一种小麦转化3T超毒载体及其制备方法和应用与流程

本发明属于作物遗传育种领域，具体涉及一种小麦转化三T超毒载体及其制备方法和应用。

背景技术：

1.小麦的育种目标

小麦(Triticum aestivum)是世界主要粮食作物之一，其产量和品质关系到社会经济生活。随着人口增加以及国家经济的发展，需要更多的粮食满足人们的生活需求。但是水土流失导致农田不断减少以及全球气候变暖使得近几年的粮食产量增长并不明显。据相关数据分析，分析近几年的全球小麦单产，发现小麦单产不稳定，且增幅较小，小麦的增产已经成为人们关注的问题之一。

面对如此大的挑战，任何可以提高粮食产量的方法都值得去利用。针对粮食作物品种改良，人们主要采取传统育种和转基因的方式。两者的本质区别是：前者通过去雄杂交促进亲本基因组的变异，后期以优良性状为指标，利用田间试验，筛选获得所需优良性状的小麦品种。利用转基因技术引起植物基因定向变异并产生优良性状，相比于传统杂交育种，转基因技术可打破生殖隔离，进一步扩大植物基因变异的范围。植物组织培养是小麦转基因技术的关键，传统育种在自然条件下进行，所以周期长、受气候环境影响大。转基因技术利用组织培养，整个过程可在培养箱和温室进行，有效避免环境因素的影响。转基因技术主要包括：基因克隆、目的基因功能鉴定、目的基因插入植物基因组并通过生理鉴定获得品种改良并具有商业价值的植株。植物基因组插入外源基因的方法有基因枪法和农杆菌转化法和花粉管通道法等。

2.小麦转化方法

小麦为异源六倍体植物、基因组大、基因调控困难，同时小麦外植体所诱导的愈伤组织普遍存在愈伤胚性差、分化率低、转化细胞再生困难等问题，是举世公认的最难转化的栽培作物。科学家通过各种方法实现对小麦的转化，但目前最主要的小麦转化技术是基因枪法和农杆菌介导。世界第一株转基因小麦是Vasil在1992年通过基因枪法将gus、bar基因导入小麦品种Pavon。1997年Cheng首次利用农杆菌介导法将GUS和nptⅡ转入了小麦。除了基因枪和农杆菌介导法，花粉管通道法、显微注射法、激光微束穿刺法、PEG法和电击法等也受到越来越多的关注。

3、农杆菌介导原理

农杆菌具有天然基因转化系统，是生存在土壤中革兰氏阴性细菌，包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。发根农杆菌中含有Ri质粒，可以导致受伤部位产生毛发状根。目前农杆菌介导主要利用根癌农杆菌，根癌农杆菌含有能诱发冠瘿瘤的Ti质粒，质粒主要是由可转移T区、毒性基因和冠瘿碱代谢基因编码区。T区主要特征是左右两边分别是长度为25bp的重复序列，左右边界内是合成生长激素、细胞分裂素和冠瘿碱相关的基因。毒性基因是多段毒性基因组成的：VirA、VirB、VirC、VirD等。天然条件下，双子叶植物细胞受到伤害后会产生酚类物质，一方面诱导农杆菌附着植物细胞表面；另一方面与植物细胞壁表面的单糖一起诱导Vir区基因表达，通过与virA蛋白相互作用(Toyoda-Yamamoto et al.，2000)，激活virA蛋白，具有跨膜组氨酸蛋白激酶功能的virA自磷酸化后将virG蛋白激活，磷酸化的virG作为转录调控因子激活vir区的virB、virC、virD、virE等基因的表达。virD1是拓扑异构蛋白，可以使DNA结构变得松弛。virD1蛋白识别并且结合在T-DNA的左右边界处，具有特异剪切单链DNA内切酶作用的virD2，将T-DNA右边界处切开。在DNA解旋酸的帮助下，virD2蛋白与T一链的5’端共价结合，避免T-DNA被核酸外切酶降解。DNA复制酶将单链模板从右向左复制合成新的T-DNA，新链代替旧链，旧链被释放出来(Dombek et al.，1997)。为防止T-DNA不被细胞内的核酸酶降解，virE2蛋白与游离的核酸蛋白复合物结合形成T-复合体。植物细胞壁上由virB蛋白组成的通道帮助T-复合体穿过农杆菌的细胞壁和细胞膜。virD2和virE2的核定位信号被识别后，T-复合体进入细胞核并整合进植物基因组内。

