用于去除抗A和/或抗B抗体的新型亲和层析介质的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求2015年9月8日提交的美国临时专利申请no.62/215,401的优先权，其全部内容都以整体援引加入本文。发明背景免疫球蛋白富集的人血浆用于治疗许多病征以及用于治疗某些先天性缺陷。通常，通过从具有不同血型的多个供血者汇集血浆而获得人血浆。血型可以分为四种主要的的类型。a血型-在红细胞上仅具有a抗原(以及血浆中具有b抗体)；b血型-在红细胞上仅具有b抗原(以及血浆中具有a抗体)；ab血型-在红细胞上具有a和b抗原(但在血浆中既不具有a抗体也不具有b抗体)；和o血型-在红细胞上既不具有a抗原也不具有b抗原(a和b抗体都在血浆中)。重要的是，具有特定血型抗原如a的红血细胞从来都不会与结合此抗原的抗体如抗a抗原抗体接触，因为与此类抗体接触会导致其红血细胞的凝集和/或溶血，这甚至会导致死亡。因此，具有a血型的受血者仅可接受来自具有a血型或ab血型的供血者的血浆；具有b血型的受血者仅可接受来自具有b血型或ab血型的供血者的血浆；具有ab血型的受血者仅可接受来自具有ab血型的供血者的血浆；而具有o血型的受血者被认为是万能受血者。不同血型的相容性对于安全的输血和器官移植的开发是重要的。然而，在血液衍生的治疗药物的情况中，其中依赖于汇集来自很多人的血浆以获得蛋白组分的恒定均值，此时确保受血者不会接受不相容的血浆将会是特别具有挑战性的。已经开发了很多方法来选择性地从血浆中去除血型抗体，包括经福尔马林处理的热处理红细胞(voxsang.,1967,12,75-77)、经热处理的具有a和b抗原的大肠杆菌(escherichiacoli)o86:b7(transfusion,1972,12,98-102)、红细胞基质粉末、源自免疫吸附剂的红细胞基质抗原(chemicalsoc.rev.,1978,7,423-452)、和合成的血型a和b免疫吸附剂(rev.fr.transfus.immunohematol.1981,24,3,281-287)。已经开发了固相层析免疫吸附剂作为商用层析介质，以用以处理源自产物的血液以及也用于在输血至abo不相容受血者之前对于供血者的准备。利用合成的免疫吸附剂的一个关键优势在于，它们是合成构建的而不是源自天然来源因而在批次与批次之间会具有更一致的性质。目前，一些具有血型a抗原(a-抗原)配体和/或血型b抗原(b-抗原)配体的商业可用的层析介质包括glycosorb-abo装置(glycorextransplantationab)。此种glycosorb装置用于将器官供者准备为用来移植至具有不相容血型的患者。所述glycosorb-abo装置中的血型抗原配体从器官供体的血液中结合并去除血型a抗原抗体(抗-a)和血型b抗原抗体(抗-b)，由此降低器官排斥的风险。另外，pct公开no.wo2015/001277讨论了结合抗a或抗b抗体的亲和层析基质。发明概述本文所述的实施方案涉及新型的层析介质，其用于从样品(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物或ivig)中去除抗a或抗b抗体。相对于此前描述的层析介质，本文所述的层析介质对于去除抗a或抗b抗体具有若干优势，其在于所述介质在酸性和/或碱性条件下在延长的时间段中保持稳定。另外，此种介质可以用包含磷酸、乙酸和苯甲醇的溶液来消毒，而不会损失其去除抗a或抗b抗体的能力。在本文所描述的一些实施方案中，提供了用于从样品中去除抗-a抗体的层析介质，其中所述介质包含其上附着有血型a抗原配体的固体支持物，其中所述配体以至少0.8mg/ml固体支持物的配体载荷附着至所述固体支持物，其中所述层析介质在酸性和碱性条件下都稳定。在特定的实施方案中，所述配体载荷为至少1mg/ml固体支持物或至少1.5mg/ml固体支持物或至少1.65mg/ml固体支持物，并且其中所述层析介质在酸性和碱性条件下都稳定。在另一实施方案中，提供了用于从样品中去除抗-b抗体的层析介质，其中所述介质包含其上附着有血型b抗原配体的固体支持物，其中所述配体以至少0.8mg/ml固体支持物的配体载荷附着至所述固体支持物，其中所述层析介质在酸性和/或碱性条件下都稳定。在特定的实施方案中，所述配体载荷为至少1.0mg/ml固体支持物或至少1.20mg/ml固体支持物并且其中所述层析介质在酸性和碱性条件下都稳定。在另一实施方案中，提供了用于从样品中去除抗-a和抗-b抗体二者的层析介质，其中所述层析介质包含其上附着有血型a抗原配体和血型b抗原配体的固体支持物，每种均为至少0.8mg/ml固体支持物的配体载荷。在本文所描述的各个实施方案中，所述固体支持物包含选自以下组的聚合物：聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。在特定的实施方案中，所述固体支持物是基于聚乙烯醚的固体支持物。在一些实施方案中，所述固体支持物是珠的形式。在一些实施方案中，所述血型a抗原配体包含以下结构：在一些实施方案中，所述血型b抗原配体包含以下结构：在本文所描述的一些实施方案中，所述层析介质包含血型a抗原配体和/或血型b抗原配体(用还原胺化化学附着至固体支持物)。在本文所描述的其它实施方案中，所述层析介质包含血型a抗原配体和/或血型b抗原配体(用聚合物触角(tentacle)化学附着至固体支持物)在一些实施方案中，所述层析介质包装在装置中，例如层析柱。在层析介质之外，本文所述的实施方案还涉及使用本文所描述的层析介质从样品(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物、或ivig添料)中去除抗a和/或抗b抗体的方法。在一些实施方案中，提供了从样品中去除抗-a抗体或抗-b抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：提供包含起始已知量的抗-a抗体或抗-b抗体的样品；在适宜介质结合抗体的条件下，如果所述样品含有抗-a抗体则将所述样品与含有血型a抗原配体的层析介质接触，或者如果所述样品含有抗-b抗体则将所述样品与含有血型b抗原配体的层析介质接触；回收没有结合至层析介质的样品部分；和测量没有结合至层析介质的样品部分中抗-a抗体或抗-b抗体的量，其中没有结合至层析介质的样品部分中抗-a抗体或抗-b抗体的量相对于样品中抗a或抗b抗体的起始量降低了至少50％。本文所述的实施方案还涉及从含有抗-a和抗-b抗体的样品中去除该二者的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法利用顺次使用本文所述的层析介质。换句话说，首先将样品与含有血型a抗原配体的本文所述层析介质接触，随后是含有血型b抗原配体的本文所述层析介质；又或者，首先将样品与含有血型b抗原配体的本文所述层析介质接触，随后是含有血型a抗原配体的本文所述介质。在其它实施方案中，将样品与两种介质的混合物接触，其中所述在单一步骤中去除抗-a和抗-b抗体二者。在另外的实施方案中，本文所述的方法涉及使用这样的层析介质，其包括以至少0.8mg/ml的配体载荷附着至相同固体支持物的血型a抗原和血型b抗原配体。本文还描述了在使用之后将含有本文所述的层析介质的层析柱消毒的方法，其中所述方法包括将所述柱与包含磷酸、乙酸和苯甲醇(pab)的溶液接触至少三小时，并且其中所述层析介质包含固定至固体支持物上的血型a抗原配体和/或血型b抗原配体，以及另外其中所述层析介质在暴露于pab之后还保留其去除抗a和/或抗b抗体的能力。