细胞固定工艺及通过该工艺制备AQP4抗体检测试剂盒的制作方法

本发明涉及医疗领域，具体地说是一种细胞固定工艺及通过该工艺制备AQP4抗体检测试剂盒。

背景技术：

水通道蛋白4(AQP4)抗体，亦被称为视神经脊髓炎(NMO)-IgG抗体，AQP4抗体是NMO诊疗指南中的一个重要的检测指标之一，它是鉴别多发性硬化和NMO的重要血清标志物。脑脊髓液(简称，CSF)中AQP4抗体的升高也有很重要的参考意义。

现有的方法都是采用在哺乳动物细胞中过表达AQP4蛋白，将过表达的细胞用爬片法固定或用特殊处理的玻璃片培养细胞及固定。但该方法操作较繁琐，同一块板里面不同孔的转染效率可能有一定差异，固定的细胞数量少，还容易脱落，且检测所需的标本体积较大，不适合临床检验实验室开展和商业化生产。目前这些试剂盒只有欧蒙医学实验诊断股份公司可以提供。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种细胞固定工艺,该工艺能够有效的一次性制备大量的AQP4转染细胞，然后进行制片，更加适合商业化的生产，同时可以避免转染效率导致的批内差异，并且检测所需的标本体积小，同时本发明还公开了通过该工艺制备AQP4抗体检测试剂盒。

本发明的具体的技术方案为：

一种细胞固定工艺，包括以下步骤：

步骤1：构建pDsRed-Monomer-N1-AQP4质粒；

步骤2：将质粒pDsRed-Monomer-N1-AQP4采用聚乙烯亚胺转染法转染细胞；

步骤3：将转染后的细胞固定于孔板上。

在上述的细胞固定工艺中，所述的步骤1具体为：

S11：从GeneBank中检索AQP4蛋白基因及其序列号(NM_001650)；

S12：由“南京金斯瑞生物科技有限公司”合成人的AQP4基因片段，基因片段两端加酶切位点为XhoI和Kpnl，并插入到pDsRed-Monomer-N1质粒中，，质粒载体为，最终构建的质粒pDsRed-Monomer-N1-AQP4，图谱见附图2.

S13：测序验证所构建的质粒，质粒序列见附录1，测序结果见附录2。

在上述的细胞固定工艺中，所述的步骤2具体为：

S21：采用直径为10cm的培养皿培养细胞，按密度2.2×10⁶个/10cm培养皿接种细胞，培养基为完全培养基(DMEN基础培养基：胎牛血清：青链霉素混合液(100×)＝90:10:1)

S22：待细胞汇合度(confluence)达到90％～100％，吸去培养基，用PBS洗一次

S23：用1ml 0.25％胰酶-ETDA(0.25％Trypsin-EDTA，Life Technologies Corporation)消化细胞1min，然后用5ml完全培养基终止消化，将细胞吹打悬浮于培养基，800rpm离心3min，再用6ml完全培养基悬浮细胞。

S24：按密度3.3×10⁶个/10cm培养皿接种细胞。

S25：待细胞汇合度达70～90％(18～20h)。

S26：吸去培养基，用PBS洗1次，用DMEN基础培养基培养细胞(约1h)。

S27：用DMEM稀释质粒，记为A液；用DMEM稀释PEI，得到B液。(其中质粒和PEI的质量比为1:2；用来稀释质粒和PEI的DMEM体积相等，分别等于培养皿中培养基的体积的1/20，也就是说被DMEM稀释的质粒和PEI混合后，总体积为培养皿中总培养基体积的1/10；以直径为10cm的培养皿为例，质粒用量是15μg/10cm培养皿，所用的15μg质粒用500μl DMEM稀释)。

S28：将B液加入A液中，用移液器吹打混匀，静置20min；

S29：将S28中的混合液小心滴入到细胞培养基中，轻轻混匀，放置于CO₂培养箱；

S210：步骤S29完成24小时后，用荧光显微镜检视是否转染成功(转染成功的细胞带有红色荧光)。

在上述的细胞固定工艺中，所述的步骤3具体为：

S31：转染24h后，用PBS洗转染后的细胞2次，用1ml 0.25％胰酶-ETDA消化转染细胞1min，用完全培养基5ml终止消化，用移液器吹打使细胞混悬于培养基中；