4、农杆菌介导转化方法发展：

农杆菌介导的原理被研究清楚后，越来越多的单子叶通过农杆菌转化获得转基因苗。农杆菌转化水稻成熟胚诱导的愈伤(Hieietal.,1994)、转化玉米幼胚(Ishidaetal.,1996)，被侵染的愈伤组织比率在1到30％之间。1984年,Shaw等的试验表明,农杆菌对酚类化合物具有趋化性,而且这种趋化性依赖于virA和virG基因。Potrykus(1990)提到谷类植物很难转化的主要原因不是因为本身不是双子叶，而是因为它们不能产生酚类化学物质作为信号分子。但是1996年许东晖和李宝健通过对水稻信号分子研究，提出单子叶植物天然状态下不能被农杆菌侵染，不是因为不能产生酚类诱导物质，而是因为单子叶植物只在生长过程中的某个阶段特定部位产生酚类物质。研究者通过转化过程中单独添加乙酰丁香酮大大提高了转化效率，但是成功获得转基因苗还需要再生能力强的细胞。1987年christy发现植物细胞在体外培养时，诱导的愈伤分为3类，其中胚性愈伤组织的再生能力最强,而且胚性愈伤组织易于长期保存。Hieietal.(1994)和Ishidaetal(1996)不仅指出具有较强分化能力和再生能力的细胞是农杆菌转化的关键，同时提出培养基的成分、载体、农杆菌特性、筛选标记以及植株的基因型都对农杆菌转化产生影响。

5.农杆菌菌株和载体

农杆菌的天然宿主是双子叶植物，所以绝大部分农杆菌菌株、载体和标记基因是针对双子叶植物的。大部分的农杆菌用于双子叶植物侵染，少数一部分菌株既适合双子叶又可用于单子叶转化：LBA4404菌株和A281菌株的受体范围广而且转化效率高(Komari,1989)。早期水稻农杆菌转化，Hiei在1994年用LBA4404和EHA101转化水稻成功；2014年Ishida用EHA101和EHA105转化小麦；2008年Hensel发现在大麦AGL1转化率比LBA4404高。

农杆菌菌株的选择除了要考虑到转化效率，还要重视对植物细胞生长发育的影响。刘鹏等2015年通过EHA105、LBA4404和C58C1将HCP1的RNAi载体导入小麦叶片细胞中,利用Rohringer染色分析,分析农杆菌对叶片侵染的能力,选择最适的侵染菌株。Rohringer染色结果显示不同农杆菌菌株侵染过的叶片,EHA105侵染后对植物细胞的伤害比其他两种菌株明显,说明EHA105具有较高毒性,会引起受体防卫反应。C58C1菌株不仅具有较高的目的基因表达效率，而且对叶片的毒性较小,所有选取C58C1作为最适的试验菌株。随着人们对T区转化原理的研究，2013年Someya发现农杆菌内氨基环丙烷羧酸脱氨酶的表达可以减少植物细胞产生乙烯从而提高T区转化。值得提出的是农杆菌侵染时的菌液浓度和共培养时间也是小麦转化过程中需要注意的方面。

同样针对单子叶农杆菌转化，转化的载体也相应做了改善。A281的农杆菌具有很强的侵染能力，人们从A281克隆出毒性基因的一部分并构建到转化载体上获得具有更强转化力的“超级双元载体”(Komari et al.,1996)。Ishida在2007年将含有“超级双元载体”的LBA4404转化玉米，并获得成功。