另外，本文所述的实施方案涉及清洁含有本文所述层析介质的层析柱的方法，其中使用酸或碱溶液。在一些实施方案中，提供了清洁包含介质的层析柱的方法，其中所述介质含有固定至固体支持物上的血型a抗原配体和/或血型b抗原配体，其中所述方法利用在纯化循环之间将含有层析介质的层析柱与酸或碱溶液接触，其中所述层析介质即使在延长暴露于酸或碱溶液之后(例如，50小时或更久)仍保持其去除抗a或抗b抗体的能力。在一些实施方案中，所述介质在2个纯化循环之后、或5个纯化循环之后、或10个纯化循环之后、或15个纯化循环之后、或20个纯化循环之后、或25个纯化循环之后、或30个纯化循环之后、或35个纯化循环之后、或40个纯化循环之后、或45个纯化循环之后、或50个纯化循环之后、或超过50个纯化循环之后、或者甚至超过100个纯化循环之后，保持其去除抗a或抗b抗体的能力，其中在纯化循环之间用酸或碱溶液清洁所述层析柱，并且典型的循环可以由暴露于清洁剂30分钟组成。本文所述的介质也可用于从澄清的细胞培养物添料中纯化单克隆抗-aigm或单克隆抗-b抗体。在一些实施方案中，提供了从澄清的细胞培养物添料纯化单克隆抗-aigm抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供含有单克隆抗-aigm抗体的澄清的细胞培养物添料；(b)将所述添料与以至少0.8mg/ml的配体载荷具有附着至固体支持物的血型a抗原配体的介质温育，以促进抗-aigm抗体结合至介质；(c)用具有3.5-9.0范围的ph的水成缓冲液洗涤所述介质；(d)用具有2.0-3.0范围的ph的缓冲液从所述介质洗脱抗-aigm抗体，由此获得洗脱物；和(e)回收洗脱物中纯化的抗-aigm抗体。在其它实施方案中，提供了从澄清的细胞培养物添料纯化单克隆抗-bigm抗体的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供含有单克隆抗-bigm抗体的澄清的细胞培养物添料；(b)将所述添料与以至少0.8mg/ml的配体载荷具有附着至固体支持物的血型b抗原配体的介质温育，以促进抗-bigm抗体结合至介质；(c)用具有3.5-9.0范围的ph的水成缓冲液洗涤所述介质；(d)用具有2.0-3.0范围的ph的缓冲液从所述介质洗脱抗-bigm抗体，由此获得洗脱物；和(e)回收洗脱物中纯化的抗-bigm抗体。在一些实施方案中，所述介质包装在层析柱中，并且含有抗-aigm单克隆抗体或抗-bigm抗体澄清的细胞培养物添料流经所述柱。附图简述图1是代表性的寡糖配体，其结合抗a抗原抗体。图2是代表性的寡糖配体，其结合抗-b抗原抗体。发明详述近来对于用来从静脉注射用免疫球蛋白(ivig)中去除抗-a和抗-bigg抗体的合成免疫吸附剂层析介质的应用有着日益增加的兴趣，所述注射用免疫球蛋白(ivig)由提取自汇集的血浆的浓缩多价igg抗体组成，所述汇集的血浆得自若干供血者，有时可多达上千或者超过上千的供血者。然而，大多数商业可用的层析介质收到其可以使用的操作条件的限制。本文所述的实施方案涉及用于从样品中去除抗a或抗b抗体的新型层析介质。本文所述的层析介质与此前描述的层析介质相比具有若干优势。例如，所述层析介质可用于大规模操作，其中所述介质可以在大范围的ph条件下容易地洗脱和原处(inplace)清洁多次，而不损失其从样品(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物、或ivig添料)中去除抗a或抗b抗体的能力。另外，用于本文所述层析介质的载荷条件可跨越3.5-9的ph范围并且洗脱条件可以跨越2-4的ph范围。因为本文所述的层析介质可以在广阔范围的ph条件下使用、于原处清洁以及消毒，它们在操作者使用所述介质时提供了操作条件上很大的灵活性。本文所述的层析介质可以使用磷酸-乙酸-苯甲醇(pab)缓冲液进行消毒，该缓冲液此前未有描述可于原处清洁可用于去除抗-a和抗-b抗体的介质。如本文的实施例所证实的，发现了本文所述的层析介质即使在暴露于pab达150小时后仍保持其性能。本发明至少是基于令人吃惊的而且出乎意料的以下发现：可用于从样品中去除抗a或抗b抗体的层析介质可以用酸和碱溶液清洁。为使本文公开的实施方案可以更容易地理解，首先对某些术语进行了定义。另外的定义在发明详述的各处进行说明。i.定义术语“结合能力”是指包装在柱中并继而在适宜条件下运行的给定体积介质所结合的分子的量。任何介质的结合能力都高度依赖于所处的条件。一般而言，样品的流速越低，结合能力越高。随着流速接近零，结合能力达到可用能力的最大值。本文所述的层析介质的结合能力是基于抗a或抗b抗体的量，所述层析介质在设定的流速可以结合每体积的介质。未经适当的清洁和消毒，层析介质(包括亲和层析介质)的结合能力，通常会跌至低于初始值。另外，层析介质一般在暴露于酸或碱溶液后趋向于损失结合能力。当结合能力低于期望值时，显著量的本应被介质结合的分子可“突破”、或与流出部分共同洗脱，这是非常不期望的。本文所述的实施方案提供了用于从样品(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物和ivtg添料)中去除抗a和/或抗b抗体的亲和层析介质，其即使在酸性或碱性条件下清洁后或者用pab消毒后仍会保持其结合能力。术语“静态结合能力”定义为由层析介质(例如，本文所述的亲和层析介质)所吸收的蛋白质(例如，在此情形中为抗a和/或抗b抗体)的质量除以所使用的层析介质的体积。用于测量层析介质静态结合能力的示例性方法如下。在将层析介质与已知浓度的蛋白溶液接触后，使该溶液与层析介质温育以促进蛋白质结合至层析介质(例如，在此情形中为抗a和/或抗b抗体)。温育时间可以变化(例如，5分钟至72小时)并且可以由本领域技术人员容易地确定，例如，通过测量周期性地测量上清中蛋白的浓度(例如，通过在280nm处测量光吸收)直至上清中的浓度不再有可测量的变化。一旦结合至层析介质的蛋白质与溶液中的蛋白质达到平衡，再一次测量上清中蛋白溶液的浓度。继而通过蛋白的起始量(温育之前)减去上清中蛋白的量(温育之后)，再除以所使用的层析介质的体积来测量静态结合能力。特定层析介质的静态结合能力一般会受到蛋白溶液组成的影响，包括以下的一或多种因素：例如，蛋白质的浓度、所使用的层析介质的量、溶液中其它组分的浓度(盐、有机分子、缓冲液)、溶液的ph和导电性。其也会受到蛋白溶液温度的影响。所有这些变量一般都会保持恒定，以便可以比较两种不同的层析介质的静态结合能力。术语“静态结合能力”也可以称为“饱和结合能力”或者“最大结合能力”。可以通过使浆液中的层析介质沉淀至容器或柱的底部而获得与层析介质接触的样品的上清。可以通过将层析介质的浆液离心或者通过震动来使所述沉淀过程加速。继而可以通过由移液管、注射器或者泵转移至分离的容器来将所述上清溶液与所述层析介质分离。在一些实施方案中，也可以在于样品温育之后，通过膜或者多孔材料过滤层析介质的浆液来获得所述上清。术语“动态结合能力”定义为，在层析柱中存在的蛋白质溶液的浓度达到某浓度(通常是起始浓度的预定的百分比)时的节点，含有本文所述层析介质的层析柱在流动条件下所结合的蛋白质(例如，在此情形中为抗a和/或抗b抗体)的量。在实践中，此预定百分比倾向为起始浓度的大约10％。继而将蛋白的此质量除以层析柱中层析介质的体积。层析介质的动态结合能力一般会受到所使用的蛋白溶液组成的影响，包括以下的一或多种因素：例如，蛋白质的浓度、溶液中其它组分的浓度(盐、有机分子、缓冲液)、溶液的ph和导电性。