL，各基因采用浓度为10μmol/L的探针的各0.4uL，cDNA模板0.6μL，ddH₂O 7.8μL，反应体系共20μL。

7.如权利要求5所述的一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法，其特征在于：步骤S5中的反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性15秒，61℃退火并延伸30秒，40个循环，在每个循环的61℃退火并延伸阶段收集荧光信号。

8.如权利要求5所述的一种基于双重定量PCR的奶牛早期妊娠诊断方法，其特征在于：步骤S6的具体步骤为：

S601：计算出检测血液样本中目的基因Ct均值与内参基因Ct均值的差值△Ct；

S602：计算出血液样本中目的基因的相对表达量2^-△△Ct，其中代表人工授精后0天或者18天血液样本目的基因的Ct均值，代表该血液样本对应的内参基因的Ct均值；

S603：将奶牛人工授精后0天各基因的相对表达量校正为1，人工授精后18天的相对表达量校正为人工授精后0天时相对表达量的倍数；计算出人工授精后18天奶牛血液样本中牛ISG15基因的相对表达量为X1，牛RSAD2基因的相对表达量为X2；

S604：将X1和X2带入公式P＝1/[1+e^{-(-6.53+2.830X1+0.866X2)}]中，如果P值大于0.680时，即为妊娠。