修饰抗体组合物及其制备和使用方法与流程

本申请是2010年01月12日递交的申请号为201080011779.7，发明名称为“修饰抗体组合物及其制备和使用方法”的分案申请。交叉引用本申请要求享有于2009年1月12日提交的第61/144110号美国临时申请，2009年1月12日提交的第61/1441105号美国临时申请，2009年10月7日提交的第61/249441号美国临时申请以及2009年10月7日提交的第61/249416号美国临时申请的权益，这些临时申请通过引用全部并入本文中。
背景技术：
：以蛋白质为基础的疗法改变了用药的面貌，在各种不同的疾病间发现了各种应用。尤其是以抗体为基础的疗法，已经证明对一些疾病能有效治疗，但是在某些情况下，由于对广泛的靶点表达的毒性限制了其治疗的有效性。然而，对于任何药物，改善其靶点特异性和选择性对药物的需要和需求有极大兴趣，特别是对开发以抗体为基础的结合具有已知靶点的第二代药物。提高抗体对病变的部位靶向性可以减少全身的机制为基础的毒性，并导致更广泛的治疗应用。在小分子药物领域，战略已经发展到提供一个活性化学实体的前体药物。这些前体药物是在一中相对不活泼的(或显着减少活性)的形式供给。一旦供给，前体药物在体内代谢成为活性的化合物。这种药物前体的策略，可以对其预期靶点提供增加的药物选择性并减少不利影响。用于特异性缺氧的肿瘤细胞的药物，通过氧化还原激活的使用，利用存在于缺氧细胞中的大量还原酶将药物转化成其细胞毒素的状态，实质上是使其激活。由于在这种激活之前，前提药物是低毒性的，这显著降低了损害非癌变细胞的风险，从而降低与药物相关的副作用。本领域需要一种为以抗体为基础的疗法提供一种前体药物特性的战略需求。发明简述目前披露的规定修改和激活的抗体治疗和诊断的有用成分。激活的抗体成分，表现出更高的生物利用度和生物分布，相比传统的抗体疗法与药物前体的功能。此外，还提供使用在诊断和治疗，以及筛选和建设等组成的方法。在一方面，本发明提供了一种修饰过的抗体，包括一种抗体或一种抗体片段(ab)，能专门与其靶点结合，能够与以中掩蔽基团耦合(mm)，其中mm对ab的耦合降低ab与其靶点的结合能力以便使耦合了mm的ab对靶点的裂解常数比没有耦合mm的ab对靶点的裂解常数至少大100倍、至少大1000倍、或者至少大10000倍。在另一方面，本发明提供了一种修饰抗体，包括一种抗体或一种抗体片段(ab)，能专门与其靶点结合，能够与以中掩蔽基团耦合(mm)，其中当使用靶点的替代物在体外进行测试时，对比没有耦合mm的ab与其靶点的结合能力，耦合了mm的ab与其靶点的结合能力至少降低90％。这种mm与ab的耦合降低ab与靶点结合能力的时间至少为12小时或至少为24小时或至少为72小时。在另一方面，修饰抗体进一步耦合到一种雷杰基团(cm)。该cm能被酶裂解，或该cm能被一种降低药剂减少，或该cm能被光溶解。该cm能具体地至少在1x104m1s4、或至少在5x104m1s、或至少在10x104m4s的速率下被裂解、减少或光溶解。在一个实施例中，修饰抗体的cm在mm内。在本发明提供的抗体中mm对ab的离解常数(kd)通常比ab对靶点的kd至少大100倍。一般地，mm对ab的kd低于10nm，或低于5nm，或低于1nm。在一些实施例中，修饰抗体的mm通过与ab的抗原结合域特异性结合降低ab与其靶点结合的能力。这种结合可以是非供价的。修饰抗体的mm能在allosterically或空间上降低ab与其靶点的结合能力。在具体的实施例中，修饰抗体的mm不能含有多于50％的与ab的天然结合配体相似的氨基酸序列。在具体的实施例中，修饰抗体的ab是选自由fab'片段、f(ab')2、scfv、scab、dab、单域重链抗体和单域轻链抗体构成的组中的抗体片段。在相关的实施例中，修饰抗体的ab选自表2或ab的来源是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(ctla-4单抗)、阿德木单抗、hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(igfr-1抑制剂)。在一个具体的实施例中，修饰抗体不是阿伦单抗。在相关的实施例中，ab的靶点是选自表1中的靶点多构成的组。在典型的实施例中，靶点是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、转铁蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4、或il4。在一个具体的实施例中，修饰抗体进一步包括一个第二ab，其中该第二ab的靶点是选自表1中的靶点所构成的组。在一个相关的实施例中，cm是一种用于选自表3中的酶所构成的组中酶的底物。在具体的实施例中，cm是一种用于半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的底物。在这样的实施例中，其中修饰过的ab包含一种cm，ab是选自表2中的抗体所构成的组，具体地，选自西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(ctla-4单抗)、阿德木单抗、hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(igfr-1抑制剂)所构成的组。在一个典型的实施例中，ab不是阿伦单抗。在一个实施例中，其中修饰过的抗体包括一个ab，并与一个cm和一个mm连接。在一个实施例中，靶点是选自表1的靶点所构成的组，或靶点是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、转铁蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4。靶点不是cd52。修饰蛋白可进一步于一个第二裂解基团连接，能够专门被一种酶修饰。在该实施例中，该第二裂解蛋白是一种天冬酰胺内肽酶、纤溶酶、tmprss-3/4、mmp-9,mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa、或psa的底物。在另一个具体的实施例中，修饰抗体进一步包括一种连接肽，其中该连接肽位于ab和mm之间。或者该修饰过的抗体进一步包括一种连接肽，其中该连接肽位于mm和cm之间。或者该修饰过的抗体进一步包括一种连接肽，其中该连接肽位于ab和cm之间。或者该修饰过的抗体进一步包括两种连接肽，其中第一种连接肽位于ab和cm之间以及第二种连接肽位于mm和cm之间。连接肽是选自一种裂解连接肽、一种非裂解连接肽、一种分支连接肽所构成的组。在某些实施例中，修饰过的抗体进一步包含一种检测基团。在一个具体的实施例中，该检测基团是一种诊断试剂。在一个优选的实施例中，本发明所述的修饰过的抗体进一步包含一种与ab结合的试剂，在一方面，该试剂是一种治疗药物，例如一种抗肿瘤药。在这中实施例中试剂与ab的以个碳水化合物基团结合，其中碳水化合物基团位于ab的抗原结合地区的外部。或者试剂与ab的巯基结合。本发明提供的修饰过的抗体供给一个有机体时，表现出了至少有5天的血清半衰期。本发明提供的一些修饰过的抗体的mm的共有序列是：cisprgc1c(nzp)h(hvf)(yzt)(fzwztzl)(yzgztzs)(tzszyzh)cgcisprgcg、xcxxyqclxxxxxx,xxqpxpprvxx、pxpgfpycxxxx、xxxxqxxpwpp、gxgxcytilexxcxxxr、gxxxcyxixexxcxxxx、gxxxcyxixexwcxxxx、xxxccxxyxixxccxxx或xxxxxyxilexxxxx。在一个具体的实施例中，该共有序列专门以一个抗-vegf抗体、一个抗-efgr或一个抗-ctla-4抗体结合。在一个相关的方面，本发明提供了一种激活的抗体(aa)包括一种能够特异性与其靶点结合抗体或一种抗体片段(ab)，一种与ab耦合能够抑制ab与其靶点特异性结合的掩蔽基团(mm)，一种与ab耦合能够被酶专门裂解的裂解基团(cm)。其中，对比aa处在裂解cm的足够酶活和mm不抑制ab与其靶点的特异性结合的情况，当aa不处于裂解cm的足够酶活下，mm至少降低ab与其靶点特异性结合程度的90％。在具体的实施例中，降低ab与其靶点特异性结合的时间至少为12小时，或至少为24小时，或至少为72小时。在一个实施例中，在aa中，与耦合了mm的ab对其靶点的离解系数(kd)比没有耦合mm的ab对其靶点的离解系数至少大100倍。在一个相关的实施例中，mm对ab的离解系数(kd)比ab对其靶点的离解系数至少大100倍。一般地，mm对ab的离解系数低于10nm，或低于5nm，或低于1nm。在一些aa的实施例中，mm能与ab的抗原结合域特异性结合。在一些aa的实施例中，cm能大约至少在1x104m1s4、或至少5x104m4s、或至少10x104m4s的速率下被酶特异性裂解。在某些实施例中，aa中的ab是一种抗体片段，该抗体片段选自fab'片段、一种f(ab')2片段、一种scfv、一种scabadab、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组中。在某些实施例中，aa中的ab选自表2中的抗体所构成的组。在具体的实施例中，ab是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(ctla-4单抗)、阿德木单抗、hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(igfr-1抑制剂)。在某些实施例中，aa的靶点选自表1中的靶点所构成的组。在具体的实施例中，靶点是notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、转铁蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4在一个具体的实施例中，ab不是阿伦单抗并且靶点不是cd52。在某些实施例中，aa的cm是一种用于胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的底物。再具体的实施例中，aa进一步与能够被一种酶特异性修饰的一种第二裂解基团(cm)耦合。在该实施例中，第二cm是一种用于胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的底物。在本发明的一些aa的实施例中，cm包含在mm中。在本发明的一些aa的实施例中，mm不能包含多于50％的与ab的一个天然的结合配体相似的氨基酸序列。在本发明的一些aa的实施例中，aa进一步包含一个连接肽，其特征在于连接肽位于mm和cm之间。在具体的实施例中，连接肽位于mm和cm之间。在某些实施例中，本发明提供的aa进一步包含一种检测基团或一种结合到ab的试剂。在另一方面，本发明提供了一种激活抗体的组合物(aac)包括：两种抗体或抗体片段(ab1和ab2)，每一种都能与其靶点特异性结合，至少一种能与ab1和ab2耦合能抑制ab1和ab2与其靶点特异性结合的掩蔽基团(mm)，以及至少一种能与ab1和ab2耦合，通过激活aac的成分能被一种酶特异性裂解的裂解基团(cm)。其中当aac处于未裂解状态时，mm抑制ab1和ab2与其靶点特异性结合，以及当aac处于裂解状态时，mm不抑制ab1和ab2与其靶点特异性结合。在一个实施例中，aac是双特异性的，其中ab1和ab2连接位于相同靶点的同一抗原表位；或者ab1和ab2连接位于相同靶点的不同抗原表位；ab1和ab2连接位于不同靶点的不同抗原表位。在一个aac的实施例中，cm至少以1x104m"1s4速率能构被酶特异性裂解。在一个实施例中，其中aac的ab1或ab2是一种抗体片段，该抗体片段选自一种fab'片段、一种f(ab')2片段、一种scfv、一种scabadab、一种单域重链抗体和一种单域轻链抗体所构成的组。在一个aac的实施例中，ab1和/或ab2选自表2中的抗体。在一个具体的实施例中，ab1和/或ab2是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(ctla-4单抗)、阿德木单抗、hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(igfr-1抑制剂)。在一个aac的实施例中，ab1和或ab2的靶点选自表1中的靶点所构成的组。在相关的实施例中，ab1和或ab2的靶点是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、转铁蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4。在一个相关aac的抗体中，cm是用于选自表3中的酶所构成的组中酶的一种底物。在一个具体的实施例中，cm是用于半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一种底物。在又一个具体的实施例中，aac进一步与一个能被一种酶特异性裂解的第二裂解基团耦合并且该第二裂解基团是用于半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一种底物。在aac的具体实施例中，mm不包含多余50％的氨基酸片段在另一个有关aac的实施例中，aac进一步包括一个测试基团或进一步与一种试剂共轭。本发明提供了一种治疗和诊断主体一种疾病的方法，包括供给主体一种组合成分，包括：能构专门与其靶点结合的一种抗体或一种抗体片段(ab)、能抑制特定的ab与其靶点的结合的耦合到ab的掩蔽基团(mm)、以及能够专门被酶裂解的一种耦合到ab裂解基团(cm)。其中，根据对主体的供给，对比aa处在裂解cm的足够酶活和mm不抑制ab与其靶点的特异性结合的情况，当aa不处于裂解cm的足够酶活下，mm至少降低ab与其靶点特异性结合程度的90％。在该方法中，ab选自一个fab片段,一个f(ab)2片段,一个scfv,一个scab一个dab,一个单域重链抗体和异构单域轻链抗体。在一个具体的实施例中，症状是癌。在另一个具体的实施例中，mm不是天然的ab的结合配体。在本方法的各种实施例中，ab是选自表2中的抗体所构成的组。具体地，在一些实施例中，ab是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(ctla-4单抗)、阿德木单抗、hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(igfr-1抑制剂)。在本方法的各种实施例中，靶点选自表1中的靶点所构成的组中。在具体的实施例中，靶点是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、转铁蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4在本方法的一个非常具体的实施例中，ab不是阿仑单抗，并且靶点不是cd52。在本方法的各种实施例中，cm是选自表3中的酶所构成的组中酶的一种底物。在具体的实施例中，cm是半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一种底物。本发明提供了在哺乳动物主体中抑制血管生成的方法。该方法包括在治疗上供给主体所需的足量的药物成分，包括一种修饰的ab、一种aa、一种aac或一种aacj，其中靶点是egfr、tnfα、cdlia、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、转铁蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4、或il4。在一个具体的实施例中，ab是西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、英利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、tremelimumab、阿德木单抗(adecatumumab)、hu5c8、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、利妥昔单抗(rituximab)、英利昔单抗(infliximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、或figitumumab。cm是半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一种底物。本发明提供了在一种制备激活抗体(aa)的组合物成分的方法包括：提供一种能够与其靶点特异性结合的抗体或抗体片段(ab)，一种与ab耦合能抑制ab与其靶点特异性结合的掩蔽基团(mm)，一种与ab耦合能由酶特异性裂解的裂解基团(cm)。其中与mm耦合的ab对其靶点的离解常数(kd)比没有与mm耦合的ab对其靶点的离解常数(kd)至少大100倍。在一个本方法的实施例中，ab选自或衍生自表2中的抗体所构成的组中的抗体。在一个具体的实施例中，ab是或衍生自西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(ctla-4单抗)、阿德木单抗、hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(igfr-1抑制剂)。在一个非常具体的实施例中，ab不是alemtuzumab并且靶点不是cd52。在本方法的另一个实施例中，cm是选自表3中的酶构成的组中的酶的一种底物。在一个具体的实施例中，cm是半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4,mmp-9,mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa的一种底物。本发明提也供了一种筛选能确定一种能与抗体或抗体片段结合的掩蔽基团(mm)肽的候选肽的方法，包括提供一种肽支架库，其中每一种肽支架包括：一种跨膜蛋白，以及一种候选肽，将一种ab与库接触，确定至少一种能与ab结合的候选肽，并确定候选肽与ab的离解系数(kd)是否在1-10nm之间。在本方法的各种实施例中，该库包括病毒胞或孢子。具体地在一个实施例中，该库中包括大肠杆菌，在另一个实施例中，肽支架进一步包括一种检测基团。本发明也提供了另一种筛选方法，该方法能确定具有最优的掩蔽效能的掩蔽抗体或抗体片段的掩蔽基团(mm)肽。包括：提供一种包括都中ab的库，每一种都与一种候选肽结合，其中ab能与其靶点特异性结合；对每一个库成员与其靶点进行培养；对比每一个库成员与靶点结合和每一个库成员没有耦合候选肽时与靶点的亲和力。在一个具体的实施例中，最优掩蔽效能是当库成员与其靶点结合的亲和力是与没有经过修饰的ab与其靶点结合亲和力的10％时。在一方面，本发明提供的也是一种提高了生物利用度的抗体疗法，其中，当对比治疗抗体在第二组织中与其靶点的结合时，治疗抗体在一种第一组织中与其靶点结合的亲和力较低。在一个相关的方面，本发明提供的也是一种药物成分包括：一种能与其靶点结合的抗体或抗体片段(ab)，一种药学上可接受的赋形剂。其中，抗体或抗体片段在第一组织中与其靶点的亲和力低于抗体或抗体片段在第二组织中与其靶点的亲和力。在一个具体的实施例中，ab与掩蔽基团(mm)耦合能将低ab与其靶点的结合，并且ab与裂解基团(耦合)能被一种酶特异性裂解。在相关的实施例中，靶点是egfr、tnfα、cd11a、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、转铁蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或il4。在相关的实施例中，cm是用于半胱氨酸蛋白酶、纤溶酶、tmprss-3/4、mmp-9、mtl-mmp、组织蛋白酶、半胱天冬蛋白酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶、upa或psa一种底物。在相关的实施例中，抗体或抗体片段是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(ctla-4单抗)、阿德木单抗、hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(igfr-1抑制剂)。在一个具体的实施例中，第一组织是一种正常组织，第二组织是一种病变组织。或者第一组织是一种早期肿瘤，第二种组织是一种晚期肿瘤。第一种组织是一种良性肿瘤，第二种组织是一种恶性肿瘤。或者第一种组织和第二种组织是空间上分开的。或第一种组织是上皮组织，第二种组织是乳腺、头、颈、肺、胰腺、神经系统、肝、前列腺、泌尿生殖道或宫颈组织。在一个实施例中，在一个具体的实施例中，药剂是一种抗肿瘤药。本发明提供的也是一种用于诊断和治疗的具体的组合物成分。本发明提供的组合物包含一种半胱氨酸蛋白酶激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种纤溶酶激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种半胱天冬蛋白酶激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种tmprss-3/4激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种psa激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种组织蛋白酶激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种人类中性粒细胞弹性蛋白酶激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种β-分泌酶激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种upa激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种tmprss-3/4激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种mtl-mmp激活的与掩蔽基团(mm)耦合的抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的egfr抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的tnfα抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的cdlia抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的csfr抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的ctla-4抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的epcam抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的cd40l抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的notchl抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的notch3抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的jaggedl抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的jagged2抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的cetuximab抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的vectibix抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的infliximab抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的adalimumab抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的efalizumab抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的ipilimumab抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的tremelimumab(ctla-4单抗)抗体或抗体片段(ab)；一种组合物包含一种激活的与掩蔽基团(mm)耦合的adecatumumab抗体或抗体片段(ab)；参考文献就像每一个单独的出版物、专利或专利申请被专门及单独指出作为文献纳入本发明一样，本发明提到的所有出版物、专利和专利申请以相同的范围作为文献纳入本发明。附图说明本发明的新特点在专门所附的权利要求中阐明。参考如下说明性实例提出的详细的描述将对本发明的特点和优点获得更好的理解。在实例中使用了本发明的原理，并有配图。图1显示了含有一种抗体(一种ab)、一种掩蔽基团(mm)、和一种裂解基团(cm)的一种蛋白酶激活的aa。图2显示了一种典型的aa在体外的活性。图a显示了aa不能结合、副作用可以忽略的正常组织；图b显示了病变组织，其中aa被一种特定疾病蛋白/降低允许aa结合到靶点的试剂激活并起作用。图3显示了一种生成蛋白激活的aa的过程，包括：mm的筛选；cm的筛选；mm、cm和一种ab的组装；表达和纯化组装的结构；已经分析组装的结构获得在体外和体内的活性和毒性。图4提供了一种典型mmp-9裂解掩蔽抗egfscfv的氨基酸序列。图5提供了elisa数据，显示mmp-9对mbp激活：抗-vegfscfvaa与mm306和314。样品用tev处理以出去mbp融合的配体随后被mmp-9消化激活。图6提供了elisa数据，显示了依赖mmp-9的vegf与抗vegfscfvhis结合的结构与306mm。图7提供了elisa数据，显示了依赖mmp-9的vegf与抗vegfscfv-fcaa结合与来自hek细胞上清液的mm306和314。