动态结合能力还可以受到柱进行装载时的温度的影响以及受到蛋白溶液装载至柱上时的流速的影响。降低蛋白质溶液至层析柱中的流速会提高所测量的动态结合能力。相反，提高蛋白质溶液至层析柱中的流速会降低所测量的动态结合能力。动态结合能力不应超过静态结合能力，因为层析介质的动态能力受到质量迁移整体速度的限制。术语“样品”定义为含有至少一种要结合至本文所述层析介质的目标蛋白质(例如，在此情形中为抗a和/或抗b抗体)的溶液。在一些实施方案中，所述目标蛋白质是抗体或者免疫球蛋白。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白是血型a抗原抗体(也即，抗-a抗体)。在其它实施方案中，所述免疫球蛋白是血型b抗原抗体(也即，抗-b抗体)。样品的实例包括但不限于：血液、血浆、血浆衍生物、血液制品、静脉注射用免疫球蛋白添料(ivig或ivig添料)。术语“去除”如本文所用是指在样品与本文所述的层析介质接触之后，所述样品中存在的抗a或抗b抗体的量的实质性降低。在一些实施方案中，抗a或抗b抗体的量与起始量相比降低至少50％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或超过95％。可以使用本领域已知的或者本文所描述的那些方法，来测量与本文所述的层析介质接触之前和之后的抗a和/或抗b抗体的量。例如，在与本文所述的层析介质温育之前和之后，可以使用凝集测定来测量样品中抗a或抗b抗体量，例如，europeanpharmacopoeia(2.6.20)中所描述的直接coombs测试(dct)和间接coombs测试(ict)。然而，dct和ict都具有高度的可变性并且难以标准化(thorpesjetal.,voxsanguinis2009,97,160–168)。如本文所述，在用本文所述的层析介质纯化后，使用流式细胞术来测量从样品(例如，ivig添料)中所去除的抗a或抗b抗体的量。使用红血细胞来捕获血型抗体的流式细胞术方法在文献中有很好的记载(christenssonetal.,transfusion1996；36:50-505,dhainautetal.,2013；104:115–126)。如本文所述，将ivig样品与a型或b型红血细胞温育给定的时间，深入洗涤，并用荧光标记的次级抗体(f(ab’)2山羊抗-人iggh+l,jacksonimmunoresearch)染色。将样品稀释至对流式细胞术测量最佳的浓度。通过流式细胞仪(guava5ht,emdmillipore)评估样品的平均荧光强度(mfi)。净mfi用于比较在与含有血型a抗原配体或血型b抗原配体的本文所述层析介质接触之前和之后、以及暴露于或未暴露于酸性或碱性条件时，样品(例如，ivig添料)中的抗-a或抗-b。通过比较流出液(或上清)中抗a或抗b抗体的水平与样品中抗a或抗b抗体的水平，来计算抗a或抗b抗体的去除百分比。术语“酸稳定性”定义为，即使在暴露于具有低ph(通常低于4)的溶液50小时后，层析介质从样品中去除实质性百分比的杂质的能力(例如，超过50％或超过60％或超过70％或超过80％或超过90％或更高的抗a和/或抗b抗体去除)。酸稳定的层析介质可以在酸性条件下洗脱/清洁和/或消毒。不是酸稳定的那些层析介质在暴露于酸性条件之后，一般在去除实质性百分比的杂质(也即，在此情形中为抗a和/或抗b抗体)时表现出能力降低。层析介质通常用酸性溶液洗脱和清洁。例如，0.15m磷酸或0.3％v/v盐酸是常用的清洁剂。示例性的洗脱溶液包括，例如，0.1m甘氨酸,ph2.0；0.1m甘氨酸,ph2.2；0.1m甘氨酸,ph2.5；0.1m甘氨酸,ph2.7；和0.1m甘氨酸,ph3.0。然而，大多数商业可得的介质在暴露于此类条件后趋向于损失其从样品中去除杂质的能力。本文所述的层析介质即使在延长的暴露于酸性条件之后(也即，即使在50小时之后或者更久)仍保持其从样品中去除抗-a和抗-b抗体的能力，也即，它们是酸稳定的。可以通过将介质暴露于酸性溶液特定的时间段然后再评估其相对于对照(未暴露于所述酸性溶液)的性能，来评估本文所述层析介质的酸稳定性。对介质性能的评估可包括测量结合能力、对期望和不期望种类的拆分、杂质的去除、或者其组合。术语“碱稳定性”定义为，即使在暴露于具有高ph(通常高于9)的溶液50小时后，层析介质从样品中去除实质性百分比的杂质的能力(例如，超过50％或超过60％或超过70％或超过80％或超过90％或更高的抗a和/或抗b抗体去除)。碱稳定的层析介质可以在碱性条件下洗脱/清洁和/或消毒。不是碱稳定的那些层析介质在暴露于碱性条件之后，一般在去除实质性百分比的杂质(也即，在此情形中为抗a和/或抗b抗体)时表现出能力降低。层析介质通常用碱性溶液消毒(例如，0.1m或0.5m氢氧化钠)。然而，大多数商业可得的介质在暴露于此类条件后趋向于损失其从样品中去除杂质的能力。本文所述的层析介质即使在延长的暴露于碱性条件之后(也即，即使在50小时之后或者更久)仍保持其从样品中去除抗-a和抗-b抗体的能力，也即，它们是碱稳定的。可以通过将介质暴露于碱性溶液特定的时间段然后再评估其相对于对照(未暴露于所述碱性溶液)的性能，来评估本文所述层析介质的碱稳定性。对介质性能的评估可包括测量结合能力、对期望和不期望种类的解析度、杂质的去除、或者其组合。在一些实施方案中，碱或酸稳定性是指，即使在分别暴露于碱性或酸性溶液5小时之后、或10小时之后、或15小时之后、或20小时之后、或25小时之后、或30小时之后、或40小时之后、或50小时之后、或60小时之后、或70小时之后、或80小时之后、或90小时之后、或100小时之后，本文所述的层析介质保留其结合能力的至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的能力。在另一实施方案中，碱或酸稳定性是指，即使分别暴露于碱性或酸性溶液5小时或10小时或15小时或20小时或25小时或30小时或40小时或50小时或60小时或70小时或80小时或90小时或100小时或者更久，配体初始结合能力的降低了少于70％、或少于60％、或少于50％、或少于40％、或少于30％。术语“初始结合能力”如本文所用是指，在介质暴露于酸性或碱性条件之前，单位体积的本文所述层析介质所能捕获的抗a或抗b抗体的量。在一些实施方案中，本文所述的层析介质能够承受延长的时间的酸或碱清洁和/或消毒，这使得所述层析介质成为有吸引力的候选，特别是对于从样品中有成本效益地去除抗a和/或抗b抗体(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物、或ivig添料)。术语“配体载荷”如本文所用是指，在将配体固定至固体支持物上的偶合反应期间，每单位体积的固体支持物所使用的配体的量。配体载荷测量为沉积体积的固体支持物的mg/ml或gm/升。在一些实施方案中，所述配体载荷为至少0.8mg/ml或至少1mg/ml或至少1.1mg/ml或至少1.2mg/ml或至少1.5mg/ml或1.65mg/ml或者更高。在特定的实施方案中，所述配体载荷对于血型a抗原配体的情形为至少1.65mg/ml，或者对于血型b抗原配体的情形为至少1.2mg/ml。可以通过使固体支持物经重力在固定小时内沉积成含有储存缓冲液或水的泥浆，来确定固体支持物的沉积体积。术语“介质”或“层析介质”在本文中可互换使用，是指其上固定有血型a抗原配体和/或血型b抗原配体的固体支持物，其中是以至少0.8mg/ml固体支持物的配体载荷。