6.同源重组法

早期人们主要利用酶切连接技术实现载体的构建，该过程要经历多次目的片段的PCR扩增、限制性内切酶选择受限、酶切效率低等问题，所以越来越多的研究者开始寻找新的构建载体的途径。同源重组在载体构建的使用受到广泛的关注，自然条件下，同源重组发生在减数分裂四分体时期，非姐妹染色单体之间含有同源序列的DNA片段交叉互换，实现基因水平的重组。体外同源重组主要是利用目的片段两端添加15bp左右同源序列，在RecA和RecB、RecC、RecD等蛋白质的作用下与线性化的载体发生同源重组(Dubin et al.，2004)。该技术只需一次PCR扩增，直接使用PCR产物进行重组，大大减小基因突变的概率以及扩增酶的使用；酶切反应只需要针对载体进行，不仅利用单酶切提高了酶切效率、降低非特异片段，同时去除了目的基因对限制性内切酶选择的限制。该构建载体的策略，克服了传统酶切连接的效率低、费用高等缺点，极大的提高载体构建的成功率(马先勇等，1996)。

技术实现要素：

为了解决目前小麦农杆菌转化存在目的基因插入到受体内，基因表达沉默、以及单个基因对小麦性状改良不明显等问题，本发明将现有的用于小麦遗传转化的载体以及用于水稻遗传转化的双T超毒载体通过同源重组(Homologous Recombination)技术进行载体改造，构建出一个新的载体，具有多基因、多位点、一次转化的特点。使用该载体进行的一次小麦遗传转化，可以在获得插入多个目的基因转基因小麦，不仅能实现筛选标记基因与目的基因的分离，同时可以利用一次转化在小麦不同位置插入多个目的基因。

本发明所述的小麦转化3T超毒载体3T-v，其结构如图1所示，其序列如SEQ ID NO.2。所述的3T-v是以p1011-V为骨架，在SacII酶切位点插入含有可用多克隆位点的新T区获得的，获得了用于小麦转基因的含有三段T-DNA的超毒载体1个。

本发明所获得的小麦转化用载体，不仅可以通过筛选标记和目的基因分别插入不同的T-DNA中，成功的去除掉筛选标记带来的转基因安全问题。同时本载体含有三段可转移基因的T区，其中一段已经连接潮霉素筛选基因，另外两段T区均含有可用多克隆位点，可分别插入多个外源基因，极大扩大了载体可连接的目的基因数目、同时不同T区的外源基因插入到受体基因组中的不同位置，极大降低外源基因由于位置效应导致外源基因表达沉默的机率、以及多基因控制性状表现不明显等问题。3T-v载体含有毒性基因G，可以促进农杆菌转化小麦。

附图说明

图1 3T超毒载体结构图。

图2 P1011-V T区克隆

M:Marker2504；1至4:T区克隆的T区片段。

图3 合成第三段T区与P1011-V原T区比对。

图4 3T-V菌落PCR

M:Marker2504；1至4:3T-v第三段T区的PCR鉴定。

图5 连接GUS和GFP的3T-V转化小麦后愈伤组织GUS染色

A：(3T-v)+GUS+GFP农杆菌侵染的小麦愈伤组织GUS染色

B：P1011-V农杆菌侵染的小麦愈伤组织GUS染色。

图6 连接GUS和GFP的3T-V转化小麦后愈伤组织GFP荧光观察

A：白光光源下(3T-V)+GUS+GFP转化愈伤组织；B：激发光下图A的愈伤组织；

C：白光光源下P1011-V转化愈伤组织；D：激发光下图C的愈伤组织。

具体实施方式

实施例1：

一、实验材料

双T超毒载体p1011-V(CN104388462A)、新多克隆片段(华大基因合成)、DH5α大肠杆菌感受态、同源重组酶：CloneExpress^TMⅡone step cloning kit(Vazyme公司)。

二、质粒DNA的提取

(1)分别挑取实验过程中的阳性菌落接种于含有卡那霉素的2ml LB液体培养基中，37℃摇菌12～16h。

(2)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500ul的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中

(3)取1-5ml菌液，加入离心管中，4℃，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。

(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1，使用移液器彻底悬浮菌液。

(5)向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(6)向离心管中加入350ul溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。

(7)取上清液转移到吸附柱CP3中，尽量不要吸出沉淀，12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(8)向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(9)重复操作步骤8。

(10)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心2min,将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(12)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min,12000rpm离心2min，将质粒溶液收集到1.5ml的离心管中。

三、分析序列，设计同源引物

根据p1011-V载体设计克隆引物：

3T-2T-Clone-F5:CATTTGTATGTGGGCCGCG(SEQ ID NO.3)、3T-2T-Clone-R5:ATAGCAGCGGAGGGGTTGG(SEQ ID NO.4)，其从p1011-v上扩增长度为3344bp的载体，其序列如SEQ ID NO.5所示。