图8提供了elisa数据，显示了依赖mmp-9的vegf与抗vegfscfv-fcaa结合的结构及用蛋白a柱纯化的mm306和314。图9显示了与抗vegf抗体结合、具有>600nm亲和力的306mm没有有效地排除与vegf的结合。图10显示了抗ctla4的轻链和重链通过soe-pcr连接，在vhvl和vlvh两个方向产生scfv结构。图11显示了用pcr增加mm克隆、cm裂解片段、ggs2连接体在抗ctla4scfvvhvlandvlvh结构的n-末端的位点数。图12显示了一种被mmp-9激活的aa。图13显示了当cm被裂解移除mm，ab的连接被恢复。图14一节aa激活一种蛋白酶，导致抗体结合未修改抗体难以区别。图15显示了一种包含一种具有与veg特异性结合亲和力ab的aa被抑制，激活的aa与具有皮摩尔亲和力的vegf结合。图16描绘了一种包含一种具有与veg特异性结合亲和力ab的aa抑制huvec增殖。图17显示了培养的肿瘤细胞表现出原位稳健地激活包含一种具有与veg特异性结合亲和力ab的aa。图18显示一种在正常和癌患者血浆中没有活性的aa。图19显示了抗ctla4scfv与小鼠和人ctla4的结合。图20显示了一种蛋白激活的包含一种抗体(含有一种ab)的aacj，一种掩蔽基团(mm)，一种裂解基团(cm)，以及一种共轭试剂。基于cm的裂解和解掩蔽，共轭的ab被释放。图21显示了在标有抗vegf的3种不同的浓度荧光团。所有三个具亲合性成熟的肽显示至少有比js306高倍10的亲合性。图22显示了一些egfr的亲和力成熟的过程。图23显示了c225fab与mm3690、mm3954和mm3957结合的细胞亲和力测量的结合曲线。mm3954和mm3957显示了至少比mm3690高100倍亲和力。图24显示了靶点替代物分析和以亲代抗体结合程度百分比表示的平衡结合程度。图25显示了不同于upa对照，底物sml6、kk1203、204和1214表现出了经klk5、klk7和纤溶酶裂解的阻力。图26显示了不同于一种非优化的底物，优化的底物plasl237、plasl29和plas1254表现了经klk5、klk7裂解的阻力。图27图a显示了scfvaa的活化，包括天冬酰胺内肽酶的底物aanl和ptnl随后经5mg/ml天冬酰胺内肽酶处理。图b显示了抗vegfiggaa的活化，包括天冬酰胺内肽酶的底物ptnl。图28显示了天冬酰胺内肽酶活化的aa中被活化的aa在每一个时间点占总aa的比例。当活化7天被纤维酶活化的aa接近活化完全时，两种被天冬酰胺内肽酶活化的aa仅有最低限度的活化。被天冬酰胺内肽酶活化的aa长达7天是从血清中分离出来，随后注射保持掩蔽。(n＝4)。图29显示了掩蔽的单链fv-fc融合原抗体表现出提高了的血清半衰期。图30显示了在健康小鼠体内超过10天的scfv-fc血药浓度。aa的浓度7天后的剂量仍维持稳定，而亲代scfv-fc的浓度3天后降低，10天后几乎检测不到。图31显示了与亲代scfv-fc在荷瘤小鼠体内相比，aascfv-fc在血清中的浓度提高并维持时间较长。在3天及3-7天和7天在血清中检测到占初始剂量较高百分比的aa。图32显示了在对荷瘤小鼠进行的多次剂量的研究中，aascfv-fcs维持在高浓度。在研究过程中，aa比其亲代保持显著的高血药浓度。图33显示了与没有经mm修饰的抗体相比，aa在正常小鼠血清中维持在高水平。图34显示，由蛋白酶活化的激活抗体复合物(aac)，包一种或多种抗体或抗体片段(在该图中，ab被称为abd)、一种掩蔽基团(mm)和一种裂解基团(cm)，其中abd1和abd2被任意指定给第一和第二ab。在该实施例中，mm1和mm2分别与含有abd1和abd2域结合，作为掩蔽基团干扰靶点与一种未裂解的能进行双靶点结合的aac结合。结合ab的靶点可以相同或不同，或相同靶点的不同结合点。在一些实施例中(图ia、id、if)，mm1在相反的分子上与含有abd2的域结合，形成能够作为abdl和abd2的掩蔽基团的复合物。图35显示，在未裂解状态下发生交叉掩蔽的aac，这样与两个ab结合的靶点被减弱，并且在一种裂解cm(使复合物分解)的试剂存在时，靶点的结合提高了。在该图中，ab1和ab2分别被称为abd1和abd2。图36显示，在未裂解状态下，一种通过mm1和abd1(ab1)共价键形成的aac，这样，由abd2(ab2)连接的靶点被减弱，并且在一种裂解cm(使复合物分解)的试剂存在时，靶点的结合提高了。在该图中，ab1和ab2分别被称为abd1和abd2。发明详述本发明提供修饰抗体组成及对治疗和诊断有用的修饰抗体组成。本发明所述的组成顾及更好的生物分布和提高了生物利用度。修饰的和激活的抗体本发明所述的修饰抗体组成包含至少一种抗体或及其抗体片段(在整个本发明中统称为ab)，能够特异性与一种靶点结合，其中ab是由一种掩蔽基团(mm)修饰的。当ab用mm修饰并在靶点存在时，对比没有用mm修饰的ab与其靶点的结合或亲代ab与其靶点的结合，ab与其靶点的特异性结合被降低或被抑制。用mm修饰的ab对其靶点的离解常数可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000或大于、或在5-10、10-100、10-1000、10-10000、10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之间,或比没有用mm修饰的ab对其靶点或亲代ab对其靶点的kd大100000-10000000倍。相反，用mm修饰的ab对其靶点的亲和力可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000或大于、或在5-10、10-100、10-1000、10-10000、10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之间,或比没有用mm修饰的ab对其靶点或亲代ab对其靶点的亲和力低100000-10000000倍。mm对ab的离解常数(kd)一般大于ab对其靶点的离解常数。mm对ab的离解常数可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、100000、1000000或甚至比ab对其靶点的离解常数大10000000倍。相反，mm对ab的亲和力可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、100000、1000000或甚至比ab对其靶点的亲和力低10000000倍。如本发明所述，当ab用mm修饰并在靶点存在时，对比没有用mm修饰的ab与其靶点的特异性结合或亲代ab与其靶点的特异性结合，ab与其靶点的特异性结合被降低或被抑制。当对比没有用mm修饰的ab与其靶点的结合或亲代ab与其靶点的结合，当用mm修饰时，在体内或在体外用靶点替代物进行免疫吸附剂分析，ab与其靶点的结合能力可以被降低至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及甚至100％至少2,4,6,8,12,28,24,30,36,48,60,72,84,96,小时,或5,10,15,30,45,60,90,120,150,180天,或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12月或更长。mm能抑制ab与其靶点的结合。mm能与ab的抗原结合域结合从而抑制ab与其靶点的结合。mm能sterically抑制ab与其靶点的结合。mm能allosterically抑制ab与其靶点的结合。在这些实施例中，当ab被修饰即被mm耦合并在靶点存在时，ab与其靶点没有结合或基本没有结合，或当与没有经mm修饰的ab、亲代ab、或没有耦合mm的ab与其靶点的结合对比时，ab与其靶点的结合不大于0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％，，如本发明所述，当在体内或在体外用靶点替代物进行免疫吸附剂分析，至少为2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更长。当一种ab被mm耦合即由mm修饰时，mm能“掩蔽”或降低、或抑制ab与其靶点的特异性结合。当一种ab被mm耦合即由mm修饰时，这种耦合或修饰能影响一种降低或抑制ab与其靶点特异性结合能力的结构的变化。一种ab与mm耦合或用mm修饰可以用如下式子表示，按顺序从一个氨基(n)端区域到羰基(c)端区域：(mm)-(ab)(ab)-(mm)(mm)-l-(ab)(ab)-l-(mm)其中mm是一种掩蔽基团，ab是一种抗体或抗体片段，l是一种连接体。在许多实施例中，可能需要插入一个或多个连接体。例如，柔性连接体，插入相应位置以便提供柔软性。在某些实施例中，mm不是一种aa的天然结合配体。mm可以是ab的一种修饰的结合配体，其中aa含有至少轻微间给亲和力和或对ab的结合亲和力的氨基酸变化。在一些实施例中，mm不包含或基本不包含同源的ab的天然结合配体。在一些实施例中，类似于ab的天然配体，mm不大于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。本发明也提供了激活的抗体(aas)其中被mm修饰的ab进一步包括一个或多个裂解基团(cm)。这中aa是表现出与ab的靶点的可激活/可转换的结合。aas一般包括一种抗体或抗体片段(ab)、被修饰或耦合到一种掩蔽基团(mm)以及一种有修饰能力的或裂解的基团(cm)。在一些实施例中，cm包含一种作为目标蛋白酶底物的氨基酸或氨基酸序列。在其他实施例中，cm提供一种通过还原可裂解的半胱氨酸-半胱氨酸双硫键。在又一个实施例中，cm提供一种通过光解作用激活的光解底物。在图1中是典型aa的一个原理图。如图所示，aa的部件这样排列使cm定位在一种裂解状态(或相对激活状态)并在一个靶点存在的情况，ab与办学目标结合，而在一种未裂解的状态(或相对未激活的状态)并在一个靶点存在的情况，由于ab与其靶点的结合能力由mm抑制或掩蔽，ab与其靶点的特异性结合被降低或被抑制。经一种mm和一种cm修饰的ab对靶点的离解常数kd可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5000、10000、50000、100000、500,000、1000000、5000000、10000000、50000000或大于、或在5-10、10-100、10-1000、10-10000、10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之间，或比没有经mm和cm修饰的ab对靶点的kd大100000-10000000倍。相反，经一种mm和一种cm修饰的ab对靶点结合的亲和力可以至少是5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000或大于，或在5-10、10-100、10-1、000、10-10000、10-100000、10-1000000、10-10000000、100-1000、100-10000、100-100000、100-1000000、100-10000000、1000-10000、1000-100000、1000-1000000、1000-10000000、10000-100000、10000-1000000、10000-10000000、100000-1000000之间，或比没有经mm和cm修饰的ab对靶点结合的亲和力低100000-10000000倍。如本发明所述，对比没有被mm和cm修饰的ab与其靶点的结合，当ab被mm和cm修饰并在靶点存在而修饰试剂(如一种酶、蛋白酶、减活剂、光)不存在时，ab与其靶点的特异性结合可被降低或抑制。当对比亲代ab或没有被mm和cm修饰的ab与其靶点的结合，在体内或在体外用靶点替代物进行免疫吸附剂分析，被mm和cm修饰的ab结合其靶点的能力被降低至少50％、60％、70％、80％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及甚至100％至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天,或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或更长。如本发明所使用的，术语裂解状态是指aa伴随通过蛋白质，和/或一种半胱氨酸-半胱氨酸双硫键、cm键、和/或光激活修饰cm的状态。如本发明所使用的，术语未裂解状态，是指aa不在蛋白质裂解cm的状态，和/或不在cm的胱氨酸-半胱氨酸双硫键降低的状态、和/或不在光存在的状态。如上所述，本发明所用的术语aa是指一种aa在未裂解(原始)状态及其裂解状态的两种状态。这对本领域的技术人员是明确的，在一些实施例中，由于通过蛋白质对一种cm的裂解，aa可能缺少一种mm，至少导致mm的释出(其中mm没有与通过共价键(如在半胱氨酸残基之间的双硫键)结合)。可激活的或可转换的意思是当在一种被抑制、被掩蔽或未裂解状态(即，一种第一结构)时，aa表现出一种与其靶点结合的第一水平，以及在未被抑制、未被掩蔽和/或裂解状态(即，一种第二结构)时aa表现出一种与其靶点结合的第二水平，其中与其靶点结合的第二水平大于与其靶点结合的第一水平。一般地，在能够裂解cm的裂解剂存在时靶点到达aa的ab程度比在裂解剂不存在时是大。这样，当aa处在未裂解状态时，ab与靶点的结合被抑制并且其与靶点的结合被掩蔽(即，地域结构是这样，ab不能与靶点结合)，而在裂解状态ab未被抑制或未被掩蔽其与靶点的结合。aa的cm和ab可以选择成ab代表一种相关靶点的结合基团，cm代表在一个主体内的治疗位置能与靶点共存的蛋白酶的一种底物。此外，cm是一个半胱氨酸-半胱氨酸双硫键是可裂解的，作为双硫健减少的结果。aa另外或将进一步包括一种不耐光的底物，可通过一种光源激活。这里所说的aa有特别的用途，其中，例如，能够裂解cm中的位点的蛋白酶在一个治疗位点(如病变组织，如治疗处理或诊断处理的例子)的靶点含有的组织中比未经治疗位点(如在正常组织中)的组织中处于相对高的水平，如图2的示例。这里所说的aa也有特别的用途，其中，例如，一种能够降低cm中的位点降低剂在中比在未经治疗和诊断位点的组织中处于相对较高的水平。这里所说的aa也有特别的用途，例如，像一种治疗或诊断位点的靶点含有的组织引入一种能够光解cm中的一种位点的光源，例如激光。在一些实施例中，aa可提供降低毒性和/或不良的副作用，否则，如果ab没有被掩蔽或抑制与靶点的结合，将导致ab在未治疗位点的结合。其中，aa包含被一种易于减少双硫键的降低剂裂解的cm，aa的这种ab可以选择以利用ab的活化，其中有关的靶点出现在需要治疗的以提高了一种降低剂的水平为特征的位点，这样的环境中具有比，例如，未治疗位点的环境中更高的降低潜力。一般地，当在构象约束下，一种aa可以通过选择一种目标ab和构建aa的剩余部分进行设计以便mm为ab提供掩蔽或降低ab与其靶点测定结合。结构设计准则的采用须考虑提供这种结构特性。在某些实施例中，本发明提供了结合双靶点的aa。这种结合双靶点的aa包含两个可以结合相同或不同靶点的ab，在具体的实施例中，双靶点aa包含两个具体的抗体或抗体片段。在一个具体的实施例中，aa包含一种il17ab和一种il23ab。在其他具体的实施例中，aa包含一种il12ab和一种il23ab，或一种egfrab和一种vegfab，或一种igflrab和一种egfrab，或一种cmetab和一种igflrab，或一种egfrab和一种vegfab，或一种notch受体ab和一种egfrab，或一种jagged配体ab和一种egfrab，或一种cmetab和一种vegfab。双靶点结合的aa可以设计成具有被一种在一个靶点组织中与一个或两个能够结合aa中的ab的靶点共存的裂解剂裂解的cm。具有多于一个对相同或不同靶点的双靶点ab可以设计成具有多于一个cm，其中第一cm是在一个第一靶点的组织中被一种裂解剂可裂解的。而其中的第二cm是在一个第二靶点的组织中被一种裂解剂可裂解的，具有能够与aa中的ab结合的一个或多个靶点。第一和第二靶点的组织在空间上可以是分开的，例如，在有机体中的不同位点。第一和第二靶点的组织可以是暂时分开的相同组织，例如，在两个不同时间点相同的组织。例如，第一时间点是当组织是一种健康的肿瘤时，第二时间点是当组织是一种坏死的肿瘤时。为在一种被抑制的结构或未被抑制的结构中的靶点的结合提供了在一个所需的动态范围表现出可转换表形的aa。动态范围一般是指一种比例，具有从(a)在第一套条件下的参数的最大可检测水平到(b)在第二套条件下的参数的最小可检测值。例如，在关于aa的描述中，动态范围是是指从(a)在能裂解aa的cm的蛋白酶存在下靶点与aa结合的最大可检测水平到(b)在该蛋白酶不存在时靶点与aa结合的最小可检测水平。aa的动态范围可以以aa裂解剂治疗(例如，酶)的平衡裂解常数与aa裂解剂治疗(例如，酶)的平衡裂解常数的比例进行计算。aa的动态分为越大，其可转换表形越好。动态范围数值相对较高的aa(例如，大于1)表现出更好的转换表型，以便在裂解aa的cm的裂解剂(例如，酶)存在时比裂解剂不存在时使靶点蛋白与aa的结合在更大的范围发生(例如，显著地发生)。aa可以多种结构形式提供。有关aa的典型的结构式在下文提供。专门设想在aa中的ab、mm和cm从n到c端的顺序被占据。也专门设想cm和mm可能在氨基酸序列中重叠，例如，cm包含在mm中。例如，可以下面的式子代表aa，按顺序从一个氨基(n)端区域到羰基(c)端区域：(mm)-(cm)-(ab)(ab)-(cm)-(mm)其中mm是一种掩蔽基团，cm是一种裂解基团，以及ab是一种抗体及其片段。应该指出，尽管mm和ca在上面的结构式中是不同的组件显示的，在本发明所有典型的实施例中(包括结构式)设想mm和cm中的氨基酸序列可以重叠，例如，这样cm可以被全部或部分地包含在mm中。此外，上述结构式为位于aa部件的n端或c端提供了额外的氨基酸序列。在许多实施例中，可能希望插入一个或多个连接体，如柔性连接体，到aa的结构中以便在一个或多个mm-cm结点、cm-ab结点或其两者提供柔性。例如，ab、mm和/或cm可能不含足够数量的残基(如giy、ser、asp、asn，特别是giy和ser，尤其是giy)以提供所需的柔性。因此，这种aa结构的可转换表型可以从一个或多个氨基酸的引入受益以便提供一种柔性的连接体。此外，如下文所示，其中aa作为一种构象约束结构而提供，一种柔性连接体可以被切实可行地插入以便在为未裂解的aa中易于形成并维持一个环状结构。例如，在某些实施例中，一种aa包括下面的结构式中的一种(其中，在n到c端方向或c到n端方向，下式代表一种氨基酸序列)：(mm)-l1-(cm)-(ab)(mm)-(cm)-l1-(ab)(mm)-l1-(cm)-l2-(ab)cycio[l1-(mm)-l2-(cm)-l3-(ab)]其中mm、cm及ab如上文所定义；其中l1、l2和l3各自独立及可选则存在或不存在、是相同或不同的连接体，包括至少一种柔性氨基酸(如giy)，其中出现cyclo位置，由于在aa中一对半胱氨酸之间存在双硫健aa是一种环状结构的形式。此外，上式可能在aa基元的n端或c端提供了额外的氨基酸序列。应该认识到，在式cycio[l1-(mm)-l2-(cm)-l3-(ab)]中，负责提供硫键的半胱氨酸可能置于aa中兼顾一个或两个尾端，从而当aa处于一个双硫健结构中时产生一个套索或欧米茄结构(这样处于构象约束状态)。尾端的氨基酸序列为aa提供了额外的特性，如与靶点的受体结合使aa易于定位、提高aa的血清半衰期，等等。靶向基团(例如，出现在靶点组织中的一个细胞受体的配体)和血清半衰期延长基团(如，多呆与血清蛋白结合的多态，如免疫球蛋白(例如igg))或血清白蛋白(如人血清白蛋白hsa)。经过修饰并激活的抗体的基元。(a)抗体或抗体片段(统称为ab)根据本发明，ab针对任何可能使用的抗原或半抗原。本发明中使用的ab针对任何行列式，例如，肿瘤、细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体、组织相容性，差异化和其他细胞膜抗原、病原体表面抗原、毒素、酶、过敏原、药物、细胞内靶点、任何生物活性分子。此外，可能使用相对于不同抗原行列式的ab结合体。如本发明所使用的，ab是能结合特别是特异性与相关的靶点，特别是相关蛋白质靶点结合的全尺寸的抗体或包含一种抗原结合域的抗体片段。在图1中提供了aa的一种原理图。在这样的实施例中，ab可以是但不限于一种可变或高度可变的抗体的轻链和/或重链(vl,vh)的区域、可变片段(fv)、fab'片段、f(ab')2片段、fab片段、单链抗体(scab)、单链可变域(scfv)、互补决定域(cdr)、域抗体(dabs)、bhh或bnar类型的单域重链免疫球蛋白、单域轻链免疫球蛋白、或其他本领域已知的含有一种能与靶点蛋白或在靶点蛋白上的抗原表位结合的ab的多态。在进一步的实施例中，ab可以是含有多于一种ab的嵌合体或杂交组合体，例如一种第一ab和一种第二ab，这样，每一个ab能与相同或不同的靶点结合。在一些实施例中，ab是双特异性的抗体或其片段。设计成与两种不同的抗原结合。在一些实施例中，存在一种在激活形式的第一mm和cm和/或第二mm和cm分别与第一ab和第二ab耦合。ab的起源可以是一种天然存在的抗体或抗体片段、一种非天然存在的抗体或抗体片段、一种合成的抗体或抗体片段、一种混合抗体或抗体片段、或一种工程抗体或抗体片段。该抗体可以是一种人源化抗体或抗体片段。在某些实施例中，aa含有不止一种ab。在一些实施例中，ab可以衍生自双特异性抗体或抗体片段。在其他抗体中，aa可以是工程合成的以便纳入到衍生在两种不同抗体或抗体片段的ab中。在这种实施例中，ab可以设计成与两种不同的靶点、两种不同的抗体、或两种同一靶点上的不同抗原表位结合。一种含有多个ab且能与多于一种靶点位点结合的ab通常设计成与一种靶点或多个目标靶点上的不同的结合位点结合，这样，一种aa的第一ab的结合基本不干扰该aa的第二ab与靶点的结合。含有多个ab的aa可以进一步包括多个ab-mm单元，它们可以选择性地被额外的cm分开，这样，由于暴露于一种修饰剂，ab与其靶点的特异性结合不再受到抑制，或是“解掩蔽的”。在一些实施例中，把抗体片段用于源允许靶点位点在一种提高的速率下渗透。igg免疫球蛋白的fab'片段由抗体与胃蛋白酶[导致一种二价片段(fab1)2]或木瓜蛋白酶[导致2个一价片段(2fab)]裂解获得。parham,1983,j.immunol.131:2895-2902；lamoyiandnisonoff,1983,j.immunol.meth.56:235-243。二价(fab1)2片段可以分裂通过一种或几种双硫键的缓和减少产生单价fab'片段。fab和(fab1)2片段比一个完整抗体小，但仍含有一个ab，所以当用作ab时可以更容易地渗透到靶点的位点或组织。在某些实施例中，因为许多这样的片段不能跨过胎盘屏障，这可提供在体内传递的一种优势。结果，使用本发明的这种实施例，aa可以在孕妇体内位点(如肿瘤)传递而避免胎儿的暴露。为一种给定的靶点生成一种抗体(或其片段)的方法为本专业所熟知。抗体和抗体片段的结构、一种抗体的轻链和重链(vhandvl)的可变域、fv、f(ab')2、fab片段、单链抗体(scab)、单链可变域(scfv)、互补决定域(cdr)和域抗体(dab)都是所熟知的。生成具有所需的靶点抗原的一种抗原结合域的多肽的方法为本专业所熟知。修饰抗体或抗体片段与额外的多态耦合的方法为本专业所熟知。例如，肽如mm、cm或连接体可以经过耦合以修饰抗体形成本发明中的修饰ab和aa。如在图3的原理图中描述的，使用标准方法可以开发并生产含有蛋白酶激活的ab的aa。该抗体或抗体片段(统称为ab)能与一种蛋白质靶点特异性结合。本发明中的一种ab与其靶点在裂解系数不大于1000nm、100nm、50nm、10nm、5nm、1nm、500pm、400pm、350pm、300pm、250pm、200pm、150pm、100pm、50pm、25pm、l0pm、5pm、1pm、0.5pm或0.1pm时特异性结合。有关ab的靶点的典型类型包括，但不一定限于，细胞表面受体和分泌的集合蛋白(例如、生长因子)、水溶性酶、结构蛋白(例如，胶原蛋白、纤维连接蛋白)等。在一些实施例中，本发明预期的aa是那些具有能连接一种胞外靶点、通常是一种胞外蛋白靶点。在其他实施例中，aa可以设计成细胞吸收以及设计成在细胞内可转换的在典型的实施例中，没有任何方式的限制，ab是用于表一中的任何靶点的一种结合配体。在具体的典型实施例中，ab是一种用于egfr、tnfα、cd11a、csfr、ctla-4、epcam、vegf、cd40、cd20、notch1、notch2、notch3、notch4、jagged1、jagged2、cd52、mucl、igflr、铁传递蛋白、gpl30、vcam-i、cd44、dll4或l4的结合配体。在一个具体的实施例中，ab不是cd52的结合配体。在典型的实施例中，没有任何方式的限制，ab的典型来源列于表2中。在具体的典型实施例中，本发明中ab的来源是西妥昔单抗、帕木单抗、英利昔单抗、阿达木单抗、依法珠单抗、伊匹单抗、tremelimumab(ctla-4单抗)、阿德木单抗、hu5c8、阿伦单抗、雷珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、利妥昔单抗、英利昔单抗、贝伐珠单抗或figitumumab(igfr-1抑制剂)。在一个具体的实施例中，ab的来源不是阿仑单抗或不是campathtm。表1：典型靶点表2：ab的典型来源列于表2中的一些ab的典型来源在下列文献中有详细描述，它们对一个或多个参考ab的来源描述作为文献纳入本发明。