S32：将混悬的细胞在800rpm离心3min。

S33：吸去S32离心后的细胞的上清液，用1ml PBS混悬细胞，再往混悬液加入5ml浓度为4％的多聚甲醛溶液(w/v)，吹打混悬细胞，计数，放置10min。

S34：取一定体积的S33的混悬细胞，加到96孔板(每孔加入的细胞数量为5×10⁴～6×10⁴个)，800rpm离心3min

S35：吸去S34的96孔板的上清液，室温放置50min，使96孔板干燥。

S36：往S35的96孔板加入150μl/孔的PBS，室温放置5min。

S37：吸去S36的96孔板的上清液，室温放置50min，使96孔板干燥。

S38：将S37的96孔板放置于-80℃保存，待用。

在上述的细胞固定工艺中，所述的细胞为HEK-293T细胞；理论上AQP4表达量低的哺乳动物细胞均可，比如NIH3T3，COS7，不能用神经细胞来源的细胞株(内源性AQP4表达量高)。

在上述的细胞固定工艺中，S24步骤在S26步骤之前18-20h进行。

在上述的细胞固定工艺中，S29之后还包括：

S210：S29结束24h后通过荧光显微镜观察转染是否成功。

在上述的细胞固定工艺中，所述的S34中的离心操作的转速均为800rpm，离心时间3min；

S35、S37两个步骤步骤结束后都需要孔板静置50min；

所述的孔板为96孔板。

在上述的细胞固定工艺中，所述的步骤2结束后还包括：步骤4：对试剂盒进行检测，所述的检测方法具体为：

S41：取试剂盒，室温放置20min。

S42：加入10％胎牛血清(用PBS稀释)150μl，37℃孵育30min。

S43：用PBS洗1次。

S44：取血清标本20μL，用PBS稀释至200μL，取150μL加入到96孔板，37℃孵育1h。

S45：用PBS洗3次，每次3min。

S46：在避光下加入用PBS稀释600倍的绿色荧光标记的免疫荧光二抗(Anti-Human IgG抗体(FITC)，Abcam)，37℃孵育2h。

S47：用PBS在避光下洗3次，每次3min。

S48：荧光显微镜下检视。

同时，本发明还公开了一种AQP4抗体检测试剂盒，通过如上所述的方法制备得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本方案利用先制备AQP4转染细胞，然后采用离心方法将细胞固定至96孔板上，其操作步骤简单，可快速制备大量检验用试剂盒，而且所检验标本体积只需20μL，更加适合临床检验实验室的开展和试剂盒的商品化生产。

本方法可以快速制备大量适合于各种细胞免疫荧光检验试剂盒，操作更加简单，所需人力物力更加便宜，所需时间更短。

附图说明

图1是本发明实施例1的测试图谱。

图2是本发明实施例1的pDsRed-Monomer-AQP4质粒图谱。

图3-图5是本发明实施例1的pDsRed-Monomer-N1-AQP4质粒的测序结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例

1.AQP4转染细胞的制备

从GeneBank中检索AQP4蛋白基因及其序列号具体见序列表(NM_001650)；由“南京金斯瑞生物科技有限公司”合成人的AQP4基因片段，基因片段两端加酶切位点为XhoI和Kpnl，并插入到pDsRed-Monomer-N1质粒中，，质粒载体为，最终构建的质粒pDsRed-Monomer-N1-AQP4，图谱见附图2.测序验证所构建的质粒，质粒序列见序列表(Genebank NM_001650，起始密码子到终止密码子(64..1035)之间的碱基序列)，测序结果见图3-5。

1.1采用直径为10cm的培养皿培养细胞，按密度2.2×10⁶个/10cm培养皿接种细胞，培养基为完全培养基(DMEN基础培养基：胎牛血清：青链霉素混合液(100×)＝90:10:1)