根据p1011-V载体自身酶切位点分析，选择新T区含有的可用多克隆位点(MluI、SacI、SmaI)，并且在多克隆位点两端添加载体同源序列(新MCS)的序列：

TGAACGATCGGGGAAATTCGACGCGTCCGCGGCCCGGGCTCTAGAGTCGACCTGCAGA(SEQ ID NO.6)，片段由华大基因合成；

根据同源重组技术的要求，针对载体和新合成T区两端的序列分别设计引物。克隆引物：同源+新T区-F1:GAGCCGATTTTGAAATGGCAGGATATATTGTGG(SEQ ID NO.7)

同源+新T区-R1:TGCTGCCTGTGATCAGTTTACCCGCC(SEQ ID NO.8)

其从构建过程中的中间载体扩增得到新T区长度为2888bp的片段(新合成T区),其序列如SEQ ID NO.1所示。

三、PCR扩展以及同源重组

(一).新T区合成

1、PCR扩增：

用Phanta^TM Super Fidelity DNA Polymerase(Vazyme,P501-01)，3T-2T-Clone-F5、3T-2T-Clone-R5为引物，从质粒p1011-V上扩增3344bp的原T区片段，其扩增后片段序列如SEQ ID NO.5，电泳图见图2，胶回收后连接T-Vector pMDTM19(Simple)，获得P19S-T质粒。其扩增体系和扩增程序见表1和表2。

表1原T区PCR反应体系

表2原T区PCR反应程序

2、同源重组：

根据表3配制同源重组反应体系，37℃，30分钟。然后置于冰水浴中5分钟。转化感受态大肠杆菌DH5α，菌液离心浓缩后全部涂板。37℃培养箱中，倒置培养过夜。挑23个单菌落分别溶于20μl LB培养液中，各取1μl菌液作为菌落PCR鉴定的模板，菌落PCR鉴定的程序同表2，鉴定得到的阳性菌液就是含有新合成的T区质粒的菌液，新T区与p1011-V的原T区序列比对见图3，提取质粒获得P19S-3T。

表3新T区同源重组体系

(二).3T超毒载体(3T-v)合成

1、PCR扩增：

用PhantaTM Super Fidelity DNA Polymerase(Vazyme,P501-01)，同源+新T区-F1、同源+新T区-R1为引物从P19S-3T扩增得到新T区片段，胶回收备用。其扩增体系和扩增程序参考表4和表5。

表4从P19S-3T扩增新T区的PCR反应体系

表5从P19S-3T扩增新T区的PCR反应程序

2、同源重组：

参照表6配制同源重组反应体系，37℃，30分钟。然后置于冰水浴中5分钟。转化感受态大肠杆菌DH5α，菌液离心浓缩后全部涂板。37℃培养箱中，倒置培养过夜。挑23个单菌落分别溶于20μl LB培养液中，各取1μl菌液作为菌落PCR鉴定的模板，菌落PCR鉴定的程序同表4、表5，鉴定得到的阳性菌液就是含有新合成的T区质粒的菌液，提取质粒获得3T-v载体，3T-V菌落PCR见图4。所得到的3T-v载体结构如图1，其序列如SEQ ID NO.2。

表6 3T-v同源重组体系

其中，步骤三中用到的感受态DH5α的制备和转化如下：

氯化钙法制备感受态细胞(Bio Basic,No.BS525)

(1)取少量冻存菌株大肠杆菌(E.coli)DH5α，在LB平板培养基上进行划线培养，恒温培养箱(37℃)中培养16～20h。

(2)挑取一个单菌落，接种于含2ml SOB培养液中，恒温摇床(37℃,250rpm/min)上培养12～16h。

(3)接种1ml的培养物到500ml锥形瓶中(内含100ml SOC培养液)，恒温摇床(37℃,250rpm/min)上培养至OD600≈0.35。

(4)迅速将培养物置于冰浴中20min，期间缓慢摇匀使内容物充分均匀冷却。同时将2个50ml离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。