remicadetm(英夫利昔单抗):美国专利第6,015,557号，nagahirak,fukuday,oyamay,kuriharat,nasut,kawashimah,noguchic,oikawas,nakanishit.humanizationofamouseneutralizingmonoclonalantibodyagainsttumornecrosisfactor-α(tnf-α).jimmunolmethods.1999janl；222(l-2):83-92.)knightdm,trinhh,lej,siegels,shealyd,mcdonoughm,scallonb,moorema,vilcekj,daddonap,etal.constructionandinitialcharacterizationofamouse-humanchimericanti-tnfantibody.moiimmunol.1993nov；30(16):1443-53.humiratm(阿达木单抗):美国专利第6258562号的序列.raptivatm(依法珠单抗):在wertherwa,gonzaleztn,o'connorsj,mccabes,chanb,hotalingt,champem,foxja,jardieupm,bermanpw,prestalg.humanizationofananti-lymphocytefunction-associatedantigen(lfa)-imonoclonalantibodyandreengineeringofthehumanizedantibodyforbindingtorhesuslfa-i.jimmunol.1996dec1；157(11):4986-95中的序列.mylotargtm(吉妥珠单抗奥唑米星):(在coms,avdalovicnm,caronpc,avdalovicmv,scheinbergda,queenc:chimericandhumanizedantibodieswithspecificityforthecd33antigen.jimmunol148:1149,1991中的序列)(caronpc,schwartzma,coms,queenc,finnrd,grahammc,divgicr,larsonsm,scheinbergda.murineandhumanizedconstructsofmonoclonalantibodym195(anti-cd33)forthetherapyofacutemyelogenousleukemia.cancer.1994feb1；73(3suppl):1049-56).soliristm(伊库珠单抗):_hillmenp,youngn,schubertj,brodskyr,socieg,muusp,rotha,szerj,elebutem,nakamurar,brownep,risitanoa,hilla,schrezenmeierh,fuc,maciejewskij,rollinss,mojcikc,rotherr,luzzattol(2006).thecomplementinhibitoreculizumabinparoxysmalnocturnalhemoglobinuria.nengljmed355(12):1233-43.tysabritm(那他珠单抗):在legeroj,yednockta,tannerl,homerhc,hinesdk,keens,saldanhaj,jonesst,fritzlc,bendigmm.humanizationofamouseantibodyagainsthumanα-4integrin:apotentialtherapeuticforthetreatmentofmultiplesclerosis.humantibodies.1997；8(1):3-16中的序列.synagistm(帕利佐单抗):在johnsons,oliverc,princega,hemmingvg,pfarrds,wangsc,dormitzerm,o'gradyj,koenigs,tamurajk,woodsr,bansalg,couchenourd,tsaoe,hallwc,youngjf.developmentofahumanizedmonoclonalantibody(medi-493)withpotentinvitroandinvivoactivityagainstrespiratorysyncytialvirus.jinfectdis.1997nov；176(5):1215-24中的序列.易普利姆玛:j.immunother:2007；30(8):825-830。ipilimumab(anti-ctla4antibodycausesregressionofmetastaticrenalcellcancerassociatedwithenteritisandhypophysitis；jamesc.yang,marybethhughes,udaikammula,richardroyal,richardm.sherry,suzannel.topalian,kimberlyb.suri,catherinelevy,tamikaallen,sharonmavroukakis,israellowy,donalde.white,andstevena.rosenberg.tremelimumab:oncologist2007；12；153-883；blockingmonoclonalantibodyinclinicaldevelopmentforpatientswithcancer；antoniribas,douglasc.hanson,dennisa.noe,robertmillham,deborahj.guyot,stevenh.bernstein,paulc.canniff,amarnathsharmaandjesusgomez-navarro.(b)掩蔽基团(mm)本发明的掩蔽基团(mm)一般是指一种耦合并定位于ab并位于氨基酸序列，这样，它可以降低ab与其靶点特异性结合的能力。在一些情况下，mm通过一种连接体与ab耦合。对比没有耦合mm的ab与其靶点的结合或亲代ab与其靶点的特异性结合，当ab被mm修饰并且在靶点存在时，ab与其靶点的特异性结合被降低或抑制。被mm修饰的ab对其靶点的kd通常大于没有被mm修饰的ab或亲代ab对其靶点的kd。相反，被mm修饰的ab对其靶点的结合亲和力通常小于没有被mm修饰的ab或亲代ab对其靶点的结合亲和力。mm对ab的离解常数(kd)通常大于ab对其靶点的kd。相反，mm对ab结合亲和力通常小于ab对其靶点的结合亲和力。对比没有耦合mm的ab与其靶点的结合或亲代ab与其靶点的特异性结合，当ab被mm修饰并且在靶点存在时，ab与其靶点的特异性结合被降低或抑制。靶点存在及足够的酶或酶活裂解cm时，对比被cm和mm修饰的ab的特异性结合，当ab被cm和mm修饰并且在靶点存在但没有足够的酶或酶活裂解该cm时，修饰ab对其靶点的特异性结合被降低或抑制。mm可以抑制ab与其靶点的结合。mm可以结合ab的抗原结合域并抑制ab与其靶点的结合。mm可以从空间上抑制ab与其靶点的结合。mm可以从allosterically上抑制ab与其靶点的结合。如本发明所述，当在体内或在体外以必须明白替代物进行免疫吸附剂分析，在这些实施例中，对比没有被mm修饰的ab或亲代ab、或没有耦合mm的ab与其靶点的结合，当ab被修饰或与mm耦合并且在其靶点存在时，ab与靶点没有结合或基本没有结合，或不大于0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、或50％ab与其靶点的结合至少为2,4,6,8,12,28,24,30,36,48,60,72,84,96小时，或5,10,15,30,45,60,90,120,150,180天，或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12月或更长。在某些实施例中，mm不是ab的天然结合配体。mm可以是一种用于ab的包含至少略微降低与ab结合的亲和力的氨基酸变化的修饰结合配体。在一些实施例中，mm不含有或基本不含有ab的天然结合配体的同源体。在其他实施例中，mm与ab的天然结合配体的相似性不大于5％、10％、15％、20％、25％、30％,35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。当ab处于掩蔽状态时，即使在ab的靶点存在时，mm干扰或抑制ab与其靶点的结合。然而，在ab未掩蔽的状态线，mm对ab与靶点结合掩蔽作用被降低，从而，允许ab更大程度接近靶点并提供靶点的结合。例如，当修饰抗体是一个aa并含有cm时，在酶尤其是一种特定疾病的酶存在下，ab可以靠cm的裂解被解掩蔽。因此，当aa是为裂解的时，mm是为来自与靶点结合的ab提供掩蔽的。但是，当aa是裂解结构时，不能显著干扰或竞争靶点与ab的结合。因此，当mm是未裂解的时，随着mm降低靶点的结合和由为提高靶点结合而提供的蛋白酶造成cm的裂解，mm与cm的结合有利于可转换/可激活的表型。mm的结构性质将随各种因素而变化，这些因素如干扰ab与靶点连接所需要的最小氨基酸片段、目标靶点蛋白-ab结合对、ab的尺寸大小、cm的长度、无论cm位于aa内及同时在为裂解的aa中用来隐蔽ab、连接体的存在与否、内部或侧面带有提供半胱氨酸-半胱氨酸二硫键cm的ab的半胱氨酸是否存在，等等。在aa中掩蔽一个抗体或其片段(ab)的一种策略是在一个空间位阻阻碍靶点进入到ab的闭环中提供aa，采用这种策略，半胱氨酸位于或靠近n-末端、c-末端、或aa的ab，这样，依靠半胱氨酸之间形成的双硫键，ab被掩蔽。在一些实施例中，mm通过共价结合与aa耦合。在另一个实施例中，通过mm结合到aa的图个n-末端阻止aa组成与其靶点的结合。在又一个实施例中，aa通过在mm和aa之间的半胱氨酸-半胱氨酸双硫桥与mm耦合。mm可以以各种不同的方式提供，在某些实施例中，可选择mm是一个已知ab的结合配体，伴随mm的裂解，提供mm比设计的ab结合靶点蛋白小的亲和力与ab结合，以便降低mm对靶点与ab结合的干扰。换句话说，如如上所述，当aa是未裂解的时mm是一种掩蔽ab与靶点结合的形态。但是，当aa以裂解构象状态时，至少ab和mm之一不能大幅或显著干扰或竞争与靶点的连接。在一个具体的实施例中，ab和mm不包含天然存在的结合配体对的氨基酸序列，这样，至少ab和mm之一没有天然存在连接配体成员的氨基酸序列。如在本发明的举例部分所描述的，使用一种免疫吸附靶点代替物分析，可以通过掩蔽效率测量方法可以测量mm对耦合的靶点和ab结合的抑制效率。mm的掩蔽效率可由至少两个参数确定：mm对抗体或其片段的亲和力和mm相对于ab与其靶点结合界面的空间关系。至于亲和力，通过举例的方式，一个mm具有高亲和力，但对ab上的结合位点仅能部分抑制。在短时间内，低亲和力的mm可能表现出有效的掩蔽。相反，经过长时间后，同一mm可能被靶点取代(由于对ab的亲和力不足)。以类似的方式，两个具有相同亲和力的mm可能表现出不同的掩蔽程度，根据抑制的结合位点，以及它们如何促进抑制ab上的结合位点或阻止ab与其靶点的结合。在在另一个例子中，具有高亲和力的mm可结合和改变ab的结构，使与其结合的靶点被完全抑制，而另一种具有高亲和力的mm可能只是部分地抑制结合。因此，发现一种有效的mm不能只根据亲和力，但可以包括一个具有掩蔽效率的经验方法。在aa中mm的时间依赖性靶点替代物是可以被测量以优化和选择mm。为此，本发明描述了一种新的靶点替代物分析方法。在一些实施例中，mm可以从具有可变mm的候选aa库中通过一个筛选程序确定。例如，可以选择一种ab和cm以供所需的酶/靶点结合，mm的氨基酸序列可以通过一个下述的筛选程序确定，以便确定一种可转换表型的mm。例如，在本发明提供一个筛选方法中可能使用一个随机肽库(例如，从约2至约40或以上的氨基酸)，以确定一个合适的mm。在具体的实施例中，对抗体或其片段(ab)具有特定亲和力的mm可以通过一个筛选程序确定，该筛选程序包括一个含有候选mm的肽支架库，其中每一个支架有关一种跨膜蛋白和候选mm构成。然后使该库与一个ab如全尺寸抗体、一个天然存在的抗体片段、或一个非天然存在的含有一个ab的片段(也能与目标靶点结合)的全部或部分接触，确定一个或多个具有可检测性结合ab的候选mm。筛选可包括一轮或多轮磁激活排序(macs)或荧光激活排序(facs)。筛选也可包括mm对ab的裂解常数(kd)的确定以及而后掩蔽效率的确定。在这种方式下，具有一个抑制ab连接到靶点的mm的aa允许确定ab连接裂解状态的靶点。并且能进一步提供对转换表型具有一种最佳动态范围的aa的选择。确定具有需要的转换表型的aa的方法在先稳中详细描述。另外，mm可能不与ab定型连接，而是通过非特异性相互作用，如空间位阻干扰与ab-靶点之间的结合。例如，mm可能位于未裂解的aa中，这样，这种aa的三级或四级结构允许mm通过基于电荷的相互作用掩蔽ab，从而将mm束缚干扰靶点接近ab。ab可以以构象约束的机构形式提供，如一个环状结构，以方便形成可转换的表型。这可以通过包括一个aa结构中的一个半胱氨酸对实现，这样在半胱氨酸对之间形成的双硫键将aa放在一个环路或环状结构中。这样在提供抑制靶点与ab结合的同时，aa保持由所需的蛋白酶所裂解的状态。依赖于cm的裂解，环状结构结构被打开允许靶点接近ab。半胱氨酸对可位于aa的任何位置以提供构象约束的aa，但是，随cm减少，不会大幅或明显干扰靶点与ab结合。例如，半胱氨酸对的半胱氨酸残基位于mm和两侧连有mm和ab的连接体、在一个两侧连有mm和ab的连接体或其他合适的结构。例如，mm或侧面俩有一个mm的连接体可以包括一个或多个半胱氨酸残基，其中，当aa处在折叠状态是，半胱氨酸残基与位于mm另一端的胱氨酸残基形成一个双硫键桥。通常，希望半胱氨酸对的半胱氨酸残基位于ab的外面，以便避免干扰靶点结合接下来的aa的裂解物。其中被双硫键键合的半胱氨酸对的一个半胱氨酸位于ab内。这样的定位是可取的，可以在暴露于还原剂中时避免干扰ab-靶点的结合。典型的由半胱氨酸之间的双硫键姓曾环状结构的aa具有一般公式：xni-(cysi)-xm-cm-ab-(cys2)-xn2x111-cjczo[ccyso-xn1-cm-ab-(cys2)]-xn2其中xn1和xn2相互独立，选择性地出现或不出现，当出现时，独立地代表任何氨基酸，并且选择性地包括一个灵活连接体的氨基酸序列(例如，至少一个giy,ser,asn,asp,通常至少以一个giy或ser,通常至少是一个giy)，以及n1和n2是独立地选自从0到任何整数，通常或不多于1,2,3,4,5,6,7,8,9或10。cysi和cys2代表一对能形成双硫键的第一和第二半胱氨酸。x1n代表掩蔽基团(mm)的氨基酸，其中x是任何氨基酸，xm是可选的包括一个灵活的连接体(例如，至少一个giy,ser,asn,asp,通常至少以一个giy或ser,通常至少是一个giy)，m是一个大于1的整数，统称是2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大(如上所述)。cm代表一种裂解基团(如本发明所述)；以及ab代表一种抗体或抗体片段(如本发明所述)。如上述公式中所使用的，cyclo表示aa中的双硫键从而为aa提供一个环状结构。此外，上述公式考虑了双靶点连接的aa，其中mm是指一个ab1，ab是指ab2，其中ab1和ab2任意指定为第一和第二ab，其中与ab结合的靶点可以是相同或不同的靶点，或对同一靶点的相同或不同的结合位点。在这中实施例中，ab1和/或ab2起掩蔽基团的作用干扰未裂解的双靶结合aa与靶点的结合。如上所述，半胱氨酸可以定位在aa允许有一个或两个尾端(用代表xn1及xn2代表)，当aa是在一个双硫键结构中时(从而处于构象约束状态)，从而产生一个套索或ω结构。尾部的氨基酸序列(s)可以为aa提供额外的功能，如，便于使aa定位结合到靶点的受体。在某些具体的实施例中，mm不抑制aa的细胞进入。(c)裂解基团(cm)(c)裂解底物(cm)在一些实施例中，aa的裂解基团(cm)可以包括一种作为蛋白酶底物的氨基酸序列，通常是一种胞外蛋白酶。在其他实施例中，cm包含一个能够形成双硫键的并能被一种还原剂裂解的半胱氨酸-半胱氨酸对。在其他实施例中，cm包含一种能被光解作用裂解的底物。cm定位于aa中，这样，当cm被一种裂解剂(例如cm的蛋白酶底物被该蛋白酶裂解，和或半胱氨酸-半胱氨酸双硫键被暴露于一种还原剂时通过还原作用被打断)、光诱导的光解作用裂解，在靶点存在时，导致一种裂解状态，ab与靶点结合，并且在一种未裂解装填，在靶点存在时，ab与靶点的结合被mm抑制(图2)。应该指出，该cm的氨基酸序列可以重叠或包括在mm中，这样，当aa处于未抑制或未裂解或未掩蔽结构时，全部或部分的cm易于对ab进行掩蔽。cm可以根根据一种在组织中与aa中的ab的靶点共存的蛋白酶进行选择。在已知的各种不容的条件下，一种目标靶点与蛋白质共存，其中蛋白酶的底物是为本领域所熟知的。在癌的例子中，靶点组织可以是一种癌组织，特别是一种实体瘤的癌组织。有文献报道，在许多癌症，如实体瘤中提高了已知底物的蛋白酶的水平。see,e.g.,laroccaetal,(2004)britishj.ofcancer90(7):1414-1421。非限制性的疾病的例子包括：所有类型的癌症(乳腺癌、肺癌、大肠癌、前列腺癌、头颈部癌、胰腺癌等)、类风湿关节炎、克罗恩病、黑色素瘤、系统性红斑狼疮、心血管损害、缺血等。此外，抗生血管靶点，如vegf众所周知。因此，其中aa中的ab的选择须满足能与一种抗生血管靶点如vegf结合、一个合适的cm，它将包含一种能被出现在癌治疗位点的一种蛋白酶裂解的肽，特别是与没有癌变的组织相比，在提高了蛋白酶水平的癌治疗位点。在其他实施例中，aa中的ab能与一种目标靶点结合并且cm可以是，例如天冬酰胺内肽酶，纤溶酶，tmprss-3/4、mtl-mmp、mmp-9、组织蛋白酶、凋亡酶、人类中性粒细胞弹性蛋白酶、β-分泌酶upa或psa。在其他实施例中，aa是由其他特定疾病蛋白酶、非癌的其他疾病如多发性硬化症或类风湿关节炎。通过将cm限制在ab的范围，未修饰或未裂解的cm能有效抑制或掩蔽ab。当cm被修饰(裂解、还原、光解)后，ab不在被抑制或解掩蔽而能与其靶点结合。aa可以包含多于一种cm如aa可能包括。例如，一个第一cm(cm1)和一个第二cm(cm2)。cm1和cm2可以是同一种酶(例如对该种酶表现不同结合亲和力)的不同底物、或不同酶的不容底物、或cm1是一种酶的底物而cm2是一种光解底物、或cm1是一种酶的底物而cm2是还原底物、或cm1是一种光解底物而cm2是还原底物等等。cm是能被一种试剂(即，酶、还原剂、光)在约以0.001-1500x104m4s"1或至少在0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500x104m-1s"1.的速率被具体修饰的(裂解、还原或光裂解)。一种酶和cm接触可以实现该酶对cm的特异性裂解。当aa包含一个耦合了mm的ab，以及cm在靶点存在和有足够酶活的条件先，cm可以被裂解。足够的酶活可以指酶与cm接触并对其有效裂解的能力。可以很容易地设想，一种酶可在附近的cm，但由于该酶对其他的细胞因子或蛋白质修饰无法裂解cm。典型的底物包括但不限于被下列表3中的一种或多种酶或蛋白酶裂解的底物。表3典型的酶/蛋白酶此外，aa中的ab可以是与目标靶点结合的而cm可以包括一个半胱氨酸对的双硫键，是可以被一种还原剂例如但不限于细胞还原剂如谷胱甘肽(gsh)、硫氧还蛋白、nadph、核黄素、抗坏血酸等可裂解的，细胞还原剂是可以在实体瘤组织或围绕实体瘤组织大量存在的。(d)连接体本发明所述的在复合物中适宜使用的连接体一般是提供修饰ab或aa的灵活性以便易于抑制ab与靶点结合的物质。种连接体通常称为灵活的连接体。适用的连接体，应可以很容易地选择和具有任何适宜的不同长度，例如，从1氨基酸(例如，giy)到20氨基酸，从2氨基酸到15氨基酸，从3氨基酸到12氨基酸，包括从4氨基酸到10氨基酸，从5氨基酸到9氨基酸，从6氨基酸到8氨基酸，或从7氨基酸到8氨基酸，以及可能是1,2,3,4,5,6,或7氨基酸。典型的灵活连接体包括，甘氨酸聚合物(g)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(gs)n，(gsggs)n和(gggs)n，其中n是一个整数，至少是1)、甘氨酸、丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、以及其他本领域熟知的灵活的连接体。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，所以可能作为组件之间的中立的纽带。甘氨酸甚至比丙氨酸更能进入φ-φ空间，并且比带有较长侧链的残基所受的限制小的多(seescheraga,rev.computationalchem.11173-142(1992))。典型的灵活连接体包括，但不限于，gly-gly-ser-gly、gly-gly-ser-gly-gly、giy-ser-gly-ser-gly、gly-ser-gly-gly-gly、gly-gly-gly-ser-gly、gly-ser-ser-ser-gly等。本领域一般的技术人员将会认识到，一个aa的设计可以包括全部或部分是灵活连接体，这样，该连接体可包括一个灵活的连接体以及将一个或多个部分赋予不太灵活的结构以提供所需的aa的结构。(e)额外基元此外上述基元外，修饰的ab和aa可含有额外的基元，例如，aa的氨基酸序列的n-或c-末端。例如，aa可包括一个易于传递到细胞或目标组织的靶向基团。次啊外，在下文进一步讨论的aa库中，可以提供在支架蛋白背景下的aa，以便于细胞表面上aa的显示。典型的实施例本发明提供的药物成分和aa对于包括治疗和诊断的多种目的非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗egfr、一种耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗egfr、耦合了一种mm的tmprss-3/4激活的抗egfr、耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的西妥昔单抗、耦合了一种mm的纤溶酶激活的西妥昔单抗、耦合了一种一种mm的tmprss-3/4激活的西妥昔单抗、耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的帕尼单抗、合了一种mm的纤溶酶激活的帕尼单抗或耦合了一种mm的tmprss-3/4激活的帕尼单抗。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断头颈部癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一种mm的mmp9激活的抗tnfα、耦合了一种mm的mtl-mmp激活的抗tnfα、耦合了一种mm的组织蛋白酶激活的抗tnfα、耦合了mm的mmp9激活的英利昔单抗、耦合了一种mm的mmp9激活的阿达木单抗、耦合了一种mm的mtl-mmp激活的阿达木单抗、或耦合了一种mm的组织蛋白酶激活的阿达木单抗。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断类风湿关节炎或多发性硬化症非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗cd11a、耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗cd11a、耦合了一种mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗cd11a、耦合了一种mm的组织蛋白酶激活的抗cd11a、耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的激活的依法珠单抗、耦合了一种mm的纤溶酶激活的依法珠单抗、耦合了一种mm的半胱天冬蛋白酶激活的依法珠单抗、耦合了一种mm的组织蛋白酶激活的依法珠单抗、耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗csfr、耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗csfr、耦合了一种mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗csfr或耦合了一种mm的组织蛋白酶激活的抗csfr。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断与肿瘤相关的巨噬细胞癌非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗ctla-4、耦合了一种mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗ctla-4、耦合一种了mm的mtl-mmp激活的抗ctla-4、耦合了一种mm的纤溶酶激活的伊匹单抗、耦合了mm的半胱天冬蛋白酶激活的伊匹单抗。耦合了mm的mtl-mmp激活的伊匹单抗、耦合了一种mm的纤溶酶激活的tremelimumab(ctla-4单抗)、耦合了一种mm的半胱天冬蛋白酶激活的tremelimumab(ctla-4单抗)或耦合了一种mm的mtl-mmp激活的tremelimumab(ctla-4单抗)。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断恶性黑色素瘤非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一种mm的psa激活的抗epcam、耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗epcam、耦合了一种mm的psa激活的阿德木单抗或耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的阿德木单抗。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断前列腺癌非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了mm的人中性粒细胞弹性蛋白酶激活的抗cd40l，或一种人类中性粒细胞弹性蛋白酶激活的hu5c8。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断淋巴瘤非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了mm的β-分泌酶激活的抗notchl、耦合了一个mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗notchl、耦合了一个mm的upa激活的抗notchl、耦合了一个mm的β-分泌酶激活的抗notch3、耦合了一个mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗notch3、耦合了一个mm的纤溶酶激活的抗notch3、耦合了一个mm的upa激活的抗notch3、耦合了一个mm的β-分泌酶激活的抗jaggedl、耦合了一个mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗jaggedl、耦合了一个mm的纤溶酶激活的抗jaggedl、耦合了一个mm的upa激活的抗jaggedl、耦合了一个mm的β-分泌酶激活的抗jagged2、耦合了一个mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗jagged2、耦合了一个mm的纤溶酶激活的抗jagged2或耦合了一个mm的upa激活的抗jagged2。