在一些实施方案中，接头用于固定，其可以是配体本身的一部分或者是分离的实体。术语“接头”定义为将血型寡糖抗原配体化学连接至用于固定至固体支持物上的官能团的种类。此类接头的非限制性实例包括(ch2)n、(ch2)m-o-(ch2)n、(ch2ch2o)n、(ch2)m-conh、(ch2)m-nr-(ch2)n、(ch2)m-nh-co-nh-(ch2)n、(ch2)m-nh-(ch2)n、and(ch2)m-conh-(ch2)n、(ch2)m-cos、(ch2)m-s-(ch2)n、(ch2)m-s-co-s-(ch2)n、和(ch2)m-cos-(ch2)n其中m和n的范围可以是1-22。术语“层析”如本文所用是指从样品中的其它分子分离或者去除分子(例如，在此情形中为抗a和/或抗b抗体)的动态分离技术。通常，在层析方法中，移动相(液体或气体)将含有待分离或待去除分子的样品转移穿过固定相(通常为固体)介质(例如，层析介质)。对于固定相的隔离性或亲和性的差异将分子从样品的其它组分分离出来。术语“亲和层析”如本文所用是指如本文所用是指层析的模式，其中待分离或者待去除的分子(例如，抗a和/或抗b抗体)是通过其与另外的分子(例如，固定至固体支持物上的血型a抗原配体或血型b抗原配体)的相互作用分离，所述另外的分子特异性地与所述待分离或者待去除的分子相互作用。术语“igg”、"免疫球蛋白"、"ig"或"抗体"(本文中可互换使用)是指具有两个重链和两个轻链组成的基础四个多肽链结构的蛋白质，所述链例如通过链间二硫键来稳定，其具有特异性地结合抗原的能力。术语"单链免疫球蛋白"或"单链抗体"(本文中可互换使用)是指具有重链和轻链组成的两个多肽链结构的蛋白质，所述链例如通过链间肽键来稳定，其具有特异性地结合抗原的能力。术语"结构域"是指包含肽环的重链或轻链多肽的球形区(例如，包含3至4个肽环)，其中例如是通过例如β-折叠片层和/或链间二硫键而稳定的。结构域在本文中进一步称作"恒定"或"可变"，这是基于在"恒定"结构域的情况中各个类别成员的结构域内相对缺乏的序列差异，或者在"可变"结构域情况中各个类别成员的结构域内显著差异。抗体或多肽"结构域"在本领域中常常可互选地称作抗体或多肽"区"。抗体轻链的"恒定"结构域可互换地称作"轻链恒定区"、"轻链恒定结构域"、"cl"区或"cl"结构域。抗体重链的"恒定"结构域可互换地称作"重链恒定区"、"重链恒定结构域"、"ch"区或"ch"结构域。抗体轻链"可变"结构域可互换地称作"轻链可变区"、"轻链可变结构域"、"vl"区或者"vl"结构域。抗体重链的"可变"结构域可互换地称作"重链可变区"、"重链可变结构域"、"vh"区或者"vh"结构域。免疫球蛋白或抗体可以是单克隆的或多克隆的并且可以单体或者多聚体的形式存在。术语“igm”或“免疫球蛋白m”是指具有五聚体结构的抗体，例如，血清中发现的igm抗体。具有大约970kda的分子量，igm抗体要比具有单体结构以及大约150kda的分子量的igg大得多。与具有2个抗原结合位点的igg抗体不同，igm抗体具有10个抗原结合位点。igm抗体主要在受血者从不相容的供血者接受输血时，负责红血细胞的凝集。例如，具有血型a以及具有抗-bigm抗体的人在接受来自血型b供血者的输血时将会经历凝集。大的igm抗体一般可通过分馏而与血浆中较小的igg抗体分离。在从样品中去除抗a和/或抗b抗体之外，本文所述的组合物也可用于获得纯化的抗-aigm抗体或纯化的抗-b抗体。在一些实施方案中，分别使用本文所述的血型a抗原配体介质或血型b抗原配体介质，从表达抗-aigm抗体或抗-bigm抗体的澄清的细胞培养物中分离抗-aigm抗体或抗-bigm抗体。纯化igm抗体的示例性的方法如下。使10mmpbs中的表达igm抗体的澄清细胞培养物流过含有血型a抗原配体介质或血型b抗原配体介质的柱。随后用ph范围3.0-9.0的水成缓冲液洗涤所述柱。用ph范围2.0-3.0的酸性缓冲液从柱上洗脱结合至柱的抗-aigm抗体或抗-b抗体。本文所述的介质可用于获得抗-aigm或抗-bigm抗体，其具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或超过95％的纯度(由分析性大小排阻层析所确定)。在一些实施方案中，igm抗体的纯度为至少95％，由分析性大小排阻层析所确定。在一些实施方案中，所述纯化的抗-aigm抗体或抗-bigm抗体用作模型分子来评价含有血型a抗原配体或血型b抗原配体的层析介质的质量，如2015年9月8日提交的美国临时专利申请62/215,423所描述。术语“纯化”或“纯化的”或“纯度”如本文所用是指，在包含目标分子和一或多种杂质的样品中提高该分子的浓度。通常，通过从样品中去除(完全地或部分地)至少一种杂质来提高目标分子的纯度。在一些实施方案中，分子的纯度(例如，此情形中的igm抗体)测量为“百万分之几”或“ppm”。在一些实施方案中，单位ppm是指每个目标分子(例如，单克隆igm)纳克/毫克杂质的量(例如，宿主细胞蛋白(hcp)，其中所述目标分子和hcp在溶液中。在一些实施方案中，使用本文所述的组合物，将单克隆igm-a或igm-b抗体的纯度提高至至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或者更高。术语“澄清”或“澄清的”如本文所用是指用于去除细胞培养物添料中悬浮的颗粒或胶体的方法，由此降低含有目标分子的溶液的浊度(例如，含有igm抗体的细胞培养物添料)，通常测量为ntu(比浊法浊度单位)。可以通过各种措施实现澄清，包括离心或者过滤。离心可以分批的或者连续的模式进行，而过滤可以正常流(例如深度过滤)或者切向流的模式进行。在如今的工业中所使用的方法中，离心之后通常跟着进行深度过滤，以便去除不可溶杂质，其不能由离心去除。另外，可以使用用于增强澄清效力的方法，例如沉淀。杂质的沉淀可以通过各种措施来进行，如通过絮凝作用、ph调节(酸性沉淀)、改变温度、由于刺激响应性聚合物或小分子的相变、或者这些方法的任意组合。在本文所描述的一些实施方案中，澄清涉及离心、过滤、深度过滤和沉淀中的任何一种或多种。术语“载荷ph”是指含有抗a和/或抗b抗体的样品(其与本文所述的层析介质温育)的ph。在一些实施方案中，与本文所述的层析介质温育的样品ph范围是大约4.5至大约9.0(对于适宜用于去除抗-a抗体的介质)，以及大约ph4.0至大约9.0(对于适宜用于去除抗-b抗体的介质)。预期在这些条件下，样品中抗a或抗b抗体的量相对于样品接触介质之前降低了至少50％。如本文所用，术语“清洁”是指在层析方法中，涉及去除使用后的亲和层析柱上(例如，用于去除抗a和/或抗b抗体的含有本文所述的层析介质的柱)残留的痕量水平的杂质的步骤，以便保留柱和其中所含介质的性能和完整性。当清洁步骤从柱去除杂质时，理想情况应该对柱的性能影响最小(使用层析介质的结合能力测量)。大多数商业可得的层析介质使用酸性溶液或碱性溶液来进行清洁。然而，大多数商业可得的层析介质在极端的ph下不稳定，并且因而不能使用酸性和碱性两种条件清洁。本文所述的层析介质可以使用酸性和碱性两种溶液进行清洁。清洁溶液的实例包括酸溶液如0.15m的磷酸或0.3％v/v的盐酸。如本文所用，术语“原处清洁”或“cip”是无需拆开而清洁管、器皿、加工装置、过滤器和相关配件的内部的方法。使用cip的益处在于，清洁更快、劳动密集性更低并且更加可重复、以及带给人们更低的化合物暴露风险。对于层析柱，cip是指不拆开柱而清洁层析介质以及柱体和末端配件。通常，运行之后经清洁的层析柱立即进行平衡以用于下次运行。