(5)将细菌转移至预冷的离心管中，4℃，4000rpm离心15min，弃去上清。

(6)用16ml的溶液A小心的悬浮细菌，冰上放置15min。

(7)4℃，4000rpm离心15min，收集菌体。

(8)用4ml溶液B重新悬浮细菌，分装，80μl/管，液氮速冻，-70℃保存。

(9)用于转化时，将100pg到10ng DNA加到感受态细胞(冰上溶解)中。

(10)细胞和DNA混合物冰上放置30min，然后37℃培养5min或42℃培养90s，然后再次冰上放置2min。

(11)加入1ml SOC培养基，37℃温和摇动培养1h。

(12)在选择性培养基上涂布培养细胞，恒温培养箱(37℃)中培养12～16h。

实施例2：本发明载体的应用

一、实验材料

pEGAD和pFGUS3(购买于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)、3T-v、大肠杆菌DH5α，农杆菌EHA105,同源重组酶：CloneExpressTMⅡone step cloning kit(Vazyme公司)

二、PCR扩增GUS和GFP基因

使用同源GFP-F2：CAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG(SEQ ID NO.11)、同源GFP-R2：TACTAGTCGACGTCAGGATCCTCAGGCCGCTGCCGCA(SEQ ID NO.12)；同源GUS-F2:

GACTCTAGACCCGGGCCGCGGATGGTAGATCTGAGGGTAAA(SEQ ID NO.13)、同源

GUS-R2:GGGAAATTCACGCGTCCGCGGTCACACGTGGTGGTGG(SEQ ID NO.14)分别从pEGAD和pFGUS3分别扩增出两端含有载体同源序列的GFP(SEQ ID NO.9)和GUS(SEQ ID NO.10)。

三、同源重组

使用两端含有同源序列的GUS和GFP，分别于3T-v载体同源重组，同源重组的体系参照表6。37℃，30分钟。然后置于冰水浴中5分钟。转化感受态大肠杆菌DH5α，菌液离心浓缩后全部涂板。37℃培养箱中，倒置培养过夜。挑23个单菌落分别溶于20μl LB培养液中，各取1μl菌液作为菌落PCR鉴定的模板，菌落PCR鉴定的程序同表4和表5，鉴定得到的阳性菌液就是含有GUS和GFP的3T-v质粒的菌液，提取质粒。

四、农杆菌EHA105感受态制备以及质粒转化农杆菌

1、农杆菌感受态制备：

(1)挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，28℃，200rpm培养16h；

(2)扩大培养于50ml LB液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝0.4-0.6(约6h)；

(3)50ml离心管冰浴30min，4℃，5000rpm离心5min，回收细胞，轻轻倒掉上清；

(4)5ml预冷的TE重悬，4℃，5000rpm离心5min，回收细胞，轻轻倒掉上清；

(5)5ml新鲜的液体LB重悬；

(6)200μl每管分装，若不立即使用，液氮速冻1min，-70℃冰箱保存。

2：质粒转化农杆菌

(1)取感受态农杆菌细胞200μl，加入质粒2-5μl；

(2)冰上10min；

(3)液氮10min；

(4)37℃，10min，300rpm(提前准备)；

(5)加入800μl LB液体培养基，28℃，3h，350rpm；

(6)6000rpm离心，吸去上清800μl，涂板；

(7)28℃，培养48h；

(8)挑取转化子，提取质粒，用同源GUS-F2/R2、同源GFP-F2/R2进行PCR鉴定，鉴定为阳性的可直接用于小麦的转化。

五、农杆菌转化小麦愈伤组织以及GUS和GFP鉴定：

将含有质粒3T-v+GUS+GFP的农杆菌培养至OD600的值在0.5的浓度，与培养10天的扬麦14成熟胚的愈伤组织共培养30min。

GUS染色：转化后小麦愈伤组织300个、阴性对照愈伤组织300个与X-Gluc染色反应液(0.5mM K4[Fe(CN)6；50mM NaH2PO4，PH7.0]，20％甲醇、0.1％Triton X-100，0.5mg/ml X-Gluc[X-glucuronide])于37℃保温过夜后，用75％乙醇脱色观察(图5)；GFP：采用荧光显微镜对所有转化的待鉴定的愈伤组织、阴性愈伤组织进行观察。(图6)。