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断三阴性(er，pr和her2阴性)的乳房、头部和颈部、结肠癌和其他癌非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一个mm的mmp激活的抗cd52或耦合了一个mm的mmp激活的抗阿仑单抗。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断多发性硬化症非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一种mm的mmp激活的抗mucl、耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗mucl、耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗mucl、或耦合了一种mm的一种upa激活的抗mucl。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断上皮细胞衍生的肿瘤非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗igflr、耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗igflr、耦合了mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗igflr、耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗figitumumab单抗、耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗figitumumab单抗或耦合了一种mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗figitumumab单抗。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断非小细胞肺癌和其他上皮性肿瘤非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗转铁蛋白受体、耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗转铁蛋白受体或耦合了一种mm的半胱天冬蛋白酶激活的抗转铁蛋白受体。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断固体肿瘤、胰腺肿瘤非常有用。本发明提供的一种典型的aa可以是一种耦合了一种mm的天冬酰胺内肽酶激活的抗gpl30、耦合了一种mm的纤溶酶激活的抗gpl30、或耦合了一种mm的一种upa激活的抗gpl30。在一些实施例中，这些氨基酸对治疗或诊断实体瘤非常有用。在一些其他非限制性的典型实施例中，激活的抗体组成包括一种专门用于notch1的天冬酰胺内肽酶掩蔽的ab、一种专门用于jagged1的upa激活的掩蔽ab、一种纤溶酶激活、掩蔽的抗vegfscfv、一种mmp-9激活、掩蔽的抗vcamscfv以及一种mmp-9激活、掩蔽的抗ctla4。如列于表1但不限于表其中提供的这些aa仅作为例子，并且这些酶激活的掩蔽抗体aa可设计成对任何靶点，并且通过使用列于但不限于表2的任何抗体。激活的抗体复合物在本发明的一方面，aa是以含有两个或多个ab的复合物的形式存在，如图34-36所描绘的。本发明提供了激活抗体的复合物(aacs)，其表现出与一个或多个靶点蛋白的激活/可转换结合。aacs通常包括一个或多个抗体或抗体片段(abs)、掩蔽基团(mms)以及裂解基团(cms)。在一些实施例中，cm包含一种作为目标蛋白酶底物的氨基酸序列。在其他实施例中，cm提供一种能被还原剂裂解的半胱氨酸-半胱氨酸双硫键。aac表现出一种激活的结构这样，当未修饰和经过经过修饰的cm相比，至少有一个ab不能接近靶点，例如，在一种裂解剂存在(一种确定cm内裂解位点的蛋白酶)或一种还原剂(例如，一种还原cm内双硫键的还原剂)存在时。aac中的cm和ab可以这样选择：ab代表目标靶点中的连接基团，而cm代表用于在主体治疗位置与靶点共存的一种蛋白酶的底物。在一些实施例中，aacs可以提供降低毒性和/或不良的副作用，如果他们没有被掩蔽，否则可能导致ab在非治疗部位结合的结果。在一些实施例中，aac可以进一步包含一种检测极端或一种诊断剂。在某些实施例中，aac与一种治疗即共轭定位于抗原结合域的外边。aacs也被用于诊断和/或成像阿凡能够发或在样品中测试一种裂解剂是否存在。图43提供了aac的一种原理图。如图所示，aac的基元安排为，cm处于裂解状态(或相对活性状态)，在靶点存在下，ab与靶点结合，而在未裂解状态(或相对失活状态)，在靶点存在下，由于ab在组合物中被mm掩蔽，ab与靶点结合的被抑制。如本发明所使用的，术语裂解状态是指aac伴随cm被一种酶裂解的状态和/或cm的半胱氨酸-半胱氨酸双硫键的还原状态。术语未裂解状态是指aac伴随cm未出现被一种酶裂解的状态和/或未出现cm的半胱氨酸-半胱氨酸双硫键的还原状态。如上所述，本发明所使用的术语aac是指在未裂解(原始状态)和裂解两种状态下的aac。对本领域一般的技术人员来说是明确的，在一些实施例中，由于mm被蛋白酶所裂解，故一个裂解的aac中可能缺少一个mm，从而至少导致该mm的释放(例如mm没有通过共价键与aac结合。)可激活的或可转换的意思是当在一种原始或未裂解状态(即，一种第一结构)时，aac表现出一种与其靶点结合的第一水平，以及在裂解状态(即，一种第二结构)时aac表现出一种与其靶点结合的第二水平，其中与其靶点结合的第二水平大于与其靶点结合的第一水平。一般地，在能够裂解cm的裂解剂存在时靶点到达aac的ab程度比在裂解剂不存在时是大。这样，当在原始或未裂解状态时，ab与靶点的结合被掩蔽(即，第一结构是干扰靶点接近ab)，并且裂解状态的ab被解掩蔽，与靶点结合。一般地，一个aac可以通过选择一种目标ab(s)和构建aac的剩余部分进行设计，这样，当存在构象约束是，mm为ab提供掩蔽。双靶点结合的aacs包含两个abs，其可以与相同或不同的靶点结合。在具体的实施例中双靶点aacs包含双特异性抗体或抗体片段。在某些实施例中，一种复合物包含两个可激活抗体(aa)，每一个包含一个ab、cm或mm，这样发生交叉掩蔽，也就是在一个aa上的mm干扰在另一个aa上的ab与靶点的结合(图34a)。在其他实施例中，一种组合物博阿含两个aa，每一个aa包含一个ab并且其中一个含有一个cm和一个mm，这样，交叉掩蔽将普遍发生，也就是，mm影响组合物的形成并干扰补体与在两个aa上的ab的形成(图34b)。在其他实施例中，一种组合物包含两个aa，每一个含有两个ab、cm和mm，这样会发生交叉掩蔽，也就是，在一个aa上的mm干扰在其他aa上的ab与靶点的结合(图34c)。在其他实施例中，一种组合物包含两个aa，其中一个aa含有两个ab、cm和mm，这样，交叉掩蔽将普遍发生，也就是，mm干扰在两个aa上的ab与靶点的结合(图34d)。在其他实施例中，一种组合物包含两个双特异性aa的分子，其中双特异性aa含有两个ab、cm和mm，这样，交叉掩蔽在该组合物内发生，也就是说，mm1干扰在分子另一端的ab1与靶点的结合，以及mm2干扰在分子另一端的ab2与靶点的结合(图34e)。在其他实施例中，一种组合物包含两个双特异性aa的分子，其中双特异性aa含有两个ab、一个cm和一个mm，这样，交叉掩蔽在该组合物内普遍发生，也就是，mm干扰在两个ab与靶点的结合(图34f)。一般地，在能裂解cms的裂解剂存在比不存在时，aac的拆分和靶点接近至少一个aacs的ab更容易(图35)。一种复合物物中的两个aa可以包含结合不同靶点的abs或在同一靶点上的不同表位。该复合物中的一个mm/ab对可用于稳定的复合物的形成并且其本身没有需治疗的靶点。一种对非治疗ab有高亲和力的mm允许一种稳定复合物的形成，甚至对治疗的ab有低亲和力的mm。多价复何物的背景下，这种对治疗的ab有低亲和力的mm将有效掩蔽治疗的ab，但是裂解后将更易于离解。为了在裂解状态下达到最大的与靶点的结合，mm与ab的靶点的亲和力的差别应该是最大的。在其他实施例中，ab可与复合物分子另一端的mm形成一个共价键连接。在裂解剂存在时，复合物离解，这样将至少有一个ab与其靶点结合(图36)。这样的共价键连接可在mm中的反应性氨基酸的支链与ab，如半胱氨酸中间的双硫键之间形成，或者通过反应基团与mm和一种催化ab的化学共轭形成。共价见连接抗体的例子见chmuraa.j.etal.,procnatlacadsciusa.2001july17,98(15):8480-8484；rader,c.etal.,procnatlacadsciusa.2003april29,100(9):5396-5400；armentano,f.etal.,immunologyletters2006february28,103(1):51-57.应该指出，尽管mm和cm被指为不同的组件，但可以设想mm和cm的氨基酸序列是可以重叠的。例如，这样cm可以完全或部分包含在mm中。在许多实施例中，在aac结构中插入一个或多个连接体，例如灵活的连接体，以便在一个或多个mm-cm的结合部位、cm-ab结合部位或两者提供灵活性可能是需要的。此外，对上述的基元，aacs可包含额外的基元如，例如氨基酸序列、aac的n-或c-末端。可激活的抗体轭合物在本发明的一方面，aa的ab进一步与一种制剂如一种治疗药剂共轭，从生成一种可激活的抗体轭合物(aacjs)，即一种特定类型的aa。该制剂或直接或通过一个连接体与ab连接。这种制剂或连接体选择性地与那些abs那些区域连接。这些区域不是该分子的抗原连接位点的一部分或没有直接包含在该分子的抗原连接位点。典型的aacj见图20。根据本发明的一个实施例，一种制剂可以与一个ab共轭。当需要与ab共轭的制剂传递和释放时，可使用熟知的免疫球蛋白类激活补体。在其他应用中，可能使用不能激活补体的载体免疫球蛋白。这种免疫球蛋白载体可包括：某些抗体类如igm、iga、igd、ige，某些igg的亚类，或某些免疫球蛋白的片段，如，半abs(一种单重链：轻链对)，或fab、fab'，或(fab1)2片段。典型的aacj是耦合到一种治疗及的aa，其中ab是egfr、cd44、notchl、2、3或4，jagged1或2，epcam或igf-ir。本发明描述的化学连接方法允许产物aacj维持与抗原结合并激活补体级联的能力(当非共轭的aa也具有这种能力时)。所以，当aacj供给一个个体是，接下来在体内形成的免疫复合物和靶点抗原一起能激活该个体的血清补体系统。连接体被设计成易于被补体裂解的，这样该制剂能在靶点位点被一种或多种补体级联的酶裂解。随着传递到靶点位点，发生大多数制剂的释放。在一个典型的实施例中，众所周知，所有的肿瘤细胞不是每一个都拥有靶点抗原决定簇。这样，需要内化到靶点细胞的传递系统将成功地实现向那些拥有抗原决定簇的肿瘤细胞的传递并能内化这个轭合物。确实拥有抗原决定簇或不能内化的肿瘤细胞将逃避治疗。根据本发明的方法，aacjs将制剂传递到靶点。然而，更重要的是，一旦与靶点结合，本发明所述的方法允许活性或可激活治疗制剂的释放或激活。可被个体介导的释放或激活可通过如下但不限于这些物质激活：补体酶、组织型纤溶酶激活因子、尿激酶、纤维蛋白溶酶或另一种有蛋白水解酶活性的、或通过光敏剂激活或底物修饰的酶。一旦被释放，制剂就会自由地渗透到靶点位点，例如，肿块。结果，制剂将作用于没有抗原决定簇或不能内化这种轭合物的肿瘤细胞。此外，整个过程不依赖与轭合物的内化。用于共轭剂的方法本发明使用几种方法连接试剂到abs(包括抗体和抗体片段)，有两种典型的方法连接到ab的碳水化合物基团、或连接到ab的巯基的方法。在某些实施例中，连接不能显著改变ab的基本特征或aa本身，如免疫特征或免疫活性。其他注意事项包括反应的简洁性和生成的抗体轭合物的稳定性。在某些实施例中，ab首先与一个或多个目标试剂轭合然后与mm和cm连接生产一个aacj。在其他实施例中，ab首先与一个mm和cm连接然后与一个目标试剂以进一步轭合生成一个aacj。i.连接到氧化碳水化合物基团在某些实施例中，试剂可能与一个ab的碳水化合物基团连接。一些碳水化合物基团位于免疫球蛋白fc区域，为了与c1连接的发生这些基团是需要的。所述的位于免疫球蛋白fc区域的碳水化合物基团可用于本发明的实施例的略图中，其中ab是至少包含部分fc区域的一个抗体或抗体片段。包含碳水化合物基团的任何fab或fab'的片段可用于本发明的反应图中。一个这种免疫球蛋白的例子是由putnam等(1973,science182:287)排序的人类igm。抗体的碳水化合物侧链、fab或fab'片段或其他含有ab的片段可被选择性地氧化形成醛。有许多氧化剂如高碘酸、仲过碘酸、偏高碘酸钠或偏高碘酸钾可以使用。然后得到的醛可以与胺基(氨衍生物如伯胺、仲胺、羟胺、肼、酰肼、苯肼、氨基脲或硫脲)反应生成一个schiff碱或还原的schiff碱(例如：亚胺、烯胺、肟、腙、苯腙、缩氨基脲、氨基硫脲或其还原形式)。在us4867973中提供了抗体的化学氧化方法并且本专利的全部内容作为文献纳入本发明。使用这些氧化剂对抗体氧化可以通过熟知的方法实现。在氧化过程中，ab一般以一种水溶液形式使用，浓度一般低于100mg/ml，首选1到20mg/ml。当一种氧酸或其盐用于氧化剂时，一般以水溶液的方式使用，浓度一般为0.001到10mm，有时为1.0到10mm。氧酸或其盐的量根据ab的类型确定，但一般过量使用，例如，可氧化的碳水化合物的二到10倍。然而，最优化的用量可由例行试验确定。在用其氧酸或盐氧化abs的过程中，可选择的范围包括一种ph大约为4～8的区域，温度范围为0～37℃以及反应时间约为15分钟到12小时。在用其氧酸或盐的氧化过程中，反应可以在最小的光照下实现以便过度氧化。另外，ab的可以用酶技术碳水化合物修饰以便能连接到或与其他化学基团反应。一个这种没的例子是半乳糖氧化酶，它能在氧存在的条件下氧化半乳糖形成一种醛。abs中的碳水化物部分的氧化也可以由酶、半乳糖氧化酶实现(cooperetal.,1959,j.biol.chem.234:445-448)。在水溶液中使用的抗体浓度一般约为5到100单位每毫升溶液，ph范围约为5.5到8。ph、底物浓度、缓冲剂和缓冲剂的浓度对酶反应的影响在cooperetal.,supra有报道。本发明的ab轭合物、aa轭合物或ab连接中间体可以通过用连接剂或选自伯胺、二胺、肼，酰肼，羟胺，苯肼，氨基脲和硫脲组所构成的组中含有胺的基团与氧化的ab进行反应生成。在一个典型的方法中，一种浓度约为0.5到20mg/ml的氧化的ab或ab的连接剂与该试剂或连接剂(反应氨基与抗体醛的摩尔比约为1到10000)混合并且将该溶液培养约1到18小时，适宜的温度为0到37℃，ph为6到8。轭合物形成后，用适宜的还原剂如氰基钠或硼氢化钠对其进行选择性地稳定。ii.连接到巯基基团当ab是一个完整的抗体或包括至少一部分重量是，从免疫球蛋白的双硫键可生成自由巯基基团，这可通过抗体的轻度还原实现。易于还原的igg的双硫键一般是那些连接这两个重链的双硫键。靠近抗原结合域的双硫键保持相对不受影响的状态。这种还原导致与连接补体能力的丧失但不干扰与抗体-抗原的结合能力(karushetal,1979,biochem.18:2226-2232)。在内重链区域产生的自由巯基基团与连接体或试剂的反应基团反应形成一个降低对免疫球蛋白的抗原结合位点干扰的共价键。这些反应基团包括，但不限于，反应性卤化烷基基团(包括，例如，卤酰基基团)、对汞苯甲酸基团和能进行michael型加成反应的基团(包括，例如，mitraandlawton，1979,j.amer.chem.soc.101:3097-3110描述的马来酰亚胺和具有这种类的型基团)，这些卤化烷基可以是任何被溴、碘、氯取代的烷基基团。本发明一般性描述的适于抗体或抗体片段还原的条件、方法和材料的细节可以在stanworthandturner,1973中、handbookofexperimentalimmunology,vol.1,secondedition,weir(ed.),chapter10,blackwellscientificpublications,london,中找到。其中的章节作为文献纳入本发明。通过连接到还原的免疫球蛋白的自由巯基基团或还原的抗体片段生成的ab-试剂轭合物(或ab-连接体中间体)不能激活补体或对补体的激活可以忽略不计。这样，这些轭合物可以用于不希望裂解和释放试剂的体内系统(例如，一种作为特定底物的酶)。这些轭合物也可以在需要无补体介导的释放时使用。在这样的一个实施例中，试剂可能与一个在还原的ab上的巯基通过易于由具有蛋白水解活性的酶裂解的连接体连接，包括但不限于胰蛋白酶、尿激酶、纤溶酶，组织型纤溶酶原激活物等等。尽管ab的巯基与一种试剂的连接降低补体结合的共轭能力，这种方法可用于在补体介导的释放系统生成需要使用的aa轭合物。在这样的一个实施例中，一种试剂与一种补体敏感的底物连接体结合可以与还原的abs的一个巯基连接，并在含有能激活补体的未共轭aa的混合中被传递到靶点。后者将激化补体，而补体将裂解来自前者的试剂。根据本发明的一个实施例，为了连接到还原的abs或aas的巯基，通过连在连接体的一段连接一个碘烷基基团对底物连接体或试剂进行修饰。连接体上未被修饰的位点可能或不可能以共价键方式与一种试剂连接。例如，以酯基或酰胺基连接试剂的底物连接体通过加入一个碘烷基基团进行修饰从而形成一个碘烷基衍生物。如前所述，连接体可能是易于或抵抗激活的补体、胰蛋白酶、纤溶酶原、组织型纤溶酶原激活物、尿激酶或其他特定的具有蛋白水解酶活性的酶激活的。与ab共轭的制剂abs可以与任何与ab反应后保持其潜在性质并能使ab大幅度地保持免疫特定剂免疫活性允许aa有适当功能的制剂结合。该试剂包括所有的化学修饰物和大幅度地保持其生出活性的制剂衍生物。当连接一个ab的糖类氧化部分的醛基到一种制剂时，该制剂应包含一种选自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和硫脲基团所构成的组中的氨基。如果该制剂不含任何这种氨基，则该制剂可以被修饰引入一个适当的能耦合的氨基基团。在aa中使用的连接ab的试剂根据预计的应用(即，杀死、阻止细胞增殖、激素替代疗法或基因疗法)目的进行选择。这种试剂包括但不限于，例如，药物制剂、毒素、毒素的片段、烷化剂、酶制剂、抗生素、抗代谢药物、抗增殖剂，激素、神经递质、dna、rna的sirna、寡核苷酸、反义rna、适体、诊断试剂、不透明辐射染料、放射性同位素、荧光化合物、磁标签、纳米粒子、标记化合物、凝集素、改变细胞膜透性的化合物、光化学化合物、小分子、脂质体，胶束、基因治疗载体、病毒载体等。本发明所述的可能使用的一些典型的药剂列于表4，但表4是非限制性的，也并不意味着是一个详尽的清单。最后，也可能使用试剂的组合物或不同类型试剂的组合物。根据本发明的一个实施例，光化学物质包括光敏剂和光热剂可以用作试剂。有效的光敏剂包括但不限于卟啉和修饰卟啉(例如，血卟啉、血卟啉二甲酰肼、亚卟啉二甲酰肼和原卟啉二甲酰肼)、玫瑰红，吖啶类、噻嗪类、氧杂蒽类、蒽醌类，吖嗪类、黄素和非金属含有卟啉、卟啉类化合物、亚甲蓝、曙红、咖啡因等。其他光敏剂包括但不限于，四环素类药物(如二甲基氯四环素)磺胺类药物(如磺胺类)、灰黄霉素、酚噻嗪类(如氯丙嗪)、噻嗪类、磺酰脲类以及许多其他类型。光化学物质可以设计成或合成制备成吸收特定波长的光。可以在作用位点被光源激活光热剂，如天青a(seeandersonandparrish,1983,science220:524-527)可被用作试剂。根据本发明的另一个实施例，催化底物修饰并伴随细胞毒性副产物产生的酶被用作试剂。这种酶的例子包括但不限于葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、氧杂蒽氧化酶等。表4用于共轭的典型药剂(c)共轭制剂的连接体本发明使用几种方法供abs与制剂连接：(a)连接到ab的碳水化合物基团，或(b)连接到ab的巯基基团。根据本发明，abs可以通过一种中间连接体以共价键与试剂连接，其中的中间连接体有两个基团，一个与ab反应，一个与试剂反应。该连接体可以包括任何适宜的有机化合物，可以按照与ab(或试剂)反应但不影响ab的反应活性与选择性进行选择。另外，连接体与ab连接是不破坏试剂的活性。适于与氧化抗体或氧化抗体片段反应的连接体包括那些含有一个选自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和硫脲基团所构成的组中的氨基。这些反应功能基团可能以连接体结构的一部分存在，或通过对不含这种基团的连接体进行适当的化学修饰引入。根据本发明，适与连接到还原的ab是的连接体包括那些，能与一个还原态抗体或片段的巯基反应的具有某种反应基团的连接体。这种反应基团包括，但不限于，反应性卤化烷基基团(包括，例如，卤酰基基团)、对汞苯甲酸基团和能进行michael型加成反应的基团(包括，例如，mitraandlawton，1979,j.amer.chem.soc.101:3097-3110描述的马来酰亚胺和具有这种类的型基团)。该试剂可以在连接体连接到ab之前或之后与连接体连接。在某些应用中，首先生成一种独立于相关的制剂的ab-连接体的中间产物是必要的。根据特定的应用，一个特定的制剂以共价连接到一个连接体。在其他实施例中，ab首先与mm、cm剂相关的连接体相连接，然后与连接体连接达到共轭的目的。(i)支化连接体在具体的实施例中，使用了具有多个供制剂连接位点的支化连接体，对于多位点连接体，一个与ab的单共价键连接将产生一种能在多个位点连接制剂的ab-连接体中间产物。这些位点可以是醛或巯基基团或任何制剂能被连接的化学位点。此外，通过单位点连接体的连接在多个ab上的位点可实现较高的特异性活性(或较高的制剂对ab的比例)。通过两种方法中的任何一种可以将这些为此案引入到ab。首先是在同一ab上产生多个醛基和/或巯基。其次是在ab的醛基和/或巯基连接上有多个双功能位点接下来用于与连接体连接的一个支化连接体。支化连接体的这些双功能位点或多位点连接体可以是醛基或巯基基团，或任何与连接体连接的化学位点。通过结合这两种方法可能会获得更高的特异性活性，也就是，在ab的几个位点上连接具有多个位点的连接体。(ii)可裂解连接体在本发明的一个实施例中可能使用容易被如但不限于尿激酶、组织型纤溶酶原激活物、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶、或另一种蛋白水解酶活性的酶的补体系统的酶裂解的肽连接体。根据本发明的一种方法，一种通过易于被补体裂解的连接体被连接。这种抗体选自能激活补体的类型。这样，该抗体剂共轭物激活补体级联并在靶点问点释放这种试剂。根据本发明的另一种方法，一种制剂通过易于被具有蛋白水解酶活性如尿激酶、组织plasimogen激活因子、纤维蛋白溶酶，胰蛋白酶裂解的连接体被连接。非限制性的可裂解的连接体序列的例子列于表5。表5：用于共轭的典型连接剂序列此外，制剂可以通过双硫键(例如，半胱氨酸分子的双硫键)与ab连接。由于许多肿瘤天然地释放出高水平的谷胱甘肽(一种还原剂)，这可以还原双硫键，接着在传递位点释放出该制剂。在某些具体的实施例中，这种能修饰cm还原剂也能修饰共轭aa的连接体。(iii)间隔和可裂解基元在另一个实施例中，有必要以这样的方式构件连接体以优化制剂与aa中的ab的间隔。这可由使用一般结构的连接体实现：w-(ch2)n-qwhereinwiseither-nh-ch2-or-ch2-；qisanaminoacid,peptide；andnisanintegerfrom0to20.w-(ch2)n-q其中w是-nh-ch2-或-ch2-，q是一种氨基酸、肽，n是一个从0到20的整数。在另一个实施例中，连接体可以包含一个间隔基元和一个裂解基元。间隔基元使可裂解基元的位置远离ab的核心，这样使可裂解基元易于接近起裂解作用的酶。上文中描述的某些支化连接体可以作为间隔基元。通过上述讨论，应该理解连接体与制剂的连接(或间隔基元与可裂解基元或可裂解基元与制剂)不需要特别的连接或反应模式。任何能提供适宜的稳定性的产物的反应及生物兼容性都是可接受的。(iv)血清补体和连接体的选择根据本发明提供的方法，当需要释放药剂时，使用一类抗体ab激活补体。形成的轭合物保持与抗原结合和激活补体级联两种能力。这样，根据本发明的该实施例，一种药剂与裂解连接体或裂解单元的一段连接，另一端的连接基团连接到在ab的一个具体位点。例如，如果该试剂有一个羟基或氨基，它可通过酯或酰胺键分别连接到肽、氨基酸或其他选择适当的连接体的羧基末端。例如，这类制剂可通过一个碳化二亚胺反应连接到肽连接体。如果该试剂含有干扰连接到连接体的双功能基团，这些具有干扰作用的双功能基团在连接前被阻碍而一旦作为产物的产物轭合物或中间体形成则被解阻碍。然后连接体的另一端即氨基酸末端或直接或进一步经过修饰与一个能激活补体的ab连接。连接体(或连接体的间隔基元)可以是具有任何需要的长度、其一端是连接aa的ab上的特异性位点的共价键。连接体或间隔基元的另一端可与一种氨基酸或肽连接体连接。这样，当在补体存在下这些轭合物与抗原连接，连接制剂与连接体的酰胺或酯键将被裂解，导致制剂以及活性性质释放。当这些轭合物供给一个主体时，将在靶点位点实现制剂的传递与释放。，特别是在体内的对如表4中但不限于此的药剂、抗生素、抗代谢药物、抗增殖剂等的有效传递。(v)用于无补体激活释放的连接剂在其他靶向传递的应用中，由于补体级联激化将最终裂解靶点细胞，因此希望补体未激活时释放药剂。所以当药剂的传递和释放在不杀死靶点细胞的情况下实现，这种结合是有用的。当需要细胞介体如激素、酶、糖皮质激素、神经递质、基因或酶到靶点细胞的传递时，这就是理想的目标。这些轭合物可通过在药剂上连接一个不能由对血清蛋白酶裂解轻度易感的连接体激活的补体上的ab制得。当这种轭合物给一个个体时，抗原抗体复合物将快速形成而药剂的裂解将缓慢地发生。