如本文所用，术语“行动(campaign)”是指若干轮的个别纯化过程，一个接一个的进行，以便加工出期望质量的样品。对于从样品中去除抗a和/或抗b抗体的情形，行动通常涉及使用亲和层析步骤来去除抗a和/或抗b抗体以及一或多个下游步骤，其可用于达成治疗性组合物，例如，用于注射至患者，或者达成具有期望的组分的组合物。此类下游步骤可以根据行动的目标在终端用户之间有变化。虽然，清洁常规是在行动中于运行之间进行，但是当行动完成时，要将层析柱进一步消毒用于储存，因为通常所述柱在下次行动中会使用，这会是几天后或者几周后或者几个月后。术语“洗脱”是指纯化过程中的步骤，其中本文所述的层析介质与洗脱缓冲液接触以去除结合至介质的杂质(也即，抗-a和/或抗-b)。洗脱缓冲液的实例包括0.1m甘氨酸,ph2.0；0.1m甘氨酸,ph2.2；0.1m甘氨酸,ph2.5；0.1m甘氨酸,ph2.7；0.1m甘氨酸,ph3.0。如本文所用，术语“消毒”是指完成行动之后的步骤，并且其设计用于将微生物群体降低至认为安全或者可接受的水平(由fda其它管理机构确定)。消毒通常通过加热或者化合物来实现。要储存待下次行动使用的层析柱通常用化学措施来消毒，这是由于加热消毒不实用。大多数亲和层析柱是使用高达0.5m的naoh进行消毒。然而，0.5m的naoh也已知会降低层析介质的性能。在本文所描述的一些实施方案中，包含磷酸、乙酸和苯甲醇(pab)的溶液被用于消毒。具体而言，本文所述的层析介质即使在用pab消毒之后，仍保持其结合能力或者去除实质性的量的抗a和/或抗b抗体的能力。术语“抗-a”或“抗-a抗体”是指这样的抗体，其结合在具有a血型或ab血型的个体的细胞表面上发现的血型a抗原。因此，期望在血液衍生的样品中去除此类抗体(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物、或ivig添料)。术语“抗-b”或“抗-b抗体”是指这样的抗体，其结合在具有b血型或ab血型的个体的细胞表面上发现的血型b抗原。因此期望在血液衍生的样品中去除此类抗体(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物或ivig添料)。ii.示例性的配体本文所述的组合物可用于从样品(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物、或ivig添料)中去除抗a或抗b抗体。本文所述的组合物包括基于寡糖的配体(附着至适宜的固体支持物)。示例性的基于寡糖的配体在下文给出。示例性的基于寡糖的配体在下文给出。结构中所使用的缩写定义如下：gal＝d-半乳糖，fuc＝l-岩藻糖，galnac＝n-乙酰基-d-半乳糖胺，glcnac＝n-乙酰基-d-葡萄糖胺，r＝从配体至固体支持物的连接(但配体结构上其它未知的连接也会用到)。a血型抗原配体的实例包括但不限于具有以下结构的分子：三糖抗原a(galnacα1,3[fucα1,2]galβ–r),、1型四糖抗原a(galnacα1,3[fucα1,2]galβ1,3glcnacβ1–r)、2型四糖抗原a(galnacα1,3[fucα1,2]galβ1,4glcnacβ1–r)、3型四糖抗原a(galnacα1,3[fucα1,2]galβ1,3galnacα1–r)、和4型四糖抗原a(galnacα1,3[fucα1,2]galβ1,3galnacβ1–r)。在特定的实施方案中，所述配体是三糖抗原a(galnacα1,3[fucα1,2]galβ–r)，其附着至固体支持物。b血型抗原配体的实例包括具有以下结构的分子：三糖抗原b(galα1,3[fucα1,2]galβ–r)、1型四糖抗原b(galα1,3[fucα1,2]galβ1,3glcnacβ1–r)、2型四糖抗原b(galα1,3[fucα1,2]galβ1,4glcnacβ1–r)、3型四糖抗原b(galα1,3[fucα1,2]galβ1,3galnacα1–r)、和4型四糖抗原b(galα1,3[fucα1,2]galβ1,3galnacβ1–r)。在特定的实施方案中，所述配体是附着至固体支持物的三糖抗原b(galα1,3[fucα1,2]galβ–r)。iii.示例性的固体支持物一或多种上述配体可以至少0.8mg/ml固体支持物的配体载荷附着至适宜的固体支持物，由此得到适用于去除血型a和/或血型b抗原抗体的层析介质。固体支持物的实例包括但不限于氧化铝、硅石、硅藻土、陶瓷、金属氧化物、多孔玻璃、可控孔径玻璃、碳水化合物聚合物、多糖、琼脂糖、交联琼脂糖、交联葡聚糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、几丁质、沸石、合成聚合物、聚乙烯醚、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚马来酸酐、膜、空心纤维、以及纤维。在一些实施方案中，所述固体支持物是多孔或非多孔聚合物固体支持物并且包含选自以下组的聚合物：聚乙烯醚、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚碳酸酯。在特定的实施方案中，所述固体支持物是基于聚乙烯醚的固体支持物。在一些实施方案中，所述固体支持物是珠的形式(例如，基于聚乙烯醚的多孔珠)。iv.将配体附着至固体支持物的方法可以利用无数的官能团来促进配体附着至固体支持物。此类官能团的非限制性性实例包括胺、硫醇、呋喃、马来酰亚胺、环氧树脂、醛、烯、炔、叠氮、吖内酯、羧基、活性酯、三嗪、和磺酰氯。在特定的实施方案中，使用胺基作为官能团。所述固体支持物也可以经修饰和/或激活以包括一或多个上文所述的促进适宜的配体或多个配体固定至支持物官能团。在特定的实施方案中，使用还原胺化化学来修改所述固体支持物，其中所述固体支持物经衍生化以提供用于配体固定的醛基。此种衍生化通过以下来实现：首先修饰固体支持物(例如，基于聚乙烯醚的珠)以包括环氧基团，其进一步水解以产生二醇基团。所述二醇基团随后被还原成醛基。含有醛的固体支持物(例如，固体支持物其醛密度为大约或高于1μmol/ml的固体支持物)继而以期望的配体载荷(例如，至少0.8mg/ml)经历固定步骤(经醛和胺基之间的还原胺化反应)。在特定的实施方案中，用聚合物触角化学来修改固体支持物，其中所述固体支持物经衍生化以包括羧酸基团以用于配体固定步骤。此种衍生化是通过如下来实现的：首先使用铈-起始的多聚化方法从固体支持物(例如，基于聚乙烯醚的珠)的表面多聚化适宜的单体(例如，丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯)。含有羧酸的固体支持物(例如，固体支持物其羧基密度为大约或高于1μmol/ml的固体支持物)以期望的配体载荷(例如，至少0.8mg/ml)经历固定步骤(经羧酸和胺基之间的标准酸-胺偶合化学)。经活化羧基的配体固定也可直接应用于固体支持物表面而无触角形成。v.用于测量抗-a和抗-b抗体的去除百分比的测定法本文所述的层析介质可用于从样品中(例如，血液、血液制品、血浆、血浆衍生物、或ivig添料)去除抗a和/或抗b抗体。本文所述的层析介质包括附着至固体支持物的血型a抗原配体和/或血型b抗原配体(以至少0.8mg/ml固体支持物的配体载荷)，并在可以对其进行使用、清洁和/或消毒的操作条件的范围方面提供了更高的灵活性。具体而言，本文所述的层析介质在酸性和碱性条件下展现出稳定性，即使是更长时间地暴露于此类条件。