1.2待细胞汇合度(confluence)达到90％～100％，吸去培养基，用PBS洗一次

1.3用1ml 0.25％胰酶-ETDA(0.25％Trypsin-EDTA，Life Technologies Corporation)消化细胞1min，然后用5ml完全培养基终止消化，将细胞吹打悬浮于培养基，800rpm离心3min，再用6ml完全培养基悬浮细胞。

1.4按密度3.3×10⁶个/10cm培养皿接种细胞。

1.5待细胞汇合度达70～90％(18～20h)。

1.6吸去培养基，用PBS洗1次，用DMEN基础培养基培养细胞(约1h)。

1.7用DMEM稀释质粒，记为A液；用DMEM稀释PEI，得到B液。(其中质粒和PEI的质量比为1:2；用来稀释质粒和PEI的DMEM体积相等，分别等于培养皿中培养基的体积的1/20，也就是说被DMEM稀释的质粒和PEI混合后，总体积为培养皿中总培养基体积的1/10；以直径为10cm的培养皿为例，质粒用量是15μg/10cm培养皿，所用的15μg质粒用500μl DMEM稀释)。

1.8将B液加入A液中，用移液器吹打混匀，静置20min；

1.9将1.8中的混合液小心滴入到细胞培养基中，轻轻混匀，放置于CO₂培养箱；

1.10：步骤1.9完成24小时后，用荧光显微镜检视是否转染成功。

2.离心法固定AQP4转染细胞

2.1转染24h后，用PBS洗转染后的细胞2次，用1ml 0.25％胰酶-ETDA消化转染细胞1min，用完全培养基5ml终止消化，用移液器吹打使细胞混悬于培养基中；

2.2将混悬的细胞在800rpm离心3min。

2.3吸去2.2中离心后的细胞的上清液，用1mlPBS混悬细胞，再往混悬液加入5ml浓度为4％的多聚甲醛溶液(w/v)，吹打混悬细胞，放置10min。

2.4取一定体积的2.3的混悬细胞，加到96孔板，800rpm离心3min

2.5吸去2.4的96孔板的上清液，室温放置50min，使96孔板干燥。

2.6往2.5的96孔板加入150μl/孔的PBS，室温放置5min。

2.7吸去2.6的96孔板的上清液，室温放置50min，使96孔板干燥。

2.8将2.7的96孔板放置于-80℃保存，待用。

3.AQP4试剂盒的检验

3.1取试剂盒，室温放置20min。

3.2加入10％胎牛血清150μl，37℃孵育30min。

3.3用PBS洗1次。

3.4取血清标本20μL，用PBS稀释至200μL，取150μL加入到96孔板，37℃孵育1h。

3.5用PBS洗3次，每次3min。

3.6在避光下加入稀释600倍的绿色荧光标记的免疫荧光二抗(Anti-Human IgG抗体(FITC)，Abcam)，37℃孵育2h。

3.7用PBS在避光下洗3次，每次3min。

3.8荧光显微镜下检视。

附图1采用制备的试剂盒和欧蒙医学实验诊断股份公司提供的试剂盒(欧蒙试剂盒)检测血清中AQP4抗体结果(相同标本分别用欧蒙试剂盒和本项目制备的试剂盒进行检测)，其中A为AQP4阳性标本的欧蒙试剂盒检测结果、B、C和D分别为阳性标本采用本发明制备的试剂盒检测的绿色荧光、红色荧光和红绿荧光组合图结果；E为AQP4阴性标本的欧蒙试剂盒检测结果、F、G和H分别采用本实验制备的试剂盒检测的绿色荧光、红色荧光和组合图结果。

本项目制备的试剂盒检测AQP4抗体阳性标本可见绿色荧光，与欧蒙试剂盒检验的结果一致，且与红色荧光(标记AQP4蛋白)重叠，叠加后AQP4高表达的细胞呈黄色；而阴性标本带有红光的细胞未见绿色荧光，由此可以区分血清中AQP4抗体阳性和阴性，其结果与欧蒙试剂盒检验结果一致。

总结

本项目利用离心法将AQP4转染细胞固定于96孔板上，制成可用于检测血清中AQP4抗体检验的试剂盒。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。