这样导致化合物在靶点位点释放。生化交联剂在其他实施例中，使用某些生化交联剂aa可与一种或多种药剂共轭。交联剂将两种不同分子的官能团绑在一起形成分子桥。采用一步法连接两个不同的蛋白质，可以使用杂双功能交联剂消除不必要的均聚物形成。典型的杂双功能交联剂参见表6.表6典型杂双功能交联剂(vii)非裂解连接剂或直接连接剂在本发明的其他实施例中，轭合物可以设计成试剂可以被传递到靶点但不释放。这可以通过将试剂直连接到或通过一个非裂解连接剂连接到ab而达成。这些非裂解连接剂可包括氨基酸、肽、d-氨基酸或其他能被修饰、含有官能团随后用本发明的方连接到abs上的有机化合物。一个说明这种有机连接剂的一般性的式子可以是w-(ch2)n-q，其中w是-nh-ch2-或-ch2-；q是在一种氨基酸、肽，n是一个从0到20的整数。(viii)非裂解的轭合物另外，化合物可能会连接不激活补体的abs。当使用abs不能激活补体，此连接可使用容易被激活的补体裂解的连接体或不容易被激活的补体裂解连接体达成。(d)使用激活抗体的共轭剂本发明的aa共轭剂(aacjs)在治疗、诊断、底物修饰等方面非常有用。本发明的aacjs在各种体内应用的治疗非常有用，例如，但不限于，肿瘤的治疗，包括癌、腺瘤、增生；某些免疫疾病，包括自身免疫性疾病，移植物抗宿主疾病(如骨髓移植后)，免疫抑制性疾病，如肾脏或骨髓移植后。这些细胞紊乱等的治疗，包括，例如，骨髓移植，可能包括清除(杀死)不需要的细胞，例如，恶性细胞或成熟的t淋巴细胞。治疗应用一般集中于各种细胞疾病的治疗，包括上文广泛描述的疾病，通过供给本发明的一种足量的抗体药剂轭合物。抗体的性质是针对一种特定抗原特异性免疫及与其进行免疫反应的，使其非常适合于传递药剂到具体的细胞、组织、有机体或任何其他具有特定抗原的位点。根据本发明的这一方面，aacj其传递轭合物到靶点位点的作用。根据传递目的选择abs、连接体以及制备aacjs的试剂。在具体的靶点位点，试剂的传递和释放或激活可导致选择性地杀死或抑制肿瘤细胞、癌细胞、真菌、细菌、寄生虫或病毒的扩散。也能实现激素、酶、或神经递质向选定位点的靶向传递。本发明的方法最终可在基因治疗方案中应用，其中dna或特定的基因可能在体内或体外传递到存在特定基因缺陷的靶细胞。此外，轭合物可用于减少或防止原癌基因，如myc基因，ras基因等的激活。在体内给药可以包括在任何适宜的辅助物内使用aacjs试剂，其中辅助物包括血清和生理盐水、或有或没有另一种蛋白质如人血清白蛋白。轭合物的剂量可容易地由一般专业人员确定，也可以根据细胞紊乱的特点及试剂的使用有所不同。给药途径可以是肠外，一般首选静脉给药。底物修饰在本发明的另一个实施例中，底物活化剂可用于介导纯态氧或过氧化物的形成，并诱导细胞死亡。在本发明的优选实施例中，活化剂是一种酶。例如，半乳糖氧化酶氧化半乳糖和在c6位置的半乳糖衍生物。在氧化反应过程中中，氧分子转化为对邻近细胞有毒性的过氧化氢物质。酶的葡萄糖氧化酶，一种黄素酶，也可用于本发明的实施例。这种酶是对β-d-葡萄糖具有高度特异性，由于过氧化物的形成，可以作为一种抗生素。酶可直接或通过非裂解连接器连接到一个ab上。为一个主体供给有效剂量的aacj，然后用底物灌注。通过上述方法形成的过氧化物介导细胞死亡。过氧化物的毒性作用可能通过第二个酶的调控放大，优选的是人源酶，将过氧化转化成赌性更强的次氯酸。合适的酶的实施例包括但不仅限于髓过氧化物酶，乳过氧化物酶和氯过氧化物酶。用于识别和/或优化aas的显示方法和组合物识别和优化aas的方法，以及用于该方法的组合物，介绍如下。(a)在可可复制生物实体上显示的aas或候选aas库在一般情况下，用于可切换的表型的识别和/或优化aa的筛选方法，可以包括，其表面上显示多个不同的候选aa库的可复制生物实体的制备。这些库，然后可以接受筛选方法，以确定具有一个或多个所需氨基酸特征的候选aa。候选aa库可以包含由一个或更多的mm，连接器(这可能是mm的一部分)，cm(这可能是mm的一部分)，和ab不同的候选aa。在一个实施例中，库中氨基酸是mm和/或连接器的变量，随预选的ab和cm变化。aa包括多对半胱氨酸残基为aa提供一个二硫键，aa中半胱氨酸的相对位置可以是多种多样的。筛选库一般是提供一个可可复制生物实体，显示在不同的候选aa表面。例如，一个候选aa库可以包括多个显示一种可可复制生物实体的成员的表面的候选aa，其中所述多个候选aa的每个成员包括：(a)的抗体或其片段(ab)；(b)裂解基团(cm)；(c)候选掩蔽基团(候选mm)，其中的ab，cm和候选mm被定位以使候选mm能抑制ab结合到一个处于未裂解状态的标靶上，并使结合到处于裂解状态的标靶上的ab可以被确定。合适的可复制生物实体，包括细胞(如，细菌(如大肠杆菌)，酵母(如s.cerevesiae)，原生动物细胞，哺乳动物细胞)，噬菌体，病毒。在抗体显示技术是本领域众所周知的。(b)候选aa显示在可复制生物实体的表面上各种使用可复制生物实体的显示技术是本领域众所周知的。这些方法和实体，包括但不仅限于显示的方法，如mrna和核糖体展示，真核细胞的病毒显示，和细菌，酵母和哺乳动物细胞表面显示。seewilson,d.s.,etal.2001pnasusa98(7):3750-3755；muller,o.j.,etal.(2003)nat.biotechnol.3:312；bupp,k.andm.j.roth(2002)moi.ther.5(3):3293513；georgiou,g.,etal.,(1997)nat.biotechnol.15(1):293414；andboder,e.t.andk.d.wittrup(1997)naturebiotech.15(6):553557.表面显示方法是有吸引力的，因为它们能将荧光激活细胞分选(facs)应用与库的分析和筛选。seedaugherty,p.s.,etal.(2000)j.immuunol.methods243(12):2112716；georgiou,g.(2000)adv.proteinchem.55:293315；daugherty,p.s.,etal.(2000)pnasusa97(5):20293418；olsen,m.j.,etal.(2003)methodsmoi.biol.230:329342；boder,e.t.etal.(2000)pnasusa97(20):1070110705；mattheakis,l.c,etal.(1994)pnasusa91(19):90229026；andshusta,e.v.,etal.(1999)curr.opin.biotech.10(2):117122.其他可用于识别能够结合到目标生物标靶的肽的显示方法如美国专利第7256038号所述，其披露的内容作为参考纳入本发明。显示支架是指当在一个宿主细胞中表达时，多肽存在于宿主细胞的细胞外可及面，并用于可操作的连接异源多肽。例如，显示支架用于本发明所述方法，以方便筛选候选aa的筛选。提供显示支架可使目标异源多肽可以很容易地从显示支架释放，例如，蛋白酶的功能是，有利于融合蛋白的裂解，并释放从显示支架释放候选aa。噬菌体展示涉及末端融合到外壳蛋白的肽定位，如，具有噬菌体颗粒的pin，piiv。见scott,j.k.andg.p.smith(1990)science249(4967):386390；andlowman,h.b.,etal.(1991)biochem.30(45):1083210838。一般来说，结合有一个特定功能的多肽通过用一个标靶孵化，洗去未结合的噬菌体，洗脱结合的噬菌体进行分离，然后通过细菌感染新鲜培养物再放大噬菌体群。典型噬菌体展示和细胞展示组合物和方法如第5223409，5403484，7118159，6979538，7208293，5571698；5837500号美国专利所述。其他典型显示支架和方法，包括2007年3月22日公布的第2007/0065158号美国专利申请所述的。或者，显示支架可以包括一种蛋白酶裂解位点(与cm的蛋白酶裂解位点不同)使来自宿主细胞表面的aa或候选aa裂解。在一个实施例中，可复制生物实体，是一种细菌细胞，合适的显示支架，包括循环置换的大肠埃希氏菌外膜蛋白ompx(cpx)如赖斯等人所述，proteinscl(2006)15:825-836.seealso,u.s.patentno.7,256,038,issuedaugust14,2007。(c)构建编码aas进一步公开的内容提供了核酸结构，其包括aas和/或候选aa序列编码。合适的核酸结构包括，但不仅限于，能够在原核或真核细胞表达的构造。一般选择表达载体，这样才能与它们要使用的宿主细胞相容。例如，可以准备和使用非病毒和/或负载病毒的载体，包括质粒，用于aa-或候选aa编码dna和/或在宿主细胞中表达的复制。载体的选择将取决于需要繁殖的细胞的类型以及繁殖的目的。某些载体用于放大和构造所需的大量dna序列。其他载体适合于培养物中细胞的表达。选择合适的载体是本领域专业技术人员所熟知的。很多这样的载体是市售的。产生载体的方法可以通过本领域的公知技术实现。为了在宿主细胞中的有效表达，多聚核苷酸编码aa或者候选aa可操作链接到适当的调控序列，以方便所需的表达特性。这些调控序列可以包括启动子，增强子，终止剂，操纵子，阻遏子，沉默子，诱导剂，以及3'或5'utrs。表达载体一般还提供可能需要或想要的转录和翻译起始区，这可能是可诱导或构造的，编码区在转录起始区、转录和翻译终止区的控制下是可操作连接的。这些控制区域可能来源于可获得核酸的人体，或源自外源性来源的物种。启动子既可以构造也可以规则化。在某些情况下，有条件地使用活性启动子是可行的，如可诱导启动子，例如，对温度敏感的启动子。诱导基元是与启动子协同作用，并可以结合阻遏子(如大肠杆菌中的laco/laciq阻遏子系统)或诱导剂(如酵母菌中的gall/gal4诱导系统)的dna序列基元。在这种情况下，转录实际上是关闭的，直到启动子被解阻遏或者是被诱导，在该位点转录被开启。载体，包括表达载体，也可以包括在宿主体内可操作的选择性标记物，例如，包含目标载体的宿主细胞的培养。这种选择性标记基因，可以为转化的宿主细胞的选择提供一个表型特征，如二氢叶酸还原酶或真核细胞培养物新霉素抗性表达载体可以包括供插入和去除核酸序列编码aa和/或候选aa便捷的酶切位点。另外或此外，表达载体可以包括侧翼序列，可以作为碱基用于引物，有助于促进目标aa的编码序列的核酸扩增(例如，基于pcr的扩增)。上述表达系统可按照传统方式与原核生物或真核生物一起使用，这取决于表达的目的。在一些实施例，一种单细胞微生物，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酿酒酵母，昆虫细胞与杆状病毒载体或更高级有机体，如脊椎动物的细胞(如cos7细胞，hek293，cho细胞，爪蟾卵母细胞等)组合，可以用来表达宿主细胞。这些类和类型的宿主细胞中的表达系统是本领域众所周知的。构建在可复制生物实体上显示的aas/候选aas库的方法本申请所述构建aas和/或候选aas库设想方法。在一个实施例中，构建aas和/或候选aas库的方法包括：(a)根据本发明所述构建编码多个aas和/或候选aas的重组dna载体，(b)采用步骤(a)中的载体转化宿主细胞；以及(c)在适合表达和显示融合多肽的的条件下培养步骤(b)中转化的宿主细胞。(e)制备编码候选aas的核酸序列制备用于筛选方法的候选aas可以通过本领域公知的方法来实现。多肽显示，单链抗体显示，抗体显示和抗体片段显示都是本领域众所周知的方法。在一般情况下，aa中的一种基元，例如，mm，在aa库中的变化是随机选择。库中的候选aa，可完全随机或者偏向于随机，例如，一般在核苷酸/残基的频率或者是在一种基元内氨基酸(s)的位置。筛选aa的方法本发明提供了识别aa的方法，可以是酶激活的aa、对aa敏感的还原剂或者一种被酶或还原剂激活或被两者都能激活的aa。一般地，该方法包括接触多个带有能够结合到aa的ab上的靶点的候选aa，以及能裂解aa的一个cm的蛋白酶，从在接触到蛋白酶情况下结合到靶点上的多个成员中选出首批成员，在没有蛋白酶的情况下使第一批成员与靶点接触，并通过消耗在没有蛋白酶的情况下结合到靶点上的第一批成员来从第一批成员中选择第二批成员，其中所述方法用于候选aa的选择，其显示出与在没有蛋白酶存在的情况下与靶点的结合相比，在有蛋白酶存在的情况下与靶点结合的下降。在一般情况下，用于筛选带所需的切换表型的候选aa的方法，是通过正筛选步骤实现的(以鉴定接触蛋白酶的结合靶点成员)和负筛选步骤(以鉴定不接触蛋白酶的情况下不结合靶点成员)。负筛选步骤可以通过，例如，消耗在不接触蛋白酶的情况下结合的群体成员来实现。应该指出的是，本发明所述的库筛选方法，可以通过诱导负筛选开始启动在没有蛋白酶的情况下没有结合到标记靶点的候选者的选择(即在未裂解时没有结合到标记靶点)，然后诱导正筛选(即用酶处理，并选择未裂解的情况下结合到标记靶点的成员)。然而，为方便起见，筛查方法按照第一步正筛选如下文所述。正和负的筛选步骤，使用流式细胞仪对结合于可识别标记靶点上的候选aas可以很容易进行排序。一个完整的或周期的筛选程序，同时包括正选择步骤和负选择步骤。该方法可重复用于库以实现多个周期(包括完整的和局部的周期，例如，1.5个周期，2.5个周期等)。在这种方式下，表现一个aa的开关特性的多个候选aas成员可在所产生的成员中富集。在一般情况下，筛选方法通过第一次产生核酸库编码显示支架的多个候选aas进行，是依次插入显示支架以在可复制生物实体的表面上表达。本发明所用术语，多个候选aa是指带有编码复数的候选aas的多个多肽，其多个成员是至少一个aa组合物的氨基酸序列的变量，例如，多数是mm，cm或ab，通常是mm的氨基酸序列变量。例如，候选aas的ab和cm被固定，并且库中的候选aa是mm的氨基酸序列的变量。在另一个实施例中，可以构建一个库，包括候选aa，优选带有一个被设计定位于一个半胱氨酸残基以与另一候选aa中半胱氨酸形成二硫化键的mm的候选aa(选择其他残基以提供一个带有氨基酸序列的mm，否则完全或至少部分随机)。在另一个实施例中，可以构建一个库，包括候选aa，其中的mm包含一个完全随机的氨基酸序列。这些库可以包含一个或多个根据这种规则设计的候选aas。根据本发明方法，通过筛选多个所述成员，带有提供所需切换表型的成员可以被识别。在本发明方法的一个实施例中，多个候选aas的每个成员显示在可复制的生物实体表面上(例证细菌细胞)。多个成员都暴露于可裂解候选aas中的cm的蛋白酶，并与作为候选aas中ab的结合受体的靶点接触。包含在接触蛋白酶后结合靶点的abs细菌细胞显示成员，通过检测靶点结合进行识别和/或分离(例如，靶点-ab复合物检测)。含有在蛋白酶暴露后结合在靶点上(这可能会导致cm的裂解)的abs的成员，然后在没有蛋白酶的情况下与靶点接触。显示含有表现出下降或测不到的结合到未裂解的靶点上的ab的成员的细菌细胞通过检测没有结合靶点的细胞被识别和/或分离。在这种方式下，多个结合到处于裂解状态的靶点的，以及表现出降低或检测不到的未裂解状态靶点结合的候选aas的成员，被识别和/或选择。如上所述，构建候选aa库，以便筛选aa载体的一个或多个方面，例如，提供用于优化一个或更多的mm，cm，和ab的切换表型。aa的一个或多个其他基元可以是多种多样的，以方便优化。例如：改变mm，包括在没有裂解剂(例如，酶)的情况下能提供aa的不同的构象特征的半胱氨酸或其他残留物的编码和位置：改变cm以识别优化一个或多个所需的特征的底物(例如，酶裂解特异性，等等)；和/或改变ab用于优化切换靶点结合。在一般情况下，候选aa库中的基元是根据目标靶点蛋白进行选择的，其中aa是被激活，用于在裂解cm的裂解剂存在条件下增强靶点结合。例如，cm和ab被固定在库成员之间，选择cm，以使其被与目标靶点共存的裂解剂(如酶)裂解，目标靶点是ab的结合受体。在这种方式下，选择aa，从而使其在适当的生物条件下，在一个适当的生物位置被选择性激活。例如，它需要构建一个aa用作抗血管生成化合物，并表现出用于vegf结合的切换表型，候选aa的cm被选定为与vegf共存的酶和/或还原剂的底物(例如，cm可被基质金属蛋白酶裂解)。作为另外一个实施例，需要构建一个作为抗血管增生化合物，并表现出用于notch受体结合、铁血配体结合，或表皮生长因子受体结合的可切换的表型的aa，候选aa的cm被选定为与notch受体，配体铁血，或表皮生长因子受体共存的酶和/或还原剂的底物(例如，cm可由upa或纤溶酶裂解)。如上所述，ab一般是根据目标靶点选择。很多靶点是本领域公知的。目标生物靶点包括已被确定在疾病中起作用的蛋白质靶点。这些指标包括但不限于细胞表面受体以及分泌的结合蛋白(如生长因子)，可溶性酶，结构蛋白(如胶原蛋白，纤维连接蛋白)，细胞内靶点，等等。典型的非限制性的靶点列在表1中，但其他合适的靶点将很容易通过本领域的普通技术识别。此外，许多与目标靶点共存的蛋白酶是本领域公知的。因此，本领域普通技术人员将能够很容易地使用上述方法识别相应的酶和酶底物。(a)在aa筛选前细胞表面显示的选择性富集筛选方法之前，富集表达细胞表面适当的肽显示支架的细胞是可行的。选择性富集可用于从(1)不在细胞外膜表达肽或(2)在细胞外膜上表达非功能性肽的显示支架的细胞库除去细胞。非功能性肽显示器支架不正确地显示一个候选aa，例如，作为一个终止密码子或缺失突变的结果。富集细胞群可以通过培养细胞群，并诱导肽显示器支架的表达的富集。然后细胞，基于进行排序，例如，检测可检测信号或者并入支架部分或使用结合到一个显示支架或aa的共享部分的可检测一标记抗体。这些方法在2007年3月22日公布的美国专利申请第2007/0065158号有比较详细的介绍。(b)通过裂解的aa筛选靶点结合筛查之前，候选aa库可进行扩展(例如，在适当的条件下在合适的底物内培养培养物)。可选择性扩展后，或作为第一步，该库是受到第一次筛选以确定暴露于蛋白酶之后结合靶点的候选aas。因此，这一步通常被称为正筛选步骤。为了在蛋白酶裂解后识别结合靶点成员，候选aa库与显示候选aa中的可裂解cm的蛋白酶相结合以便有大量充足的时间和适宜的条件用于cm的蛋白酶底物的裂解。大量蛋白酶-cm制品通过本领域普通技术就可以很容易找到，其m，并在与目标靶点共存的酶(是ab的结合受体)。例如，目标靶点一种与靶点相关的实体瘤(如血管内皮生长因子，vegf)，合适的酶，包括，例如，基质金属蛋白酶(如mmp-2)，一种血小板反应蛋白样的图案(adamts)解整合和金属蛋白酶(s)(adams)/adam，组织蛋白酶和激肽释放酶。本发明所述的用作aa中的cm的底物的氨基酸序列是本领域公知的，并在需要的时候，可以采用本发明所述方法进行筛选，以识别适于用作cm的最优序列。典型的底物可以包括但不限于可被表3中所列的酶裂解的底物。候选aa库也暴露于靶点一个足够的时间，并在一定条件下适用于靶点结合，其条件可以根据预期结合到ab的靶点条件进行选择。在暴露于靶点或与暴露靶点结合前，候选aa库暴露于蛋白酶(例如，提供一个包括裂解aa的候选aas组)，通常是后者，以预期处于体内最佳模式的蛋白酶和靶点能够存在于在相同的环境条件下。蛋白酶和靶点暴露后，对库进行筛选，以选择具有结合靶点成员，其中包括靶点-ab复合物中的候选aas。靶点结合的候选aas的检测，可以有多种实现方式。例如，靶点可能是可检测标记，并且靶点结合候选aas第一组可以通过可检测标记检测，以产生具有结合靶点的第二组(例如，用于靶点结合候选aas的正选择)。(c)筛选在无蛋白酶裂解的情况下不结合靶点的候选aa在暴露于蛋白酶后，选择用于靶点结合的候选aa组可以扩增(例如，通过在适当的条件下在培养物中培养合适的介质)，并扩展库以进行第二次筛选，以识别在没有蛋白酶暴露的情况下表现出表现出下降或没有检测到结合到靶点成员。从第二次筛选产生的组将包括候选aa，未裂解时，不会明确结合到靶点，或可检测水平。因此，这一步往往被认为是负筛选步骤。从第一次筛选产生的组在没有蛋白酶的情况下并在一定适于靶点结合的条件下与靶点接触足够长的时间，该条件可以根据希望靶点结合到ab的条件进行选择。进行负筛选以识别与靶点结合相对下降的候选aas，包括那些表现出物可检测靶点结合的候选aa。这可以通过选择，例如，这种选择可以通过使用一个可检测标记靶点实现，并采用流式细胞仪分析靶点暴露组，以将其进一步分为不同的次级组，其细胞显示候选aa表现出不可检出靶点结合和/或表现出相对较低的检测信号。该次级组富集带有在无裂解条件下表现出下降或检测不到与靶点结合的候选aa的细胞。(d)可检出标记可交替使用的可检出标记和可检出基团是指能够检测的分子，包括但不仅限于，放射性同位素，荧光剂，化学发光剂，发色团，酶制剂，酶底物，酶的辅助因子，酶抑制剂，发色团，染料，金属离子，金属溶胶，配体(如生物素，抗生物素蛋白，链霉和素或半抗原)之类的。术语荧光剂是指一种能够在可检测范围内表现出荧光性的物质或其中的一部分。典型适用于靶点标记的可检测基团，包括亲和标记和荧光蛋白。本发明所用术语亲和标记表示可以连接到一个使用结合亲和标记的分子可检测的靶点的肽段，并提供一个可检测信号(例如，一个荧光化合物或蛋白质)。本质上，任何一种抗体或其他特定的结合剂的肽或蛋白质都可以用作一个亲和标记。适用的典型亲和标记包括但不限于单核细胞的接头蛋白结合肽，t7结合肽，一个链霉亲和素结合肽，一个多聚组氨酸道，蛋白a(mona)(nilssonetal.,emboj.4:1075(1985)；nilssonetal.,methodsenzymol.198:3(1991)),谷胱甘肽s转移酶(smithandjohnson,gene67:31(1988)),谷氨酸-谷氨酸的亲和标记(grussenmeyeretal.,proc.natl.acad.sci.usa82:7952(1985)),substancep,flagpeptide(hoppetal.,biotechnology6:1204(1988)),底物p,flag肽(hoppetal.,biotechnology6:1204(1988)),或其他抗原表位或结合域.一般，见fordetal.,proteinexpressionandpurification2:95(1991).dna分子编码亲和标记可通过供应商获得(e.g.,pharmaciabiotech,piscataway,nj.).本领域众所周知的任何荧光多肽(本发明也称为荧光标记)，适用于可检测基团或与本发明所述的肽显示支架的亲和标记一起使用。一个合适的荧光多肽将是一个可以在所需的宿主细胞，如细菌细胞或哺乳动物细胞表达，并会随时提供一个可以定性评估(正/负)和定量(比较荧光度)的检测信号。典型荧光多肽包括但不限于，黄色荧光蛋白(yfp)，青色荧光蛋白(cfp)，绿色荧光蛋白，mrfp,rfp(tdimer2)，hcred等，或任何突变体(如，荧光蛋白被修饰用于增强荧光或移位发射光谱)，类似物，或其衍生物。另一适当的荧光多肽，以及本发明所列出具体的实施例，可用于在本领域，并是众所周知的。生物素基标记可用于本发明方法。目标分子与底物的生物素是众所周知的，例如，大量的生物素化剂是已知的，包括胺反应和巯基反应剂，蛋白质，核酸，碳水化合物，羧酸的生物素；见，例如，分子探针目录，第4章，格兰，第6版，1996年，现纳入参考。生物素标记的底物，可以通过结合一个可检测标记生物素结合受体进行检测，诸如抗生物素蛋白或链霉亲和素。同样，大量的haptenylation试剂也是众所周知的。(e)筛选方法任何用于目标aas的分离和回收的适当的方法都可利用。例如，一个显示目标aa的细胞可以通过流式细胞仪(facs)，免疫层析法分离，或其可检测标记是磁性的，则可以通过磁分离进行分离。作为一个分离的结果，所富集的细胞群表现出预期的特征，例如，在裂解后或在没有裂解情况下已减少或无法检测到靶点结合时表现出的靶点结合。例如，已经结合可检测靶点的候选aa的选择可以通过使用各种本领域公知技术实现。例如，流式细胞仪(例如，)方法可以用来将来自未标记的候选aas的可检测标记的候选aas进行排序。流式细胞仪方法可以操作用于在分离候选(aas)群时的或多或少严格要求，通过修改开口，以便用于调光器或需要明亮的细胞群，以进一步筛选分离第二组。在另一个实施例中，免疫亲和色谱，可用于从未结合靶点分离靶点结合候选aas。例如，一种已结合了反-靶点抗体的支撑物(例如，柱子，磁珠)可与暴露于蛋白酶和靶点的候选aas接触。候选aa已经结合到反-靶点抗体，从而有利于从候选人缺乏约束目标的氨基酸的分离。筛选步骤用于富集具有相对下降的靶点结合或没有检测到的靶点结合的未裂解候选aa富集群(例如，相对于其他候选aa)，目标亚群是那些缺乏或具有相对下降的结合靶点的可检测信号。例如，将免疫亲和技术用于结合靶点的负选择，目标亚群未结合通过反-靶点支持物的。(f)双重靶向结合aa的筛选本发明所公开的筛选方法，可随时调整，以识别具有两个ab双重靶点结合aa。在一般情况下，该方法包括包含多个候选aa的库，其中所述多个中每个成员，多个包括第一ab，第二ab，第一个cm和/或第二个cm，第一个mm，和/或第二个mm。该库与能够结合至少第一ab和能够裂解第一cm的裂解剂(例如，用于cm的蛋白酶)的靶点接触。对这样选定的群体进行负筛选，在没有裂解剂存在条件下，结合到所属靶点的亚群成员可以进行核定。然后通过消耗在没有裂解剂的情况下结合到所述靶点的亚群成员产生第二群体成员选定的成员。这可以通过，例如，对于远离结合到靶点的未结合靶点成员进行分类，这可通过可检测标记靶点进行检测。因此，这种方法用于候选aa的选择，其与有裂解剂存在时对所述靶点的结合相比，在没有裂解剂存在的情况下表现出下降与靶点结合减弱。这种方法可以重复这两个靶点。筛选方法的典型变化以选择候选aa上述方法可能会被修改以选择表现出所需特性的群和库的成员。(a)mm掩蔽效率的确定mms的掩蔽效率至少由两个参数确定：mm对抗体或其片段的亲和力，以及mm相对于ab与其靶点结合界面的空间关系。关于亲和力，通过举例的方式，mm可能有很高的亲和力，但只可以在一定程度上抑制对ab的结合位点，而另一个mm，可能具有对ab较低的亲和力，但完全抑制靶点结合。短时间内，较低亲和力的mm可能会表现出足够的掩蔽；相反，随着时间的推移，同样的mm可能会被靶点取代(由于对ab没有足够的亲和力)。两个具有相同的亲和力的mms以类似的方式，基于它们增强抑制ab上结合位点以及防止ab与靶点结合的强度，可能会他们出现不同程度的掩蔽。在另一个实施例中，具有高亲和力的mm可结合和改变结构的ab，以使结合到其靶点被完全抑制，而另一种具有高亲和力的mm可能只是部分抑制结合。因此，发现一种有效的mm不能只依赖亲和力，但可以包括一个掩蔽效率的实证措施。位于aa的mm的时间依赖性靶点置换可以被测量，以优化和选择mm。为此，本发明提供了一种新的靶点置换试验(tda)。可用于发现和验证有效掩蔽的aa的tda法包括的掩蔽效率的实证检测，将靶点存在条件下掩蔽ab与靶点的结合能力，与靶点存在条件下未掩蔽的和/或亲代ab与靶点结合的能力进行比较。