因此，本文所述的层析介质在暴露于酸性或碱性条件后，保持其从样品中去除抗-a和抗-b抗体的能力。一般而言，从样品中去除抗a或抗b抗体的百分比可以如下进行测量。将含有所述分子的样品与在适当条件下与适宜的介质接触适于该分子结合至所述介质的时间。之后，将结合至介质的分子从剩余的样品溶液分离，并测量剩余样品溶液中该分子的浓度(也即未结合的分子的浓度)。溶液中分子的浓度可以通过若干本领域已知的不同方法来确定。抗-a和抗-b抗体的浓度也可以通过如下来确定：使用红血细胞凝集测定、流式细胞术测定如基于红血细胞的荧光激活细胞分选(facs)的那些、以及使用基于抗原的材料的酶联免疫吸附测定(elisa)。在本文描述的方法中，在暴露或未暴露于酸性或碱性条件时，测量层析介质从样品中去除抗-a和抗-b抗体的能力。通过以下实施例对实施方案进行进一步说明，所述实施例不应理解为限制。在本身请全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及附图都援引加入本文。实施例实施例1.使用还原胺化(ra)化学来合成含有三糖a配体的介质通过使用还原胺化化学将tria配体固定至专有的基于聚乙烯醚的多孔固体支持物(以珠的形式)之上，来合成了血型a抗原三糖(tria)配体介质。tria和trib配体的聚体结构分别在图1和2中示出。将配体连接至固体支持物上的羟基基团。将10ml的沉积的珠用异丙醇进行了调理，并转移至反应器皿中。向该反应器皿，加入10ml的异丙醇和0.273ml的32％naoh溶液。在室温将悬液搅拌30分钟，随后向该悬液加入1.22ml的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(budge)。在室温将该悬液搅拌了5小时。使用过滤组件以水洗涤所述悬液3次。将湿的珠转移回反应器皿。加入了11.8ml的水和0.26ml的冰乙酸，并在室温将悬液再搅拌30分钟。接着用水洗涤所述珠3次，并将其转移回反应器皿。将17ml的0.5m硫酸添加至所述珠，并在75℃将该悬液搅拌2小时。将所述珠洗涤若干次以将悬液的ph调节为4至5。使用过滤器组件吸出溶液，并将湿的珠转移回反应器皿。向该反应器皿加入10ml的2.5％偏高碘酸，在室温将所述悬液搅拌2.5小时。最后，用水将所述珠洗涤5次，以导致醛-修饰的聚乙烯醚基质珠，其适宜用来与配体a或b偶合。将10ml醛-修饰的湿基质珠转移至反应器皿。向此器皿加入了16.5mg的三糖a、10ml的0.1mnahco3和150mg的氰基硼氢化钠。在室温将所述悬液搅拌16小时。将400mg的甘氨酸加入至反应器皿并将悬液在室温继续搅拌至少2小时。将所得的含有tria配体的层析介质用水洗涤5次以及用tris缓冲液在ph＝8洗涤3次。该介质进一步用0.05m乙酸溶液洗涤3次以及用水洗涤3次，并最终储存在20％的乙醇溶液中。随后评估了介质从ivig添料去除抗-a抗体的能力(有和无暴露于酸性或碱性条件)，如下文中随后的实施例中所描述的。实施例2.使用还原胺化(ra)化学来合成含有三糖b配体的介质含有三糖b配体的介质的制备类似于含有三糖a配体的介质，如上文所述。如上文所制备的10ml醛-修饰的湿基质珠被转移至反应器皿。向此器皿加入了12.0mg的三糖b、10ml的0.1mnahco3和150mg的氰基硼氢化钠。在室温将所述悬液搅拌16小时。将400mg的甘氨酸加入至反应器皿并在室温将所述悬液搅拌了至少2小时。将所得的含有trib配体的层析介质用水洗涤5次以及用tris缓冲液在ph＝8洗涤3次。将所述介质进一步用0.05m乙酸溶液洗涤3次以及用水洗涤3次，并最终储存在20％的乙醇溶液中。随后评估了介质从ivig添料去除抗-b抗体的能力(有和无暴露于酸性或碱性条件)，如下文中随后的实施例中所描述的。实施例3.聚丙烯酸(paa)触角化学合成含有三糖a或b的介质在此代表性实施例中，使用不同的化学，也即paa触角措施，来将三糖a或b配体附着至基于聚乙烯醚的珠。将图1和图2所示的血型a和b抗原配体(三糖a和b)，在两个分离的反应中，用羟基基团连接至基于聚乙烯醚的珠，一个反应用于将三糖a配体附着至珠而另一个则用于将三糖b配体附着至珠。在合成的第一步，将珠修改以包括羧基，以用于与图1和2所示的配体的胺基反应。将10ml的沉积的珠用水调理，并转移至反应器皿中。如下制备了两种溶液，也即“单体溶液”和“起始溶液”。10ml的单体溶液通过混合以下进行制备：0.137ml的丙烯酸、0.1ml的65％硝酸溶液和9.763ml的水，而10ml的起始溶液通过混合如下进行制备：0.33gm的硝酸铈铵、0.1ml的65％硝酸溶液和9.1ml的水。将所述单体溶液添加至含有湿珠的反应器皿。用氮气将所述悬液和起始溶液净化大约15分钟。接着将起始溶液转移至反应器皿，并在40℃氮气氛围下将悬液搅拌了4小时。用水将所述珠洗涤7次、用0.2m的抗坏血酸和1m的硫酸溶液洗涤了10次、用水洗涤5x次、用pbs缓冲液洗涤2次，以及最后用水洗涤3次。将10ml的paa-修改的湿珠转移至两个分离的反应器皿。向一个器皿加入16.5mg的三糖a、10ml的0.01mnahco3和0.1mg的1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)。向另一个器皿加入了12.0mg的三糖b、10ml的0.01mnahco3和0.1mg的edc。在32℃将该两种悬液搅拌16小时。将所得的层析介质用0.01mnahco3洗涤3次以及用水洗涤3次，并用过滤器组件吸走洗涤溶液。再次将所述介质转移回反应器皿，并将0.01mnahco3中5％v/v的乙醇胺溶液加至每个器皿。在室温将悬液搅拌16小时，并用水将介质洗涤5次。最终，将介质储存在20％的乙醇中。含有三糖a配体或b配体的介质(用上文所述的paa触角措施制备)，随后分别评估其从ivig添料中对抗a或抗b抗体的去除(有和无暴露于酸性或碱性条件)，如下文中随后的实施例中所描述的。实施例4.添料载荷ph对抗a或抗b抗体去除的作用在ph3.5至ph9.0的样品条件范围证明了使用本文所述的介质对抗a或抗b抗体的去除。将含有抗a或抗b抗体的样品(代表性的ivig添料)透析至具有范围在3.5-9.0的不同ph的缓冲液中。随后将以不同的附着化学制备的介质样品与具有变化ph值的添料材料接触。如上文所述，对于以ra措施或者paa触角措施制备的层析介质，随后评估了从各种添料材料中对抗a或抗b抗体的去除。使用已建立的流式细胞术方法(christensson,m.etal,transfusion,1996；36:500-505)确定了血型a或b抗原抗体(抗-a/b)的水平。将a型或b型红血细胞与代表性的ivig添料温育预定的时间，随后深度洗涤。细胞继而用荧光标记的抗-人igg染色，并经历流式细胞术(guava5ht,emdmillipore)。净平均荧光强度(mfi)值被用于比较与含有三糖a配体或三糖b配体的介质接触之前和之后ivig添料中抗-a或抗-b多克隆抗体的水平。通过将所得的流出液(或上清)中此类抗体的水平与起始添料材料中的水平进行比较，来计算了抗a或抗b抗体的去除百分比。下表总结了在每个添料载荷ph条件对两种不同的ivig添料材料的抗a或抗b抗体去除百分比。对于这两种添料材料，观察到这样的趋势，较高的ph水平提供了对抗-a和抗-b抗体更大的去除。据观察，4.5以及更高的ph水平提供了超过65％的抗-a去除水平。对于4.0和更高的ph水平，抗-b去除水平超过65％。在更高的ph水平，ph5.0-9.0，对于抗-a和抗-b去除的去除百分比接近90％，由此证明了此种介质在广泛范围的载荷ph有效，并且在较高的载荷ph(例如，ph5-9)也发挥良好的作用。表1.抗a或抗b抗体在不同的添料载荷ph值的去除百分比实施例5.在暴露于pab后评估介质的稳定性在此实施例中，在暴露于通常用于层析材料消毒的pab(120mm的磷酸、167mm的乙酸、2.2％室温苯甲醇)之后，评估了本文制备的不同层析介质的稳定性。评估了如表2所示的具有不同配体载荷水平的介质随两种不同ivig添料样品中抗-a和抗-b的去除。通过以下证明了层析介质的稳定性：延长时间(即，至少50或至少150小时)地将含有三糖a或三糖b配体的介质暴露于pab，并继而评估它们从ivig添料中去除抗a或抗b抗体的能力。如所观测的，含有三糖a和b配体的介质(以ra措施或者paa触角措施制备)，在暴露于pab之后展现出稳定性，也即，从ivig添料去除抗a或抗b抗体的能力。通过评估从ivig添料去除抗a或抗b抗体的能力来测量了介质的稳定性，如下文所述。具体而言，使用已建立的流式细胞术方法(christensson,m.etal,transfusion,1996；36:500-505)确定了血型a或b抗原抗体(抗-a/b)的水平。将a型或b型红血细胞与添料材料温育预定的时间，随后深度洗涤。细胞继而用荧光标记的抗-人igg染色，并经历流式细胞术(guava5ht,emdmillipore)。净平均荧光强度(mfi)值被用于比较与含有三糖a配体或三糖b配体的介质温育之前和之后添料材料中抗-a或抗-b多克隆抗体的水平。通过将所得的流出液(或上清)中此类抗体的水平与起始添料材料中的水平进行比较，来计算了抗a或抗b抗体的去除百分比。如本文中所观察的，含有三糖a或三糖b配体的层析介质在暴露于pab之后分别保持它们去除抗-a和抗-b抗体的能力。与未暴露于pab的对照样品(在下表中表示为“0小时”的)相比，抗-a或抗-b的去除能力未观察到显著的变化。对于添料1，在对照的情形和暴露于pab之后，都去除了大约80％或更高的抗a或抗b抗体。对于添料2，在对照的情形和暴露于pab之后，都去除了大约90％的抗-a或抗-b。表2.在pab暴露之前和之后两种配体载荷水平下抗a或抗b抗体去除的去除百分比实施例6.含有三糖a和三糖b配体的介质在酸性条件下稳定证明了含有三糖a和b配体的本文所述的介质，在暴露于各种酸性和低ph缓冲液之后展现出化学稳定性，例如，0.1m甘氨酸缓冲液ph2.0；0.1m甘氨酸缓冲液ph2.2；0.1m甘氨酸缓冲液ph2.5；0.1m甘氨酸缓冲液ph2.7；和0.1m甘氨酸缓冲液ph3.0。通过以下证明了酸稳定性：将不同的介质暴露于酸性条件指定的时间段(例如至少50小时)，并接着评估该介质从两种添料材料中去除抗-a和抗-b的能力。也评估了没有暴露于任何酸的对照样品对于抗-a和抗-b的去除能力。如本文所观察的，含有三糖a和b配体的介质分别保持了它们去除抗a或抗b抗体的能力，即使是延长时间地暴露于酸性条件下。已经暴露于酸溶液的样品保持了它们从添料材料中去除大约80％或更多的抗-a和抗-b的能力。表3.在酸暴露之后抗a或抗b抗体的去除百分比还证实了，含有三糖a和三糖b配体的介质，在酸性条件下消毒之后，分别保持结合和纯化介质igm-a和igm-b抗体的能力。对于含有三糖a和b配体的本文所述介质，评估了它们在酸性或低ph条件下(例如pab)的稳定性。这通过以下得到了证明：将所述介质暴露于pab特定的时间段，例如至少50小时或150小时，并继而评估igm-a和igm-b结合能力。未暴露于pab的对照样品被用作基础来使用下文的公式计算所保留的结合能力。下表4证明了含有三糖a和三糖b配体的介质在暴露于酸性条件后所保留的igm-a和igm-b的结合能力。表4pab暴露时间(小时)保留的igm-a结合能力(％)保留的igm-b结合能力(％)50961001509595实施例7.含有三糖a和三糖b配体的介质在碱性条件下稳定对于含有三糖a和b配体的本文所述介质，评估了它们在碱性或者高ph条件下(例如，0.5mnaoh)的稳定性。这通过以下得到了证明：将介质暴露于0.5mnaoh指定的时间段(例如至少50小时或150小时)，并接着评估该介质从两种添料材料中去除抗-a和抗-b的能力。也评估了没有暴露于naoh的对照样品对于抗-a和抗-b的去除能力。如本文所观察的，含有三糖a和b配体的介质分别保持了它们去除抗a或抗b抗体的能力，即使是延长时间地暴露于碱性条件下。即使暴露于naoh150小时之后，所述介质仍能够去除大约75％的抗-a和大约88％的抗-b。表5.在暴露于0.5mnaoh之后抗a或抗b抗体的去除百分比在进一步的实验中，显示出含有三糖a和三糖b配体的介质，在碱性条件下消毒后，分别保持了结合和纯化介质igm-a和igm-b抗体的能力。对于含有三糖a和b配体的本文所述介质，评估了它们在碱性或高ph条件下(例如0.5mnaoh)的稳定性。这通过以下得到了证明：将所述介质暴露于0.5mnaoh特定的时间段，例如至少50小时或150小时，并继而评估igm-a和igm-b结合能力。未暴露于naoh的对照样品被用作基础来通过上文实施例所示的公示计算所保留的结合能力。含有三糖a和三糖b配体的介质在暴露于碱性条件之后所保留的igm-a和igm-b结合能力在下表6中示出表6naoh暴露时间(小时)保留的igm-a结合能力(％)保留的igm-b结合能力(％)50941001509297实施例8.配体载荷对于去除抗-a抗体的作用配体载荷对于本文所述的层析介质去除抗-a和抗-b抗体的百分比的作用如下进行确定。将具有不同配体载荷的三糖a或三糖b介质与代表性的ivig添料温育，使用流式细胞术测定法来确定了抗-a抗体的去除，如前文描述的。结果在下表中示出。据发现，随着三糖a配体载荷的提高，对于所测试的配体载荷范围抗-a抗体的％去除提高了。对于paa触角化学，在1.65mg/ml或更高的配体载荷获得了超过70％的抗-a抗体去除，而在2.1mg/ml的配体载荷则获得了超过80％的去除。作为比较，对于ra化学，在1.2mg/ml或更高的配体载荷获得了超过80％的抗-a抗体去除。此结果是相当的出人意料，因为此前，据报道期望会具有较低的配体密度(这意味着较低的配体载荷)，以便使此类介质有效发挥作用(参见，公开号wo2015/001277)。表7.配体载荷对于两种单独介质样品抗-a去除百分比的作用实施例9.配体载荷对去除抗-b抗体的作用研究了配体载荷对于含有trib配体的本文所述层析介质从代表性的ivig添料去除抗-b抗体的能力的作用。此配体载荷的作用通过以下进行了证明：将添料与含有不同配体载荷的介质样品温育，以及接着用流式细胞术测定法测量抗-b去除，如此前所述。结果在下表中示出。观察到，随着三糖b配体载荷的提高，在所测试的配体载荷范围内抗-b抗体的％去除提高。对于paa触角化学措施，在1.2mg/ml或更高的配体载荷获得了超过70％的抗-b抗体去除，而在1.65mg/ml的配体载荷获得了超过80％的去除，以及在2.8mg/ml或更高的配体载荷获得了超过90％的去除。作为比较，对于ra化学，在1.2mg/ml或更高的配体载荷获得超过90％的抗-b抗体去除。如上文所述，此结果是相当的出人意料，因为此前，据报道期望会具有较低的配体密度(者意味着较低的配体载荷)，以便使此类介质有效发挥作用(参见，公开号wo2015/001277)。表8.配体载荷对抗-b抗体的去除百分比的作用实施例10.从样品中顺次去除抗-a和抗-b抗体本文所述的层析介质可以顺次使用，以用于从样品中去除抗-a和抗-b抗体二者。