结合效率可表示为平衡结合的a％，未掩蔽的和/或亲代ab结合比较。当ab用mm修饰后，并在靶点存在下，与ab特异性结合未用mm或亲代ab修饰的靶点相比，ab特异性结合到其靶点会减少或被抑制。当与ab结合未用mm或亲代ab修饰的靶点相比，用mm修饰后ab结合靶点的能力，可以减少至少50％，60％，70％，80％，90％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，甚至达到100％，至少2，4，6，8，12，28，24，30，36，48，60，72，84，96小时，或5，10，15，30，45，60，90，120，150，180天，或1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12个月或更大，在体内或在体外免疫吸附法检测的靶点置换，如本发明所述。(b)识别和/或优化aa基元的迭代筛选本发明所述的方法和候选aa库可以很容易地适用于识别和/或优化aa的一个或多个基元。例如，随任何一个或更多个ab变化的候选aas，cm，连接器，等等，可以产生，并使用本发明所述的筛选方法。(c)还原剂激活的aa虽然述方法描述了用于识别aa的筛查方法，但是应该了解，aa或候选aa，其cm可以易于在aa中形成半胱氨酸-半胱氨酸二硫键，也可以采用本发明所述筛选方法。这些aa可以进一步包括或可以不包括cm(可以是相同或不同的cm)，而cm可以包括或可以不包括蛋白酶底物。在这些实施例中，上述正筛选可以通过aa或候选aa暴露于能够裂解aa中半胱氨酸的-半胱氨酸对的二硫键的还原剂(如还原条件下)进行。负筛选，然后可以在无还原条件下进行。因此，由此产生一种具有可以富集aas的库，可以通过暴露于还原条件下的二硫键激活。(d)光激活aa虽然上面描述了用于识别氨基酸的筛选方法，但是了解，具有cm的aa或候选aa是光敏性的，并且可以光解激活。在这些实施例中，上述正筛选可以将aa或候选aa暴露在光源进行。然后负筛选可以在没有光的情况下进行。由此产生一种具有可以富集aas的库，可以通过暴露光源激活。(e)筛除aa的周期和支架数通过增加上述方法周期数，表现出更好的开关特性群体和库成员可以被识别。任意数目的筛选周期可以实现。此外，个别候选aas克隆可以被隔离筛选，以确定候选aa的动态范围。候选aa也可以测试用于将所需的切换表型从支架分开，换言之，候选aa可以被表达，抑或是与显示支架分开产生，并且候选aa的切换表型在支架存在下评估，在需要的地方，在无细胞体系(例如，使用溶解aa)中。(f)aa组成与转换活性的优化上述方法可以改进，以优化aa性能，例如，以本发明所述的筛选方法确定为aa。例如，需要优化掩蔽基团性能，如，为更好地抑制靶点在未裂解状态与ab结合，ab和cm的氨基酸序列可固定在候选aa库，和mm不同，库成员变量与mm彼此互为变量。mm可以各种方式优化，包括在改变构成mm的氨基酸的数量或类型。例如，多个候选aa的每个成员可能包括候选mm，其中候选mm包括至少一个半胱氨酸的氨基酸残基，其余的氨基酸残基在多个成员之间变化。在又一实施例中，多个候选aa的每个成员可能包括候选mm，其中候选mm包括一个半胱氨酸的氨基酸残基，和氨基酸残基的一个随机序列，例如，5个氨基酸的一个随机序列。(g)扩展动态范围的选择如上所述，对于处于无掩蔽/裂解与掩蔽/无裂解状态靶点结合，具有所需的动态范围的aas也是目标。这些aas是这些，例如，在处于主体的治疗和非治疗位点生理水平的靶点存在下没有可检测结合，但是，一旦被蛋白酶裂解，就表现出结合靶点较高的亲和性和/或高亲和力。aa的动态范围越大，aa切换表型越好。因此氨基酸可以优化选择以扩展在有和无裂解剂存在下，靶点结合的动态范围。本发明所述筛选方法可以修改以提高具有所需的和/或优化的动态范围的aas的选择。在一般情况下，可以通过改变本方法的正选择和负选择步骤中靶点浓度实现，由此与未裂解aa的靶点结合筛选相比，采用较低的靶点浓度，暴露于蛋白酶的aa靶点结合筛选就可以进行(即，筛选群体包括裂解aa)。因此，靶点浓度在步骤之间变化，以便提供一个趋向于切换表型的选择压力。如有需要，用于正和负选择步骤中靶点浓度差可以随着周期次数的增加而增加。正和负选择步骤中使用较低的靶点浓度，可以用于促进在裂解状态已经改进了靶点结合的aa成员的选择。例如，涉及蛋白酶暴露aas的筛选可以在比ab-靶点相互作用的kd降低约2～100倍，降低约2～50倍，降低约2～20倍，降低约2～10倍，降低约2～5倍的靶点浓度下进行。因此，选择靶点结合aa的群体后，选定的群体将富集与群体中的其他aa相比表现出较高的亲和性和/或亲和力的aa。在负选择步骤中使用相对较高的靶点浓度，可以用于促进未裂解状态时减少或无可检测靶点结合的aa成员的选择。例如，涉及尚未暴露于蛋白酶(负选择步骤)的aa的筛选可以在比ab-靶点相互作用的kd高约2～100倍，高约2～50倍，高约2～20倍，高约2～10倍，高约2～5倍的靶点浓度下进行。因此，选择不可检测的靶点结合aa的群体后，选定的群体将富集与群体中的其他未裂解aa相比表现出在未裂解状态较低的亲和性和/或亲和力的aa。换句话说，不可检测的结合靶点的aas群选择后，选定的群体将富集其靶点结合ab受到抑制的aa，例如，将靶点结合的ab掩蔽。aa是双重靶点结合aa，上述筛查方法可适于提供具有能够结合ab的第一个靶点，以及能够结合ab的第二个靶点所需动态范围的aa。结合到定位于从出现在显示支架上的aa裂解的部分aa的ab的靶点，可以检测溶液(例如，在底物中)中靶点-ab复合物的形成进行评价，例如，免疫层析色谱捕反aa片段抗体的裂解片段，然后检测柱中捕获的结合的，不可检测标记的靶点。(h)可溶性aa的测试候选aa，可以在溶解状态测试其保持一个可切换表型的能力。其中一种方法涉及到固定靶点用以支持(例如，数组，例如，biacoretmcm5传感芯片表面)。目标靶点的固定可以使用任何合适的技术(例如，标准胺耦合)进行。支架表面可以封闭，以减少非特异性结合。可选择性地，该方法可以包括空白样的使用(例如，支架不包含固定的靶点(例如，评价结合支架的背景)和/或含有一种用作阴性对照的化合物(例如，评价候选aa特异性结合到靶点与非靶点)。靶点通过共价键固定后，候选aa在适合允许特异性结合到固定靶点的条件下与支架相连。候选aa可在合适的裂解剂存在与否条件下与支架固定靶点相连，以评估切换表型。与无裂解剂存在相比，或者是，与阴性对照相比，在有裂解剂存在条件下，评价结合候选aa提供了一个结合的反应，这反过来又指示了切换表型。(i)用于候选aa的个别基团的筛选可能需要对一个或多个候选aa的基团分别进行筛选，例如，在测试切换表型的候选aa前的ab、mm或cm。例如，可以利用鉴定由特定的蛋白酶裂解肽底物的已知的方法，以确定cms用于这种蛋白酶激活设计中的aa。此外，多种方法可用于确定结合到目标靶点的多肽序列。举例来说，本发明所采用的这些方法可用于识别abs结合到一个特定的靶点或确定结合到一个特定的ab的一个mm。上述方法包括，例如，方法中候选aa的一个基团，例如，一个ab，mm或cm的基团，使用复制的生物实体显示。(j)自动筛选方法本发明所述实施例中的某些筛查方法，均为可用于切换活动所需aa库的自动化，提供方便，实时性，高容量的筛选方法。自动化的方法，可以设计提供正和负选择迭代进行，选定的群体被分开，并自动到下一个所需周期数筛选。评估群体中的候选aas的可以随着时间的推移反复进行，正选择步骤完成后，跟着负选择步骤，或是两者同时。此外，对于处于正和负选择步骤中选定的靶点浓度的候选aa群的平均动态范围的信息，可以进行监控和存储以供日后分析，如用以评价不同的靶点浓度的选择性压力的效果。在一些实施例中，一个可执行文件平台，如计算机软件产品可以控制的检测和/或测量手段的操作，可以执行与上述步骤相关的数值运算，并生成所需的输出(例如，流式细胞仪分析等。)。计算机程序产品包括具有计算机可读的程序代码的计算机可读存储介质，是指在介质中实现。适用于自动化设备的硬件对本领域技术人员而言将是显而易见的，并可以包括计算机控制器，自动化样品处理，荧光测量工具，打印机和光学显示。测量工具可以包含一个或多个用于测量来自其具有荧光可检测分子的样品的荧光信号的光探测器。测量工具还可以包含一个计算机控制的步进电机，使每个对照和/或测试样品可以被排成样品阵列，并在测量荧光强度的步骤中自动重复定位在对面的光电探测器。测量工具(例如，流式细胞仪)，可以可操作的加上一般用途或特定应用的计算机控制器。该控制器可以包括产生计算机程序，以控制测量工具的操作和执行有关上述步骤的数值运算。该控制器可以接受通过一个文件、磁盘输入或数据总线设置和其他相关数据。显示和打印机也可以直观地显示控制器所执行的操作。本领域技术人员应该了解，通过控制器所执行的功能作为一种通用的计算机系统上运行的软件模块，可全部或部分实现。此外，可采用一个执行上述功能和操作的具有专用集成电路的专门的独立系统。在治疗中使用aa的方法aa可以被纳入药品组合物成分，例如，治疗有效量的目标aa，而载体是药学上可接受的赋形剂(也称为药学上可接受的载体)。药学上可接受的赋形剂是本领域众所周知的，一般都根据给药途径进行选择，治疗条件，以及其他一些变量都是本领域公知的。药学上可接受的赋形剂在各种出版物都得到了充分的描述，其中包括，例如，a.gennaro(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy,20thedition,lippincott,williams,&wilkins；pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(1999)h.c.anseletal.,eds.,7thed.,lippincott,williams,&wilkins；andhandbookofpharmaceuticalexcipients(2000)a.h.kibbeetal.,eds.,3rded.amer.pharmaceuticalassoc。药物组合物，还可以包括其他成分如ph值调节和缓冲剂，强壮调节剂，稳定剂，润湿剂等等。在一些实施例中，纳米粒子或脂质体装载药物组成，包括aa。aa的药物组合物的恰当的氨基酸成分，可以通过已用于aa的ab的药物组合引导。例如，其中，aa包括egfr,tnfα,cdlia,csfr,ctla-4,epcam,vegf,cd40,cd20,notch1,notch2,notch3,notch4,jagged1,jagged2,cd52,mucl,igflr,铁传递蛋白,gpl30,vcam-1,cd44,dll4,oril4的抗体，例如，如aas，可根据适用于抗体的药物复配方法和组成形成药剂配方。一般情况下，通过将均有所需纯度的aa可选择性的与处于冻干制剂或水溶液的形式的生理上可接受的载体、辅料或稳定剂混合以形成一个或多个aa的药剂配方用于存储(remington'spharmaceuticalsciences16thedition,osol,a.ed.(1980))。可接受的载体，辅料，或稳定剂在所服用剂量和浓度条件下对受体无毒，包括缓冲溶液，如磷酸盐，柠檬酸等有机酸，抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如氯化铵十八烷基二甲基苯甲基；六烃季铵氯化物；苯扎氯铵，benzethonium氯苯酚，丁基苯甲醇烷基苯甲酸酯类，如甲基或丙基苯甲酸酯，邻苯二酚，间苯二酚；环己醇，3-戊醇；间甲酚)；低分子量(约少于10个残基)的多肽，蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天门冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸，单糖，双糖，包括葡萄糖，甘露糖，糊精或其他碳水化合物，包括蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇糖；螯合剂如edta；成盐的抗衡离子如钠；金属配合物(例如，锌蛋白复合物)，和/或非离子型表面活性剂如tweentm,pluronicstm或聚乙二醇(peg)。用于体内给药的配方必须是无菌的。通过无菌过滤膜过滤，这是很容易实现。药剂配方，还可能包含不止一个必要的活性化合物，特别是正在接受治疗，附加的活性化合物通常是那些与aa活动互补的。这类化合物经过适当的组合，对预期的目标很有效。药剂配方，可提供多种剂型，如一个全身或局部注射制剂。这些成分可以装载于一种载体，如微胶囊，例如，如采用界面聚合通过凝聚技术制备，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊，分别用于胶体给药系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳，纳米粒子和纳米胶囊)，或用于浓乳剂。这种技术是在雷明顿的医药科学第16版中有描述，osol,a.ed.(1980)。缓释制剂也在aa含配方的范围内。典型缓释制剂可以包括含有aa的坚实的疏水性聚合物半透基质，基质可以具有的形态，膜，或微胶囊。缓释基质的实施例包括聚酯，凝胶(例如，聚(2-羟乙基丙烯酸甲酯)，或聚乙烯醇)，聚乳酸(美国专利号3773919)，l-谷氨酸共聚物和γ-乙基l-谷氨酸，不可降解的乙烯-醋酸乙烯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如luprondepottm(乳酸-乙醇酸聚合物和亮丙瑞林醋酸组成的注射微球)，以及聚d-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯-醋酸乙烯，乳酸-乙醇酸能释放分子超过100天，某些凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的aa在体内停留很长一段时间，在生理温度条件下，他们可能会变性或聚集并暴露在潮湿环境中，造成生物活性降低，及免疫原性的可能性变化。基于复杂的机理可以制定出合理稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是由于通过硫代二硫化的相互转化在分子间构成不良ss键形成，则可通过修改巯基残基，酸性溶液冻干，控制水分含量，使用适当的添加剂，以及制定特定的聚合物基质组合物进行稳定化。aa可与载体轭合以实现活性剂的靶向输送达到治疗目的。例如，aa与将药物封装其中或与其相结合的纳米粒子或脂质体轭合。以这种方式，可以实现药物特定的，靶向给药。连接多肽脂质体的方法是本领域众所周知的，这种方法可用于将aa链接到脂质体实现脂质体及其封装药物的靶向或选择性传递。例如，多肽可以以硫醚键的形式通过共价键连接到脂质体。聚乙二醇化的明胶纳米粒子和聚乙二醇化脂质体也被用作多肽附件的支架，例如，单链抗体。见，例如,immordinoetal.(2006)intjnanomedicine.september；1(3):297-315,，其所公开的将多肽，例如，抗体片段，共轭连接到脂质体的方法作为参考文献列于此。(a)治疗方法本发明所述aa可以根据适于aa的cm–ab结合，选择用于合适主体的治疗方法。aa可通过任何适当的方式给药，包括口服，注射，皮下，腹腔，肺内，以及经鼻，并且，如果需要，可局部注射(例如，在实体瘤的部位)。肠外给药途径包括肌肉注射，静脉，动脉，腹腔或皮下给药。长期治疗位点或病变位点，根据本发明所述是指，aa被设计成可切换的位点，例如，在一个位点，靶点用于其中aa的一个或两个abs和一个能够裂解aa中cm的裂解剂共存，其示意图见图2。治疗位点包括可以局部给药的通道(如注射，输液(例如，通过导管)等)或全身给药(例如，从远离治疗位点的位点远程给药)。治疗位点，包括那些相对生物性封闭的位点(例如，器官，液囊，肿瘤部位，等)。适当的剂量的aa将取决于需要治疗的疾病的类型，疾病的严重程度和病程，患者的临床病史以及对aa的反应，和主治医生的自由裁量权。aa可通过一次性或一系列的治疗适当的给药于患者。aa可与其他治疗方法，其他药剂等一起施用。根据疾病的类型和严重程度，aa对于患者的初次给药剂量大约为1微克/千克～15毫克/公斤(例如，0.1～20毫克/公斤)，例如，不管是一次性还是分多次给药，或连续滴注。一个典型的每日剂量范围可以从约1微克/公斤～100毫克/公斤或更多，取决于本发明所述的那些因素。对于超过数天或更长的时间重复给药，取决于病症，持续治疗，直到达到对疾病症状所需的抑制。然而，也可使用其他给药方案。aa配方，剂量，给药方式应很好的与治疗实践相一致。在这方面考虑的因素包括正在接受治疗特定疾病，特别是正在接受治疗的哺乳动物，个别患者的临床症状，病患的原因，aa的专递位点，给药方式，给药日程安排，以及执业医生所知道的其他因素。aa给药的治疗有效量将通过这样的考虑，以及防止，减轻或治疗疾病或病患所需的最低剂量。一般情况下，减轻或治疗的疾病或病患涉及一个或多个症状，或与疾病或病患相关的医疗问题。例如，对于癌症，药物治疗有效量可以通过一个或以下的组合实现：减少癌细胞数量；减少肿瘤的大小；抑制(即，在一定程度减少上和/或停止肿瘤细胞扩散到周边器官；抑制肿瘤转移，在一定程度上抑制肿瘤的生长和/或减轻在一定程度上的一个或多个与癌症相关的症状。在一些实施例中，本发明的组合，可用于防止在一个主体或哺乳动物的疾病或病患的发生或再次发生。aa可与一个或更多的治疗药物或治疗方法结合使用(联合治疗)(例如，以相同的配方或不同的配方)。aa可与其他治疗剂中混合给药或可以以一个单独的配方给药。治疗药物和/或治疗方法可以与aa共同进行，并根据要治疗的病症选择，包括手术，放射治疗(如手术切除癌组织)，骨髓移植，化疗治疗，上述某些组合，等等。(a)疾病组织与正常组织中aa的使用本发明中的氨基酸，当正常组织共存时，显示极少或没有激活，而ab仍然处于“掩蔽”状态，抑或是以其他方式显示极少或没有结合到靶点。然而，在病变组织中，在一个特定疾病蛋白酶存在条件下，例如，能够裂解aa的cm，ab成为“非掩蔽”，或者可以特异性结合到靶点。正常组织，是指产生很少或没有疾病特定的剂，能够专门裂解或以其他方式修改aa的cm的组织，例如，一个疾病特定的蛋白酶，一种疾病特定的酶，或一种疾病特定的还原剂。病变的组织是指一种可产生一种疾病特定的剂，专门切割或以其他方式修改aa的cm，例如，一种疾病特定的蛋白酶，一种疾病特定的酶，或一种特定疾病的还原剂。(b)aa以一种疾病不同的剂量给药于病变组织在一些实施例中，本发明所述的aa耦合到多个cm。这样一个aa可以在一种疾病的不同阶段被激活，或在病变组织不同的区间内被激活。例如，连接到mmp–9可裂解cm和组织蛋白酶d可裂解cm的一个ab可以被激活，在肿瘤早期，后期以及肿瘤恶化阶段被激活。在肿瘤早期阶段，aa未掩蔽，cm可以被mmp–9裂解。在中晚期肿瘤阶段，aa未掩蔽，cm可以被晚期肿瘤消亡中心不规则的组织蛋白酶d裂解。在另一个典型实施例中，连接到一个mm，一个mmp–9可激活的cm，和一个蛋白酶可激活的cm上的ab可以在肿瘤早期和晚期被激活。在另一个处于血管生成(早期肿瘤)活性位点的纤溶酶可以裂解病变组织中的一个纤溶酶可裂解cm和豆类天冬氨酸蛋白内切酶(legumain)，其巨噬细胞扩散可以裂解中晚期肿瘤豆类天冬氨酸蛋白内切酶的一个特定的cm。(c)aa用于抗血管增生治疗在一个典型的实施例中，aa包含结合到血管再生术受体的ab，如egfr,tnfα,cdlia,csfr,ctla-4,epcam,vegf,cd40,cd20,notch1,notch2,notch3,notch4,jagged1,jagged2,cd52,mucl,igflr,铁传递蛋白,gpl30,vcam-i,cd44,dll4,oril4，aa需要用于抑制血管生成病症的治疗，特别是病症中的vegf抑制是目标。结合到aa的vegf可以包括双重靶点结合的带有结合到vegf的ab，以及结合到第二个生长因子的ab的aa，如成纤维细胞生长因子(例如，fgf-2)，抑制fgf活性。这种结合到aa的双重靶点，因此可以被设计用于抑制被共同存在于异常血管生成位点的裂解剂(如酶，诸如mmp或其他酶，如表3中所示的一个)激活两个血管生成促进因素。抑制血管生成的aa用于治疗主体(如人类)的实体肿瘤，特别是那些有一个相关的血管床供给肿瘤的，抑制血管生成可以用于抑制肿瘤的生长。以抗vegf为基础的抗血管生成氨基酸，用于其他有一个或多个异常血管生成的病症，通过抑制异常血管生成进行治疗。一般情况下，当新的血管生长过度，不足或不恰当的，出现疾病状态或，它会导致疾病状态(例如，从医疗的角度来看不受欢迎的血管生成的位置，时间或发病)发生异常血管生成。过量，不当或失控的血管生成发生时，有新的血管生长，会促使疾病状态恶化或导致疾病状态，例如癌症，特别是血管化实体瘤和转移性肿瘤(包括结肠癌，肺癌(尤其是小细胞肺癌)，或前列腺癌)，造成眼部新生血管，尤其是糖尿病患者失明，视网膜病变，主要是糖尿病性视网膜病变或年龄引起的黄斑变性和虹膜疾病；牛皮癣，银屑病，如血管母细胞瘤血管瘤，关节炎；炎症性肾脏疾病，如肾小球肾炎，尤其是系膜增生性肾小球肾炎，溶血尿毒综合症，糖尿病肾病或高血压性肾硬化；各种炎症性疾病，如关节炎，尤其是类风湿关节炎，炎性肠病，牛皮癣，结节病，动脉硬化动脉移植手术，子宫内膜异位症或慢性哮喘和其他病症，将容易本领域专业人员确认。新生血管供给病变组织，破坏正常组织，并在癌症的情况下，新的血管只可以使肿瘤细胞进入循环系统和驻留于其他器官(肿瘤转移)。基于aa的抗血管生成治疗还可以用于治疗移植排异反应，肺部炎症，肾病综合征，先兆子痫，心包积液，诸如心包炎关联，胸腔积液，疾病和以不良的血管通透性为特点的病变，如，与脑肿瘤相关的水肿，与恶性肿瘤相关的腹水，梅格斯综合征，肺部炎症，肾病综合症，心包积液，胸腔积液，与心肌梗死、中风和心血管疾病等病情相关的渗透性。如本发明所述，其他血管生成依赖性疾病，可以使用抗血管生成的aa治疗，包括纤维血管瘤(异常的血液血管，很容易出血)，新生血管性青光眼(在眼部血管的生长)，动静脉畸形(动脉和静脉之间的异常通信)，不愈合骨折(骨折不愈合)，动脉粥样硬化斑块(血管硬化)，化脓性肉芽肿(常见的皮肤病灶的血管组成)，硬皮病(一种结缔组织病)，血管瘤(肿瘤组成血管)，沙眼(失明的主要原因，在第三世界)，血友病关节，血管粘连和增生性瘢痕(瘢痕形成异常)。aa的治疗有效给药剂量根据上面讨论的多个因素而变化。在一般情况下，在癌症治疗的背景下，治疗有效量的aa，是血管生成的有效抑制剂量，从而有利于减少，例如，当与一个合适的对照样相比，主体的肿瘤负荷，动脉粥样硬化降低，至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约85％，或至少约90％，直到彻底根除肿瘤。在动物实验系统，一个合适的对照样，可能是基因相同的动物，不用药剂治疗。在非实验系统中，一个合适对照样，可以是会在药剂给药之前的肿瘤负荷。其他适当的对照样，可以是安慰剂对照。肿块负荷是否已经下降可以使用任何已知的方法检测，包括但不限于测量固体肿块体；使用细胞检测法对肿瘤细胞的数量计数；采用荧光激活细胞分选(例如，使用一个特定的抗体，可确定肿瘤的相关抗原)，以确定一个给定的肿瘤抗原的细胞数量；采用计算机断层扫描，磁共振成像，和/或肿瘤x射线成像技术来估算和/或监测肿瘤的大小，测量生物样品中肿瘤相关抗原的数量，如血液或血清；等等。在一些实施例中，与合适的对照样相比，该方法可有效的减少肿瘤的增长率至少约5％，至少约10％，至少约20％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约85％，或至少在90％左右，直到完全抑制肿瘤的生长，比较合适的控制。因此，在这些实施例，有效金额为aa金额足以至少约5％，以减少肿瘤的生长速度，至少有10％左右，至少约20％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，至少约85％，或至少在90％左右，总抑制肿瘤的生长。在实验动物系统中，一个合适的对照样，可以是一个未用药剂治疗的基因相同的动物的肿瘤的生长速度。在非实验系统中，一个合适的对照样，可以是药剂给药之前的肿瘤负荷或肿瘤的生长率。其他适当的对照样可以是安慰剂对照。肿瘤生长是否被抑制可以用任何已知的方法检测，包括但不限于在体内肿瘤的生长实验，在体外增殖实验；h-胸苷摄取检测；等。(e)消炎治疗中使用氨基酸在另一个典型的实施例中，aa包含一个结合到炎症中介物的ab，如白细胞介素，aa用于治疗有关病症。白细胞介素结合的aa可以包括结合ab的双重靶点，结合到例如，白细胞介素12的ab，以及结合到il23的ab，或第一个ab结合白细胞介素17和第二个ab的结合到il23的aa。这种双重靶点结合的aa，因此可以被设计为缓解炎症，起到一个共存于炎症位点的裂解剂的作用(如酶，诸如mmp或其他酶，如表3所示)。采用aa的非治疗方法aas也可用于诊断和/或成像方法。例如，具有酶裂解cm的aas，可以用来检测一种能够裂解cm酶的存在与否。这种氨基酸可用于诊断，其可以包括在体内酶的活性检测(例如，定性或定量)(或在一些实施例中，扩增可能性减少的环境，如可以用于减少二硫键)，以及同时存在的目标靶点的活性，通过测量在一个给定的宿主生物体的特定组织中激活的氨基酸积累。例如，在cm可以选择成为一种蛋白酶底物，在肿瘤部位发现的一种蛋白酶，在生物局限性位点一种病毒或细菌感染的位点(例如，如脓肿，器官，等)，等等。ab可以结合到靶点抗原。使用本领域众所周知的技术方法，可检测的标记(例如，一个荧光标记)可以与aa中的ab或其他地区偶合。下面提供了上述筛选方法和其他的具体实施例中所讨论的合适的可检测标记。使用疾病状态下蛋白质或肽特定的ab，与在目标疾病组织中的活性升高的蛋白酶一同，与不存在可检测水平的或以比病变组织低的水平存在的cm特异性酶相比，aa将表现出与疾病组织结合率增加。由于小分子蛋白质和多肽迅速由肾脏过滤系统从血液中清除，并因为cm特异性酶是以不可检测水平存在(或者说是在非病变组织以较低水平存在)，在病变组织中激活aa的积累大于非病变组织。在另一个实施例中，aas可用于检测样品中是否存在裂解剂。例如，其中aa包含容易被酶裂解的cm，aa可用于检测(定性或定量)样品中酶的存在。在另一个实施例中，aa包含易被还原剂裂解的cm，aa可用于检测(定性或定量)样品中是否存在还原条件。为了方便在这些方法中的分析，aa可以是可检测的标记，并可以结合到一个载体(例如，固体载体，诸如薄片或小珠)。可检测标记可定位于aa裂解后分解的部分。该实验法可以通过与，例如，固定化的，其样品被怀疑含有一种有足够的时间发生裂解的酶和/或还原剂的可检测标记的aa接触，然后清洗，以除去多余的的样品和污染物进行。