换句话说，可以首选使用用于去除抗-a抗体的层析介质，随后是用于去除抗-b抗体的层析介质。又或者，可以首选使用用于去除抗-b抗体的层析介质，随后是用于去除抗-a抗体的层析介质。在此实验中，首选使ivig添料材料穿过含有层析介质的柱，所述层析介质含有三糖a配体，随后是含有三糖b配体层析介质的分离柱。用流式细胞术确定了抗-a和抗-b抗体的去除。相反的次序也得到了证实，其中所述添料首先与含有三糖b配体的层析介质接触，随后是含有三糖a配体的层析介质。下表显示了使用这些措施从添料去除抗-a和抗-b抗体的总百分比。在使添料材料穿过两种介质之后，至少去除了87％的抗-a抗体。在使添料材料穿过两种介质之后，至少去除了92％的抗-b。表9.顺次使用两种不同的层析介质之后，抗-a和抗-b抗体的去除百分比方法次序％抗-a去除％抗-b去除三糖a→三糖b8795三糖b→三糖a9192实施例11.鼠单克隆igm-a抗体的纯化本文所述的组合物可用于从表达igm抗体的澄清的细胞培养物添料中纯化单克隆igm抗体。此实验描述了从澄清的细胞培养物添料中纯化igm-a抗体。在一些实施方案中，纯化的igm-a分子被用作模型分子来评价含有血型a抗原配体的层析介质的质量，如2015年9月8日提交的美国临时专利申请no.62/215,423中所描述的。血型a抗原鼠单克隆igm抗体(抗-a)从商业可获得的澄清细胞培养物添料中纯化，所述细胞培养物添料含有从克隆birma-1(voxsang.,1991,61:53-58)产生的抗-aigm，其经透析进入10mmpbs缓冲液(产品号:jh-1l-bk,emdmillipore,billerica,ma,usa)。所述抗-a细胞培养物添料经0.22微米的膜过滤，并在其上附着有血型a抗原三糖(tria)配体的介质上经过层析结合/洗脱，如本文所述。用所述tri-a配体介质包装直径10mm的柱至64mm。用10mm的pbs缓冲液平衡该柱(10倍柱体积(cv)，以305.58cm/h，4.0ml/min)，并随后装载10mmpbs中的含有抗-a的澄清细胞培养物添料(40倍cv，229.18cm/h，3.0ml/min)。用10mmpbs缓冲液洗涤该柱(5倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)，随后是10mmpbs缓冲液中的0.5m的氯化钠(10倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)。接着，用0.1m的甘氨酸ph2.7洗脱抗-aigm抗体(9倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)。随后用10mm的pbs缓冲液洗涤柱(10倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)并在进一步使用前用0.5m的氢氧化钠剥离(10倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)。将1ml的2.0mtris碱添加至45ml的所述抗-aigm洗脱液以将其溶液ph提高至6-7。随后用透析管(standardrcdialysistrialkits,spectra/1-3,3.5kmwco,54mmflatwidth,序列号:132725,spectrumlaboratories,inc.ranchodominguez,ca,90220usa)将洗脱液透析至10mmpbs中。在10mmpbs透析后，基于在280nm的1.50的消光系数(根据igm抗体的氨基酸组成确定)发现所得的单克隆抗-aigm溶液具有大约1.1mg/ml的浓度。发现单克隆抗-aigm抗体为97％纯(由分析性大小排阻层析确定)。实施例12.单克隆鼠igm-b抗体的纯化血型b抗原鼠单克隆igm抗体(抗-b)从商业可获得的澄清细胞培养物添料中纯化，所述细胞培养物添料含有从克隆lb-2产生的抗-bigm，其经透析进入10mmpbs缓冲液血型(产品号:jm-1l-bk,emdmillipore,billerica,ma,usa)。所述抗-b细胞培养物添料经0.22微米的膜过滤，并在其上附着有血型b抗原三糖(trib)配体的介质上经过层析结合/洗脱，如本文所述。用所述tri-b配体介质包装直径10mm的柱至64mm。用10mm的pbs缓冲液平衡该柱(10倍柱体积(cv)，以305.58cm/h，4.0ml/min)，并随后装载10mmpbs中的含有抗-a的澄清细胞培养物添料(40倍cv，229.18cm/h，3.0ml/min)。用10mmpbs缓冲液洗涤该柱(5倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)，随后是10mmpbs缓冲液中的0.5m的氯化钠(10倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)。接着，用0.1m的甘氨酸ph2.7洗脱抗-bigm抗体(9倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)。随后用10mm的pbs缓冲液洗涤柱(10倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)并在进一步使用前用0.5m的氢氧化钠剥离(10倍cv，305.58cm/h，4.0ml/min)。将1ml的2.0mtris碱添加至45ml的所述抗-bigm洗脱液以将其溶液ph提高至6-7。随后用透析管(standardrcdialysistrialkits,spectra/1-3,3.5kmwco,54mmflatwidth,序列号:132725,spectrumlaboratories,inc.ranchodominguez,ca,90220usa)将洗脱液透析至10mmpbs中。在10mmpbs透析后，基于在280nm的1.44的消光系数(根据该蛋白的氨基酸组成确定)发现所得的单克隆抗-b鼠igm溶液具有大约1.3mg/ml的浓度。发现单克隆抗-aigm抗体为98％纯(由分析性大小排阻层析确定)。虑及说明书中引用的参考文献的教导而对说明书有了最深入的理解，所述文献在此援引加入本文。说明书中的实施方案提供了对实施方案的说明而不应被理解为限制其范围。本领域技术人员(从业者)可容易地意识到，本公开还涵盖了许多其它的实施方案。所有出版物和参考材料都以其整体援引加入。援引加入的材料与本说明书有冲突或者不一致时，以本说明书为准。本文所引用的任何参考文献并非认可此文献是现有技术。除非另有说明，本说明书(包括权利要求)中所使用的表示成分、细胞培养物、处理条件等等量的所有数字，都理解为在所有情况下都受到术语“大约”的修饰。因此，除非另有说明，数字参数都为大约数，并且可以基于期望的性质(可从本文公开的实施例获得)而改变。除非另有说明，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。本领域技术人员会意识到、或者能够使用不超过常规的实验而确定本文所述具体实施方案的许多等价方案。此类等价方案要涵盖在以下的权利要求中。可以对本文所公开的实施方案做出许多修改和变化而不偏离其精神和范围，这对于本领域技术人员而言是明显的。本文所述的具体实施方案仅仅是以示例性的方式提供而不是要以任何方式进行限制。本说明书和实例要理解为仅仅是示例性的，而本公开的真正范围和精神是由以下的权利要求来指明的。当前第1页12