样品中裂解剂(如酶或还原剂)的存在与否，是在与样品接触前通过aa检测信号的变化进行检测(例如，可检测信号因aa被样品中的裂解剂裂解降低，清除附加了检测标记的aa片段的是裂解的结果)。这种检测方法也适用于检测能够结合aa的ab的靶点是存在还是不存在。因此，在体外试验中可用于评价裂解剂存在还是不存在，以及目标靶点存在还是不存在。如上所述，裂解剂存在还是不存在可通过aa中可检测标记的减少检测，而靶点的存在还是不存在可通过靶点-ab复合物检测，如通过使用可检测的标记的反-靶点抗体检测。如上所述，本发明所公开的aa可以包括可检测的标记。在一个实施例中，aa包括一种可作为诊断剂使用的可检测的标记。可作为诊断剂使用的可检测的标记非限制的实施例包括含有放射性同位素，如铟或锝的显像剂；mri和其他应用的含碘、钆或氧化铁的对比剂；酶，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶酶，或β-半乳糖苷酶；诸如如gfp，铕衍生物的荧光物质，荧光团；如n-甲基丙烯酸盐(或酯)衍生等的发光的物质。易损斑块的破裂和随后血块的形成，被认为可导致绝大多数心脏病的发作。易损斑块的有效靶向性可以提供稳定的治疗，以减少破裂的可能性。vcam-1无论是在易发生动脉粥样硬化区段，还是在病变边缘区都有所增加。iiyama,etal.(1999)circulationresearch,amheartassoc.85:199-207。胶原酶，如mmp-immp-8和mmp-13在人类动脉粥样硬化过度表达可能会导致动脉粥样硬化斑块的破裂。fricker,j.(2002)drugdiscovtoday7(2):86-88。在一个实施例中，本发明公开的用于诊断和/或成像方法的aas被设计用于检测和/或标记动脉粥样硬化斑块，如，脆弱的动脉粥样硬化斑块的。通过与动脉粥样硬化斑块相关的靶向蛋白，aas可用于检测和/或标记这种斑块。例如，本发明方法所使用含有反-vcam-1ab和可检测标记的aa，被设计用来检测和/或标记动脉粥样硬化斑块。这些aa可以在动物模型中进行测试，如apoe基因小鼠。生物分布的注意事项本发明所述组合物的治疗潜力使修改后的ab或aa有更大的生物分布与生物利用度。本发明所述的组合物提供的抗体治疗，提高了生物利用度，其中正常组织中将抗体治疗结合到靶点的亲和力低于病变组织。病变组织中包括耦合到mm的ab的药物组合物，可以显示出对靶点的亲和力大于正常组织的。在优选实施例中，病变组织的亲和力比正常组织的亲和力大5-10,000,000倍。一般说，本发明提供了一种提高生物利用度的抗体治疗，其中第一个组织中将抗体治疗结合到靶点亲和力小于第二组织中抗体治疗结合到靶点的亲和力。对于不同的实施例的例子，第一组织是一个正常组织，而第二个组织是病变组织；或者，第一个组织处于是早期肿瘤阶段，而第二个组织处于晚期肿瘤阶段；或者，第一组织是一种良性肿瘤，而第二个组织是一种恶性肿瘤组织；或者第一组织和第二个组织是在空间上分离的；或在一个具体的实施例中，第一个组织是上皮组织，而第二个组织是乳腺，头，颈，肺，胰腺，神经系统，肝脏，前列腺癌，泌尿生殖道或宫颈组织。具体实施方式实施例1：筛选候选掩蔽基团(mm)为了生产含有抗体和其片段(ab)耦合具有所需的最佳结合和裂解特性的mm，筛选了候选mm的库。生成了具有不同可变氨基酸序列、不同半胱氨酸位置、不同长度等的mm。对候选mm与目标ab的结合亲和力进行了试验。最好，mms不包含本机的氨基酸序列具有约束力的合作伙伴的ab选择修改后的抗体的建设。最好为修饰抗体的构造选择ab结合配体不含原生氨基酸序列的mm。进行了用于目标ab的mm亲和力成熟选择具有约1-10nm的亲和力的mm。实施例2：修饰抗体和可激活抗体(aa)库的筛选为了确定修饰抗体和具有需要的可转换特性的aas(即，相对于在掩蔽和/或裂解结构状态时在掩蔽和/或未裂解结构状态靶点连接的降低)，生成了候选修饰抗体和在掩蔽基团(mms)中具有不同可变氨基酸序列的候选aa库、mm中的半胱氨酸的可变位置、各种链接体长度以及亲代ab的各种连接点。本发明提供了一个筛选/排序的方法的原理图，以确定显示可转换表型的候选aa。通过表达向量显示在细菌细胞表面的aa引入的了库。通过培养扩大库后，然后用适当的由于裂解或还原cm的酶或还原剂处理显示aa多肽的细胞。然后将进过处理的细胞与荧光标记的靶点接触，并用流式细胞仪进行排序以分离显示与裂解/还原的靶点结合的aa的细胞。对显示靶点结合结构的细胞通过培养扩增。然后将细胞与标记靶点接触并通过facs排序以流式细胞仪分离显示在酶/还原剂不存在时不能与靶点结合的aa的细胞。这些步骤代表一个周期甄别程序。细胞可以接受额外的周期通过培养扩增，并再次全部或部分接受筛选步骤的培养。库筛选和排序也可以通过不用酶/还原剂处理时，候选物不与标记靶点结合的第一轮筛选启动(即，当不裂解/还原时不与靶点结合)。实施例3：以修饰抗体的体外的筛选确定mm掩蔽效率为了筛选修饰抗体和掩蔽后表现出最佳特性的aas，例如，生成了当在掩蔽状态和一中靶点存在时，只有10％与靶点结合，abs与不同的mms或abs与相同的mms在不同连接点耦合，或abs通过不同长度和/或序列链接体与相同的mm结合。mm掩蔽效率可以通过mm对ab的亲和力和mm相对于靶点与ab结合界面的相对空间关系确定。高效mm的反应是基于亲和力和可选择地使用一种掩蔽效率的尽管测量方法。在修饰抗体或aa中，可以测量时间依赖性的mm的靶点替换以便优化和选择mm。为了有效掩蔽抗体的发现和验证，本发明描述了一种免疫吸附靶点替换分析(tda)方法。在tda分析中，在与质量相关的浓度和时间下，测量了mm抑制ab与靶点结合的能力。该分析允许的mm随时间变化的靶点替换测量。简言之，在约4℃将抗体靶点在elisa板的孔内吸附过夜。该板块用约150μl2％的在pbs中脱脂奶粉(nfdm)、约0.5％(v/v)tween20(pbst)覆盖，并在室温下孵育1小时左右。然后用pbst将该板洗涤大约3次。加入约50μl超级块(thermoscientific)并补充蛋白酶抑制剂(complete,roche)。将约50μl耦合了mm的ab溶解在含有蛋白酶放抑制剂的超级块中(complete,roche)并在37℃孵育不同的时间。用pbst将该板洗涤约3次。将约100ml抗hulgg–hrp加入约2％nfdm/pbst中并在室温孵育1小时左右。用pbst将该板洗涤约4次及用pbs洗涤约2次。使用作为每个制造商的指导的tmb(thermoscientific的)开发了该分析方法。实施例4：包含一种scfv作为ab的aas本发明描述了包含一种抗-jagged1scfv的aa的实施例。由于连接了mm，这些aas在正常情况下没有活性(掩蔽)。然而，当scfv达到疾病位点时，一种针对特定疾病的酶如adam17将裂解一个连接肽抑制剂到允许其与jaggedl结合的scfv的底物链接体。jaggedl用于发现对与抗jaggedlscfv的适宜的mm。在这个实施例中，选定的mm与用作激发剂酶底物结合。该底物被蛋白酶激活后形成竞争靶向结合的scfv结构体。蛋白酶激活抗体的构建基因编码的包含一种以单链形式存在的jagged1抗体的aas通过重叠延伸的pcr或全部基因合成并结合入一种类似的消化表达质粒或任何其他适宜的细菌、酵母菌、或本领域技术人员熟知的哺乳动物表达载体而生成。另外，全尺寸抗体可应使用商售的纳入半衰期养成基团的表达载体生成，而生成方法为本领域技术人员富所熟知。然后表达质粒转化或转染到一个合适的表达宿主，如对大肠杆菌的bl21或hek293t细胞。用一种质部分提取试剂盒(pierce)从过夜培养物中收获单链抗体并用固定化金属离子亲和层析柱和体积排阻色谱纯化。抗体开关活性体外监测蛋白酶激活抗体的等分，在1pm-1μm的浓度下在缓冲水溶液中，分别与0和50nm的酶培养3小时。然后用elisa或或表面等离子体共振固定抗原jagged1对反应混合物进行结合分析，当使用biacoretmspr分析仪通过增加共振单位显示经过蛋白酶处理后对aa的结合活性增加了。然后作为裂解结果的表观解离常数(kd)的变化可以根据仪器制造商的说明进行计算(biacore，gehealthcare)。实施例5：抗-vegfscfvab的克隆aa在这个和下面的实施例中，构建了一种包含一个掩蔽的可裂解抗vegfscfv的mmp-9(靶点＝vegf；ab＝抗-vegf单链fv)的aa。生成这种aa的第一步，生成含有抗-vegfscfv的一种结构体(ab)，一种抗-vegfscfvab(vl-链接体l-vn)从已发表的兰尼单抗序列尽心设计(genentech,chen,y.,wiesmann,c,fuh,g.,li,b.,christinger,h.,mckay,p.,devos,a.m.,lowman,h.b.(1999)selectionandanalysisofanoptimized抗-vegf抗body:crystalstructureofanaffinity-maturedfabincomplexwith抗genj.moi.biol.293,865-881)andsynthesizedbycodondevices(cambridge,ma).。兰尼单抗是一种衍生于相同的父鼠源抗体贝伐单抗的单克隆抗体fab片段，(prestalg,chenh,o'connorsj,etalhumanizationofan抗-vascularendothelialgrowthfactormonoclonalantibodyforthetherapyofsolidtumorsandotherdisorders.cancerres,57:4593-9,1997)。它比亲代分子小并经过亲和力成熟以提供与vegf-a提供更强的结合。兰尼单抗结合并抑制所有血管内皮生长因子亚型a(vegf-a)。在n–末端的一个his6标记和tev蛋白酶裂解位点可包含到设计中。tev蛋白酶是从烟草蚀纹病毒中分离出一种蛋白酶，是非常具体的，并用来分离融合蛋白质并进行净化。在下文的表7和表8提供了抗-vegfscfv核苷酸和氨基酸序列。表7：抗-vegfscfvab核苷酸序列表8：抗-vegfscfvab氨基酸序列实施例6：对抗-vegfscfv筛选和确定mms兰尼单抗用于筛选汇集的随机肽库，包括的肽是x15(8.3xl09)、x4cx7cx4(3.6xl09)、或x12cx3(l.lxl09)，其中x为任何氨基酸，数字代表库总的多样性。汇集库的总多样性是1.3x1010。筛选包括一轮macs和两轮流式细胞仪排序。在第一轮macs筛选中，用150nm生物素化的兰尼单抗探测了1×1011个细胞，有5.5xl07结合细胞被分离。第一轮facs筛选中，在macs中筛选中分离的阳性细胞用500nm生物素化的兰尼单抗探测，并用neutravidin-pe(分子探针，eugene,or)进行可视化。第二轮和第三轮的facs筛选在20umigg抗体存在下，用500nm和100nmalexa标记的兰尼单抗。利用facs分析，对单个克隆体进行测序，随后验证其与抗-vegfscfv的结合能力。针对抗-vegfscfv的mm氨基酸序列在表9中提供。(这些序列将以下简称为283mm、292mm、306mm等等)。表9：抗-vegfscfv的mm一个cm(mmp-9的底物)被融合到掩蔽的抗vegfscfv从而一个构建提供裂解、掩蔽的aa。图4中提供了一个典型的构造。下面详细描述了几个典型的aa结构体和含有不同cms的序列。用于构件典型结构的引物列于下文表10。表10：用于构建mmp-9可裂解、掩蔽-抗-vegf的引物cx02335’gaattcatgggccatcaccatcaccatcacggtgggg3’cx02495’gtgagtaagcttttattacgacactgtaaccagagtaccctgg3’cx02705’gtggcatgtgcacttggccaccttggcccactcgagctggccagactggccctgaaaatacagattttccc3’cx02715’gagtgggccaaggtggccaagtgcacatgccactgggcttcctgggtccgggcggttctgatattcaactgacccagagcc3’cx02885’ttcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaacaac3’cx02895’gctttcaccgcaggtacttccgtagctggccagtctggcc3’cx02905’cgctccatgggccaccttggccgctgccaccagaaccgcc3’cx03085’gcccagccggccatggccggccagtctggccagctcgagt3’cx03105’ccagtgccaagcttttagtggtgatggtgatgatgcgacactgtaaccagagtaccctggcc3’cx03125’cttgtcacgaattcgggccagtctggccagctcgagt3’cxo3145’cagatctaaccatggcgccgctaccgcccgacactgtaaccagagtaccctg3’aa的克隆和表达：一个可裂解mmp-9，掩蔽的抗vegfscfv作为mbp的融合体克隆：克隆了一种mbp：抗-vegfscfvab融合体。mbp(麦芽糖结合蛋白)在大肠杆菌中表达，作为融合蛋白，并在麦芽糖柱中净化，这是本领域技术人员所熟知的制备合蛋白的方法。在这个实施例中，mbp用于分离掩蔽的scfv。his6标记的抗-标记的vegfscfvab被克隆到pmal-c4x载体(neb)作为一个c-末端与mbp融合。在多个克隆位点(mcs)使用ecori和hindiii对位点进行限制。引物cx0233和cx0249(表10)，用于扩增抗-vegfscfvab并分别引入ecori和hindiii酶切位点。对aa(肽mm、抗-vegfscfvab和mmp-9cm)接受载体进行了合成，使用聚合酶链反应(pcr)技术，对为了获得肽mm、链接体序列以及在tev蛋白位点和抗-vegfscfvab之间的mmp-9cm蛋白位点而置于克隆位点的引物cx0271和cx0270重叠。引物cx0271和cx0249(表10)用于扩增结构体中的c-末端部分，而引物cx0270和cx0288(表10)用于扩增结构体中的n-末端部分，使用外引物cx0249和cx0288(表10)，并克隆进入pmal载体作为mpb的融合体并使用sad和hindiii酶切位点，对上述两个反应的产物进行结合从而获得最后总的pcr反应。表11：mbp/mm接受位点/mmp-9cm/抗-vegfscfvab载体核苷酸序列使用引物cx0289和cx0290(表10)的载体，使用的sfil酶切位点，306mm和314mm(表9)从ecpx显示载体扩增并特异性克隆到n末端掩蔽的载体。下文的表12提供了相应的核苷酸和氨基酸序列。表12:306或314mm/mmp-9cm/抗-vegfscfvab序列表达：mbp的表达：在大肠杆k12tbl菌株中完成aa的融合，使用一种含有需要的结构的耐氨苄青霉素的菌落接种5毫升过夜的含有lb底物辅以50μg/ml氨苄青霉素的培养物。使用全部的过夜培养培养物接种500ml新鲜lb底物辅以50μg/ml氨苄青霉素和0.2％葡萄糖并允许在37℃培养，以250rpm摇晃直到0.5o.d.。然后加入异丙基-β-d-半乳糖苷酶，最终浓度达到0.3mm，并允许培养物在相同的条件下进一步培养3小时，之后用离心机在3000xg收获细胞。使用标准方法纯化包涵体。简言之，10mlbperii细胞裂解试剂(皮尔斯)。用离心机在14000xg收集不溶物，并丢弃水溶性蛋白。将不溶物在5mlbperii辅以lmg/ml溶菌酶重悬浮，并在冰浴中孵育10分钟，之后将用水按1：20稀释的5mlbperii加入，在14000xg下旋转试样。除去上清液，用1：20的bperii清洗微粒两次。经该纯化的包涵体溶解在pbs8murea,10mmbme,ph7.4。将mbp融合蛋白稀释到约1毫克/毫升的浓度，并在ph7.4的pbs中，从8到0m尿素经过6，4，2，0.5，0m尿素进行复性逐步透析。在4、2和0.5m尿素溶液步骤，加入0.2m精氨酸，2mm还原型谷胱甘肽和0.5mm氧化型谷胱甘肽。0m尿素透析包括0.2m精氨酸，去除的尿素后，蛋白质透析用0.05m精氨酸和ph7.4的pbs深度透析，所有透析在4℃进行并过夜。为出去聚集物，每个蛋白质在sephacryls-200柱中接受体积排阻色谱纯化。对包含正确折叠的蛋白质的组分用amicon超离心式过滤器浓缩。aa:ammp-9可裂解,掩蔽抗-vegfscfvchistag的克隆和表达克隆：引物cx0308和cx0310(表10)是用于扩增，分别向载体(mm接受位点/mmp-9cm/ab)的5'端添加一个ncol酶切位点和载体的3'端添加一个hindiii酶切位点和his6标签，之后克隆到一个包含pelb信号肽的载体。抗-vegfscfvmms如前面所述进行克隆。表13提供了相应的核苷酸和氨基酸序列。表13:306or314mm/mmp-9cm/抗-vegfscfvchisab序列表达：在大肠杆k12tbl菌株中完成aa的融合，使用一种含有需要的结构的耐氨苄青霉素的菌落接种5毫升过夜的含有lb底物辅以50μg/ml氨苄青霉素的培养物。2.5毫升过夜培养物用于接种250毫升新鲜lb底物辅以50μg/ml氨苄青霉素和0.2％的葡萄糖，并允许在37℃下培养，以250rpm摇晃至达到1.0o.d.。然后加入异丙基-β-d-半乳糖苷酶，最终浓度达到0.3mm，并允许培养物在30℃进一步培养5小时，之后用离心机在3000xg收获细胞。用溶菌酶/渗透压冲击法立即纯化周质组分。简言之细胞沉淀在3ml的50mmtris,200mmnacl,10mmedta,20％的蔗糖,ph7.4溶液中充悬，加入2ul/ml备用的溶菌酶溶液。15分钟后。，加入1.5体积的水(4.5mls)并再在冰上孵育15分钟，在冰上。用14000xg离心回收可溶性胞质组分。使用ni-nta树脂对抗-vegfscfvhis蛋白部分纯化。粗周质提取物被装到0.5毫升ni-nta树脂，用50mm磷酸300毫米氯化钠洗涤至ph7.4。his标记的蛋白质用50mm磷酸盐300mm氯化钠、200mm亚胺洗脱，ph值6.0。使用amicon超级离心机将蛋白浓缩至约600μl并将缓冲液换成pbs。aa的克隆和表达:一种mmp-9可裂解,掩蔽抗-vegfscfvas人源fc融合克隆：引物cx0312和cxo314(表10)用于扩增mmp–9cm/抗-vegfscfv的编码序列。该引物还包括为5'ecori酶切位点和3'ncol酶切位点的序列和链接体序列。用ecori和ncol切割pcr扩增序列，随后克隆进入pfuse-higgl-fc2载体从而为fc融合蛋白的表达生成载体。如前所述，将抗-vegfscfvabmms插入这些载体，构建了含有306mm,313mm,314mm,315mm,非结合的mm(100mm),以及没有mm的结构体以及验证的序列。下文的表14提供了相应的核苷酸和氨基酸序列。表14:306mm/mmp-9cm/抗-vegfscfv-fcab序列表达：使用作为制造商的协议(invitrogen,ca)的转染胺2000通过转染向306mm/mmp-9cm/抗-vegfscfv-fc,314mm/mmp-9cm/抗-vegfscfv-fc或抗-vegfscfv-fc的10μg表达载体中引入107的hek-293自由型细胞(invitrogen,ca)。细胞培养72小时。孵化后，收获经调整处理的底物并通过离心清除细胞和碎片。用elisa法检测经调整处理的底物。实施例8:掩蔽mmp-9可裂解aa的活化测量为了测定掩蔽的mmp-9裂解的抗-vegfaa由mmp–9的激活，100μl2μg/mlpbs的vegf溶液加入到微孔中(96孔，容易洗净；corning)，在4℃孵育过夜。然后，用超级块(pierce)封堵微孔3×15分钟。一百微升aa(每个构造有关的详细信息，见下文)，经过或不经过mmp-9处理，然后向微孔计入pbst、10％的超级块，并在室温(rt)孵育1小时。所有洗涤步骤使用300μlpbst进行三次。然后加入一百微升二次检测试剂，并允许在室温下孵育1小时。使用100μltmb1(pierce)溶液完成对hrp的检测。用100μl1n的盐酸终止反并在450nm处测定吸光度。包含mbp/mm/mmp-9cm/抗-vegfscfvab的aa载体的elisa分析两百微升生物素化的aa在浓度为200nm的mmp-9的消化缓冲液(50毫米tris，氯化钙2毫米，20毫米氯化钠，100μmol氯化锌，ph值6.8)中用20utev蛋白酶在4℃消化过夜以除去mbp融合配体。然后，使用或不用mmp–9将样品在37℃孵育3小时。在pbst中以1：1稀释到最终浓度为100nm，向elis孔中加入10％的超级块。使用一种以1：7500稀释的avidin-hrp轭合物完成aa的测试。mmp-9裂解的掩蔽mbp:抗-vegfscfvaa中的mmp-9的激活见图5.包含mm/mmp-9cm/抗-vegfscfvhis的aa结构体的elisa分析在mmp-9的消化缓冲液(150μl)透析粗周质提取物在使用或不用mmp–9时37℃孵育3小时。然后样品用pbst稀释至400μl，将10％的超级块键入elisa孔中。使用按1：5000稀释的抗-his6–hrp轭合物完成aa的检测。mmp-9的激活mmp-9裂解的掩蔽抗-vegfscfvhisaa见图6。包含mm/mmp-9cm7抗-vegfscfv-fc的aa结构体的elisa分析50微升的hek细胞上清液加入到200μl的mmp-9的消化缓冲液，并在37℃使用或不用mmp-9培养2小时。然后用pbst按1：1稀释样品，分别入向elisa孔加100μl10％的超级块。用按1：2500稀释的抗-人类fc–hrp轭合物完成aa的检测。mmp-9的激活mmp-9裂解掩蔽抗-vegfscfv-fc见图7。含有mm7mmp-9cm7抗-vegfscfv-fc的aa载体的纯化和检测用蛋白a柱色谱纯化抗-vegfscfvfcaas。简单地说，10mlhek细胞上清液用pbs按1：1稀释，加入0.5毫升在pbs中预平衡的蛋白a树脂。先用10倍于柱体积的pbs洗柱子，接着用170mm，300毫升氯化钠洗脱结合蛋白，ph2.5，并立即用200μl的2mtrisph值8.0中和1ml组分。然后用amicon超离心机浓缩含有蛋白质的组分。用elisa法进行分析如对hek细胞上清洗液进行的。elisa检测数据显示依赖mmp–9的vegf与抗-vegfscfvfcaa结合与mms306和314用蛋白质a柱得到纯化，见图8。实施例9：靶点替代物分析发现和验证有效掩蔽的治疗蛋白96孔微滴度板吸附vegf，洗净，用牛奶蛋白封堵。加入25ml含有抗-vegf抗体或包含mmjs306的抗-vegfaa的底物到涂孔中并孵育1，2，4，8或24小时。经过孵化后，对孔进行洗涤，用抗-hulgg免疫检测测试aa的结合程度。图9显示了掩蔽物306完全在1小时内抑可以制vegf的集合，然而，在16个小时，>50％的306抗-vegfaa与其抗原vegf结合。306掩蔽物，以>600tim的亲和力与抗-vegf抗体结合，不能有效地排除与vegf的结合。实施例10：库筛选和抗-ctla4mms的分离根据bessette(bessette,p.h.,rice,jjanddaugherty,p.s.rapidisolationofhigh-affinityproteinbindingpeptidesusingbacterialdisplay.proteineng.design&selection.17:10,731-739,2004)等人的方法，ctla4抗体屏蔽基团(mms)从一个1010随机15mer大肠杆菌表面上显示的肽组合库中分离出来，生物素标记的鼠抗-ctla4抗体(克隆uc4f10-11，25nm)用库孵育，表示推测的结合肽的抗体结合的细菌用链霉亲磁性纳米磁珠从没有结合的细菌中进行磁性排序。随后几轮使用facs流式细胞仪进行富集。最初一轮的facs操作，使用生物素化的靶点5nm)对细菌排序，第二轮标记步骤用链霉亲和素藻红蛋白。在随后的几轮facs，分类进行dylight标记抗体浓度的目标是减少(1纳米，然后为0.1nm)，以避免二级标签步骤亲和力的影响，并选择最高的亲和力粘合剂。一轮的mac和三个轮流式细胞仪导致了粘结剂的池从单个克隆进行测序。相对亲和力和个体克隆的关闭率筛选使用一个ficin消化dylight标记的fab抗体片段，以减少双价抗体的亲和力影响到细菌表面表达多种肽。作为一个额外的测试目标的特殊性，个别克隆进行了筛选，在20ume.coii耗尽igg为竞争对手的存在具有约束力。mm的优化选择的4个克隆的氨基酸和核苷酸序列表15所示。这些序列将互换简称为115mm，184mm，182mm，和175mm。候选人被选为mm一系列的关闭率，确定后裂解关闭率的影响在mm分解。mm的，没有约束力抗-ctla4被用来作为阴性对照。表15：对于掩蔽抗-ctla4的mms的氨基酸和核苷酸序列kk115mmmillcaagrtwveacangratgattttgttgtgcgcggcgggtcggacgtgggtggaggcttgcgctaatggtaggkk184mmaerlcawagrfcgsgctgagcggttgtgcgcgtgggcggggcggttctgtggcagckk182mmwadvmpgsgvlpwtstgggcggatgttatgcctgggtcgggtgtgttgccgtggacgtcgkk175mmsdgrmgslelcalwgrfcgsagtgatggtcgtatggggagtttggagctttgtgcgttgtgggggcggttctgtggcagcnegativecontrol(doesnotbindanti-ctla4)pcsewqsmvqprcyygccgtgttctgagtggcagtcgatggtgcagccgcgttgctatta实施例11：cloningof抗-ctla4scfv根据gilliland等人(gillilandl.k.,n.a.norris,h.marquardt,t.t.tsu,m.s.hayden,m.g.neubauer,d.e.yelton,r.s.mittler,andj.a.ledbetter..rapidandreliablecloningof抗bodyvariableregionsandgenerationofrecombinantsinglechain抗bodyfragments.tissue抗gens47:1,1-20,1996)的方法，从分泌uc4f10-11仓鼠抗-小鼠ctla4抗体的杂交瘤细胞系克隆了抗-ctla4scfv。这种协议的详细版本可在位于http://www.infrontof.ibms.sinica.edu.tw/～sroff/protocols/scfv.htm.的网站上找到。简言之，用rneasy全rna分离试剂盒(qiagen)从杂交瘤中分离全部rna。引物igkl(gtyttrtgngtnacytcrca)和ighl(acdatyttyttrtcnacyttngt)(gillilandetal.参考上文)分别用于第一缕可变轻链和重链的合成。一个聚g示踪剂与末端转移酶一起加入，之后加入pcr5'anctail引物(gilliland等。上面提到的)(cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatggtcccccccccccccc)含有ecori,sad和xbal位点轻链和重链(聚合g末端特异性)和3'hbs-hlgk(cgtcatgtcgacggatccaagcttacyttccayttnacrttdatrtc)和hbs-hlgh(cgtcatgtcgacggatccaagcttrcangcnggngcnarnggrtanac)源自仓鼠抗体恒定区序列和含有hindlll,bamhi和分别用于轻链和重链扩增的靶向位点(gilliland等。上面提到的).加入一个带有末端转移酶的多g尾部，接下来使用含有用于轻链和重链的ecori、sad和xbal位点的5'anctail引物(gillilandetal.参考上文)(cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatggtcccccccccccccc)进行pcr以及衍生于鼠抗体恒定区序列，并含有轻，重链分别扩增需要的hindlll，bamhi和sail的位点(gillilandetal.参考上文)的hbs-hlgh(cgtcatgtcgacggatccaagcttrcangcnggngcnarnggrtanac)。用hindlll和sad设计了结构和载体，结合并转化进入大肠杆菌。对单个克隆体测序并通过与已经存在的小鼠和仓鼠抗体进行对比验证vl和vh(分别见表16和表)的正确序列。前导序列，如在已存在序列中对抗-ctla4的描述，也通常被称为一个信号序列或分泌前导序列，也是抗体指示分泌的氨基酸序列。这个序列在分泌期间由细胞切割，不包括成熟的蛋白质。此外，这里介绍的由tuve等克隆的相同的scfv是等同的序列(tuve,s.chen,b.m.,liu,y.,cheng,t-l.,toure,p.,sow,p.s.,feng,q.,kiviat,n.,strauss,r.,ni,s.,li,z.,roffler,s.r.andlieber,a.combinationoftumorsite-locatedctl-associated抗gen-4blockadeandsystemicregulatoryt-ceildepletioninducestumordestructiveimmuneresponses.cancerres.67:12,5929-5939,2007)。表16：仓鼠抗-小鼠ctla4vl先导序列表17:仓鼠抗-小鼠ctla4vh为了确定最佳的用于表达和功能的抗-ctla4scfv的方向，设计引物用于分别pcr扩增可变轻、重链，半个(gggs)3链接体位于n-或c-末端以便接着“拼接重叠延伸的pcr(soe-pcr；horton,r.m.,hunt,h.d.,ho,s.n.,pullen,j.k.andpease,l.r.(1989)engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes:genesplicingbyoverlapextension.gene77,61-68)，vl或vl在n-末端。设计在n-末端的ndel酶切位点在核苷酸序列的起始位置产生一个在框中的起始密码子和his标记，终止密码子加入c-末端。然后通过缝制pcr，使用在vhvl和vlvh产生scfvs的外引物将轻，重链加入(图10)。引物见下文的表18。表18:产生scfvsvhvl和vlvh的引物接下来，一套用于mm克隆的重叠引物设计添加sfi和xhol的位点，接下来是mmp-9的裂解序列和在n-末端的(ggs)2链接体结构。这些引物见表19和图10所示的示意图。表19:用于ic的引物mm和cm克隆包含scfvs的链接体经pcr扩增，用ndel和ecorl(一个vh的内部酶切位点)消化剂胶体纯化。pcr产物连接到载体转化大肠杆菌，核苷酸和氨基酸序列于表20。表20：mm链接体-cm-抗ctla4scfv链接体mm的序列用pcr扩增，在sfil和xhol位点消化，结合入成链接体抗-ctla4scfv的构造，转化进入大肠杆菌并测序。mm115-cm-ab的完整的核苷酸和氨基酸氨基酸序列分别如下表21和22所示。表21:氨基酸序列ofmm115-抗-ctla4scfvab为了生成mm-cm-抗-ctla4scfv-fc融合体，设计下文列于表23的引物用于扩增通过在融合系统(clontech)克隆进入pfusefc载体的结构。质粒被转化进入大肠杆菌，并将单个克隆的序列进行了验证。表23:产生mm-cm-抗-ctla4scfv-fc融合的引物实施例13：在hek-293细胞中，掩蔽/mmp-9/抗-ctla4scfv-fc的表达和分析作为生产商的协议(invitrogen)通过使用转染胺2000转染，向10μg用于pl75ctla4pfuse、p182ctla4pfuse，p184ctla4pfuse，pi15ctla4pfuse，或pnegctla4pfuse的表达载体引入107的hek-293自由型细胞(invitrogen)。转染细胞额外培养72小时。孵化后，收获经过调整处理底物，通过离心清除细胞和碎片。如下文所述，用elisa法测定经过调整处理底物活性。50微升经过调整处理的来自hek–293表达mm175-抗-ctla4scfv、mm182-抗-ctla4scfv、mm184-抗-ctla4scfv、mml15-抗-ctla4scfv，或mmneg-抗-ctla4scfv底物添加到200μlmmp-9的消化缓冲液中并使用或不用mmp–9在37℃孵育2小时。样品用pbs、4％非脱脂牛奶(nfdm)按1：1稀释。用竞争elisa法测定结合活性。在pbs(r&d系统)中的100μl浓度为0.5mg/ml的小鼠ctla4-fc融合蛋白加入96孔易洗板(corning)，并在4℃孵育过夜，然后用在pbs中的100μl2％非脱脂奶粉将孔在室温(rt)封堵一小时，然后用pbs、0.05％吐温20(pbst)冲洗3次。50μl调整处理的转染hek-293细胞的底物，表达未经或经mmp-9处理的mm175抗-ctla4scfv、mm182-抗-ctla4scfv、mm184-抗-ctla4scfv、mm115-抗-ctla4scfv或mmneg-抗-ctla4scfv培养物加入孔中并在室温下孵育15分钟。孵育之后将50μl含有含0.5μg/ml的生物素化鼠b71-fc(r&d系统)的pbs加入每个孔中。接着在室温下进一步孵化30分钟，然后用150μlpbst洗孔5次。加入100μl含1：3000稀释的抗生物素蛋白hrp的pbs并将该孔板在室温下孵育45分钟，然后用150μlpbst洗7次。用100μltmb(pierce)进行elisa，用100μl1n盐酸终止反应，并在450nm处测定吸光度。实施例14：一种抗-ctla4的构建表24和25分别显示抗-人-ctla–4scfv的核苷酸和氨基酸序列。提供(根据合同,bycreativebiolabs,21brookhavenblvd.,portjeffersonstation,ny11776)了能够结合人类ctla3的m13噬菌体。在大肠杆菌tg–1中生成噬菌体，并用聚乙二醇纯化，用氯化钠沉淀。表24:抗-人源ctla4scfvab核苷酸序列表25:抗-人源ctla4scfvab氨基酸序列噬菌体elisa法测量ctla–4的结合：为了测量抗-ctla-4scfv-c2的结合，将在pbs中的100μl0.5μg/ml的人ctla-4-igg或小鼠ctla-4-igg(r&dsystems)添加到微孔(96孔易洗，corning)并在4℃孵育过夜，然后用在pbst(pbs,ph7.4,0.5％tween-20)，然后用300μlpbst洗孔3次，清洗后，将在pbst中纯化的抗-ctla-4scfv噬菌体加入微孔，一式三份并在室温下孵育1小时。然后用300μlpbst洗孔3次。加入100μl抗-m13hrp共轭的抗体并在室温孵育1小时。用100μltmb1溶液完成hrp的检测。用100μl1n的盐酸终止反应并在450nm测定吸光度。图19显示了抗-ctla4与小鼠和人ctla4的结合。包含一个igg作为ab的aas在一下部分描述了一种在人igg中含有一种抗-egfr和抗-vegf的aa的例子。在正常情况下，这些氨基酸被屏蔽处于无活性状态。当aa到达病变组织，它们被特定的病变蛋白酶裂解，然后与其靶点结合。细菌显示用于研究适合于抗-egfr和抗-vegf抗体的mm。在本实施例中，选定的mm与酶的底物一起用作引发剂以生成aa，成为根据蛋白酶激活性特异性结合到靶点的成分。此外，细菌显示是用来改变发现的肽，以增加ab亲和力，并加强对未裂解状态靶向结合的抑制力。增加mm的亲和力和增强抑制对于适当的aa功能是很重要的。实施例15一种抗-vegfiggaa的构建抗-vegfigg抗体的构建使用抗-vegfmmp-9306scfv(如上所述)作为为模板，用引物cx0311和cx0702经pcr扩增抗-vegf轻链可变区，然后使用ecori和bsiwi酶切位点(pfil2-vegf-lc)，克隆到pfil2-cl-hk的载体。使用抗-vegfmmp-9scfv作为模板，用引物cx0325和cx0702经pcr扩增306mmp-9轻链并克隆到如上述的(pfil2-306mvegf-lc)。使用306mm/mmp-9cm/抗-vegfscfv(如上所述)作为模板，用引物cx0700和cx0701将pcr扩增抗-vegf重链可变区并用ecori和nhel酶切位点(pfil-vegf-hc)克隆到pfil-chig-hgl载体。下表26中提供了引物。如上所述，屏蔽306，用于抗vegfaa发展并在长时间的暴露于靶点时，没有有效地掩盖靶点结合，由于mm为ab低亲和力的目标。增加亲和力的mm的方法之一，是受肽亲和力成熟，如下所述。亲和力成熟的库构建物306抗vegf的mm是用柔软的随机方法亲和力成熟。一个ecpx细胞库建于表28所示的核苷酸比率。最后库多样性(306sr)约为2.45×108。表28306sr库筛选采用蛋白-a标记的磁珠大于库中100x过量采样量的细胞开始macs循环。在磁性选择之前，100nm抗-vegfigg和10μm306肽(306p,pcsewqsmvqprcyyg)孵化细胞，以减少具有与原306序列相同或更低的亲和力的变体结合。磁性选择来自2x107细胞分离。对于用1nmdylight(fluor530nm)抗vegf标记的细胞进行流式细胞仪排序的第一轮循环。采用选择性群体压力，对于在100nm、306p的存在下，采用1nmdylight抗vegf标记的细胞进行流式细胞仪排序的第二和第三轮循环。选择开口以便只有5％具有最强结合的细胞被收集。在第三轮循环被排序的细胞群首次采用10nmdylight-抗-vegf孵育，接着加入306p使其最终浓度为100nm，在37℃孵育20分钟。收集最亮的2％的阳性群体，表示306p结合不完全。流式细胞仪按照下述方式循环5～7周；群体采用10nmdylight标记的抗-vegf标记，的人口被打成10nmdylight标记的抗血管内皮生长因子，然后与未标记的vegf(100nm)在37℃分别竞争7，10和15分钟。最亮的1％在流式细胞仪进行了5至7周排序。表29306sr亲和力成熟胎分析对3种不同的荧光标记的抗-vegf浓度，在facs分析ecpx3.0克隆体306、js1825、js1827和js1829的结合。结合曲线如图21所示。所有三个亲和力成熟肽显示比306p高至少10倍的亲和力。抗-vegfaas的构建用引物cx0289和cx0687通过pcr扩增亲和力成熟的ecpx3.0克隆体(js1825，js1827，js1829)并用sfil酶切位点克隆到pfil2-306mvegf-lc产生载体pfil2-1825mvegf-lc、pfil2-1827mvegf-lc和pfil2-1829mvegf-lc。在下表中提供了核苷酸和氨基酸序列，括号划定了各种序列域之间的界限：(链接体)(毫米)(链接体)(cm)(链接体)(ab)。抗-vegf抗体和aa的表达和纯化根据制造商协议(invitrogen公司)使用脂质体200(invitrogen公司)将3μgpfilvegf-c和3μgpfil2-vegf-lc共转染到cho-s细胞(invitrogen)。在自由型培养基(invitrogen公司)中培养并选用于阻碍博莱霉素和杀稻瘟。用有限稀释法分离出单个克隆体并通过elisa法选择用于表达能结合egfr的人igg，使用标准技术通过蛋白-a色谱纯化所有的抗体和aas。同样，用3μgpfil-vegf-hc将3μg每种aa轻链pfil2-306mvegf-lc、pfil2-1825mvegf-lc、pfil2-1827mvegf-lc、或者pfil2-1829mvegf-lc的表达载体共同转染到3μgcho-s细胞。在自由型cho培养基(invitrogen)培养转染的细胞并选择用于阻碍博莱霉素和杀稻瘟。用有限稀释法分离出单个克隆体并通过elisa为能够结合egfr人igg表达选定单个克隆体。抗-vegf抗体和aa的靶点置换实验将vegf吸收到96孔微滴度板，洗净，用牛奶蛋白封堵。将约25ml含有抗-vegf抗体或抗-vegfaa的含mm的js306、js1825、js1827和js1829的培养基加入涂敷的孔中并孵育约1、2、8或24小时。清洗经过孵育后的板孔，并通过抗-huigg免疫检测结合aa程度。实施例16:抗-egfriggaa的构建抗-egfriggaa的构建用寡核苷酸cx638-cx655通过组装pcr合成c225轻链可变区基因，如bessette等，methodsinmolecularbiology,vol.231。得到的产品用bamhi/notl消化并用bamhi/notl消化结合到bamhi/notl消化的pxmal的大片段产生质粒px-scfv225-vk。类似地，用寡核苷酸cx656-cx677通过组装pcr合成c225重链可变区基因，用bglll/notl消化并结合到pxmalbamhi/notl生成质粒px-scfv225-vh。然后，将轻链可变区基因作为一个bamhi/notl片段从px-scfv225-vk克隆到px-scfv225-vh质粒的bamhi/not位点生成质粒px-scfv225m-hl，基于c225含有scfv基因。将il2信号序列作为一个kasl/ncol片段转移到用kasl/ncol消化的pfuse2-clig-hk(invivogen)，产生质粒pfil2-cl-hk。将il2信号序列也作为一个kasi/ecori片段从pinfuse-higgl-fc2转移到用kasi/ecori消化的pfuse-chig-hgl(invivogen)在三个方向结合，产生质粒pfilchig–hgl。用寡核苷酸cx325/cx689从质粒pfil2-cl-hk通过扩增将人igg重链恒定区实施位点特异性突变，bsiwi/nhel消化，并在bsiwi/nhel克隆到pfil2-cl-hk，产生pfil2cl225。在三个片段中，用寡核苷酸cx325/cx689、cx690/cx692和cx693/cx694从质粒pfil-chig-hgl通过扩增将人igg重链恒定区实施位点特异性突变，接着用外引物cx325/cx694通过重叠pcr扩增所有三个产品。用erori/avrll消化得到的产品并在ecori/nhel克隆到pinfuse-higgl-fc2，产生质粒pfil-ch225。从px-scfv225mhl和寡核苷酸cx695/cx696扩增可变轻链基因片段，用bsal消化，并在ecori/bsiwi克隆到pfil2-cl225，导致c225轻链表达载体pfil2-c225-光。从px-scfv225m-hl和oligoscx697/cx698扩增可变重链基片段，用bsal消化，在ecori/nhel克隆到pfil-ch22，导致c225重链表达载体pfil-c225-重链。抗-egfraa表达载体的构建在不同的反应中，使用引物cx730/cx731和cx732/cx733通过pcr扩增质粒px-scfv225m–hlp，使用外引物cx730/cx733通过重叠pcr扩增所得到的产品，用bglll/notl消化，并在bamhi/notl克隆到pxmal，产生质粒px-scfv225m-lh。在一个与重叠正向引物cx740,cx741和反应引物cx370反应中通过pfuse-higg-fc2的pcr扩增将链接体序列加入人iggfc片段基因的n-末端。用ecori/bglll消化所得到的产品，将～115bp片段在ecori/bglll克隆到pfuse-higg-fc2。将所所得脂质用kpnl/bglll消化，将大片段结合到kpnl/bamhi消化的，用oligoscx736/cx735扩增px-scfv225m-lh的pcr产品，产生质粒pphb3734。用sfil/xhol消化得到的质粒，克隆掩蔽肽3690作为pphb3690的sfil/xhol片段，产生质粒pphb3783。加入蛋白酶底物sm984，用bamhi/kpnl消化得到的质粒用，并结和退化磷酸寡核苷酸cx747/cx748的产品，产生质粒pphb3822。通过用xhol得到的质粒、去磷酸化消化5'端，并克隆到xhol-消化的用引物cx268/cx448扩增pphb3579的pcr产品构建串联肽掩蔽体，产生质粒pphb3889。使用引物cx325/cx696通过pcr扩增pphb3783、pphb3822和pphb3889的掩蔽的区域、链接体、底物和轻链可变区，用ecori/bsiwi消化，并在ecori/bsiwi克隆到pfil2-cl225分别产生aa轻链表达载体pphb4007、pphb3902和pphb3913。通过克隆如sfil/xhol的片段，亲和成熟掩蔽肽交换到到aa轻链表达载体。如bamhi/kpnl相容片段，蛋白酶底物被交换进入。抗egfr抗体和aa的表达与纯化根据制造商协议(invitrogen公司)使用脂质体200(invitrogen公司)将3μgpfil-ch225-hl和3μgpfil2-ch225-light共转染到cho-s细胞(invitrogen)。在自由型培养基(invitrogen公司)中培养并选择用于阻碍博莱霉素和杀稻瘟。用有限稀释法分离出单个克隆体并通过elisa为能够结合egfr人igg表达选定单个克隆体。所有的抗体和aas使用标准技术用蛋白-a色谱纯化。同样，用3μgpfil-ch225-hl将3μg每种aa轻链的表达载体共同转染到3μgcho-s细胞。在自由型cho培养基(invitrogen)培养转染的细胞并选择用于阻碍博莱霉素和杀稻瘟。用有限稀释法分离出单个克隆体并通过elisa为能够结合egfr人igg表达选定单个克隆体。亲和力成熟的抗-egfrmm库的筛选用sa磁珠和ecpx3-755库中的1.4×108细胞进行第一轮macs。在磁性选择之前，用3nm生物素标记的c225mab孵育细胞，磁选择产生6×106分离细胞。对2×107用0.1nm荧光剂-c225(fluor530nm)标记的细胞进行第一轮facs排序，产生阳性结合的1.5×105细胞，提高细胞群选择压力，37℃下在100μm3690肽(cisprgc)存在下对10nm荧光剂-c225标记的细胞进行第二轮facs排序。进一步提高选择压力，37℃下在100μm3690肽(cisprgc)存在下对10nm荧光剂-c225标记的细胞进行第三轮和第四轮facs排序，收集了1％最亮的阳性细胞群，代表结合没有被3690肽竞争。对从上述筛选中分离出的单个克隆体的细胞亲和力测量显示由三种肽3954(cisprgcpdgpyvm)、3957(cisprgcepgtyvpt)和3958(cisprgcpgqiwhpp)具有对c225至少有大于3690(cisprgc)100倍的亲和力。图22显示了一些egfrmm的亲和力成熟过程。c225mm的亲和力测定c225结合mm的3690、3954和3957的细胞亲和力测量。对结合ecpx3.0的克隆体3690、3954和3957，在3种不同浓度的荧光剂标记的抗-egfrfab之间进行facs分析。结合曲线如图23所示。mm3954和3957显示比3690至少有高于100倍的亲和力。抗egfraa的靶向目标替代物分析将egfr吸收到96孔微滴度板孔内，洗净，用牛奶蛋白封堵。将约25ml含有2nm抗-egfr或抗-vegfaa含mm的3690,3957，3954and3960/3579的培养基加入涂敷的孔中并孵育约1、2、8或24小时。清洗经过孵育后的板孔，并通过抗-huigg免疫检测结合aa程度。以抗-egfr抗体的结合(100％)为准对抗-egfraa的结合进行标准化以便在aa背景下直接对比掩蔽效率。以亲代或未修饰抗体的百分比表示的平衡结合程度显示在表34和图24中。鉴于mm3954和3957显示相同的亲和力，比3609、3954高出100倍，在抑制靶点结合是至少有2倍以上的更高效率。下表中提供了c225重链和轻型链、mms和aa的序列。下表也提供了核苷酸和氨基酸序列。括号划定了各种序列域之间的界限：(链接体)(mm)(链接体)(cm)(链接体)(ab)。表34：c225tda：亲代抗体结合的百分比+在每个时间点的sem时间(小时)3690aa3954aa3975aa3690/3579aa115.5±4.24.4±1.87.3±2.03.6±1.2219.3±6.06.0±2.09.3±2.82.1±0.6421.5±5.07.6±1.712.8±2.33.3±1.2827.6±7.49.7±0.414.9±0.033.0±1.62420.0±9.113.4±1.222.3±2.62.8±0.1egfrmm共有序列以下提供了egfrmms的共有序列。3690mm共有序列是一种主要的共有序列。实施例17：选择性底物/cm的发现和测试一下部分是发现选择性底物和测试一些典型的酶的过程。upa选择性底物的发现从一个8eclips细菌库中分离出upa选择性底物，该细菌库含有～108随机8-mer表达成n末端融合在在大肠杆菌表面上的底物。用facs通过正负选择交替轮富集优化的底物用于upa裂解和耐脱靶丝氨酸蛋白酶klk5和7裂解。原生库用8ug/mlupa在37℃孵育1小时，然后用sape(红)和ypetmona(绿)标记。upa裂解导致sape标签的损失，并允许从细菌表达未裂解肽(红+绿)表达排序细菌表达的upa底物(绿色，阳性选择)。用facs对upa的底物进行排序，将经过富集的库扩增然后用5ng/mlklk5和7在37℃孵育1小时，用sape和ypetmona进行标记，用这些脱靶蛋白酶进行缺乏裂解排序(红+绿，阴性选择)。将该库扩增，并用降低浓度的upa(4ug/ml,2ug/ml)和提高浓度的klk5and7(5ng/ml,10ng/ml)进行4个额外的交替轮的正负facs排序。对每个最后3轮facs的单个克隆体进行测序分析(表45)。然后对每一个来自共有序列的克隆体进行upa浓度范围的裂解分析，mmp-9、klk5和7和纤溶酶plasmin裂解特异性对脱靶蛋白酶裂解性分析。有代表性的数据显示，对纤溶酶裂增加的解特异性，如表44所示。图25显示了，不像一个upa对照，底物sml6,kk1203,1204和1214显示抗klk5、klk7和纤溶酶裂解。纤溶酶选择性底物发现从第二代纤溶酶10eclips细菌库分离纤溶酶选择性底物，该库含有随机10-mer表达成n末端融合在在大肠杆菌表面上的底物。用facs通过正负选择交替轮换富集优化的底物用于纤溶酶裂解和耐脱靶基质金属蛋白酶(以mmp-9代表)。和丝氨酸蛋白酶(以klk5和klk7代表)裂解。第二代纤溶酶10eclips库是基于一种室内验证的共有序列，通过选择8eclips快速裂解纤溶酶底物来浓缩低至30pm纤溶酶以便选择。在l0mer内的单个残基是随机的(n＝20)，限制的(l<n>20)或固定的(n＝l)偏离趋于共有序列的肽。同时允许不利脱靶序列中的选择灵活性。第二代纤溶酶10eclips库用300pm纤溶酶在37℃孵育1小时，接着用sape(红)和ypetmona(绿)进行标记。纤溶酶裂解的结果导致sape标签损失，允许从细菌表达未裂解肽(红+绿)排序中细菌表达纤溶酶底物(绿色，阳性选择)。从而用facs纤溶酶底物进行了排序。对经过富集库进行扩增，然后用80u/mlmmp-9在37℃孵育2小时，用sape和ypetmona做标记，用这些脱靶蛋白酶进行缺乏裂解排序(红+绿，阴性选择)。将该库扩增，并用纤溶酶(第三轮lpm或30pm,第五轮l00pm或300pm)和klk5和7(第四轮100ng/ml,第六轮200ng/ml)进行4个额外的交替轮的正负facs排序。对每个最后2轮facs的单个克隆体进行测序分析(表45)。然后对每一个来自共有序列的克隆体进行纤溶酶裂解分析，mmp-9、klk5和klk7的裂解特异性对脱靶蛋白酶裂解性分析。有代表性的数据显示，对纤溶酶裂增加的解特异性，如图26所示。图26显示了，不像一个非优化的底物，优化的底物plasl237，plasl29和plas1254显示抗klk5、klk7裂解。sm1231yvprvkalemupa酶活化的aa序列下表提供了upa酶激活抗vegf轻链aa的核苷酸和氨基酸序列。括号划定了各种序列域之间的界限：(链接体)(mm)(链接体)(mm)(链接体)(ab)。纤溶酶激活的aa序列下表提供了纤溶酶激活抗-vegf轻链aa的核苷酸和氨基酸序列。括号划定了各种序列域之间的界限：(链接体)(mm)(链接体)(cm)(链接体)(ab)。豆类天冬氨酸蛋白内切酶-活化的aas天冬酰胺内肽酶底物aanl和ptnl的序列为本专业所熟知(liu,etal.2003.cancerresearch63,2957-2964；mathieu,etal2002.molecularandbiochemicalparisitology121,99-105)。下表提供了天冬酰胺内肽酶激活的抗vegf轻链aa的核苷酸和氨基酸序列。括号划定了各种序列域之间的界限：(链接体)(mm)(链接体)(cm)(链接体)(ab)。级联激活aa下表提供了凋亡酶激活的抗-vegf轻链aa的核苷酸和氨基酸序列。括号界定了各种序列域之间的界限：(链接体)(mm)(链接体)(mm)(链接体)(ab)。凋亡酶底物、序列devd为本专业所熟知。天冬酰胺内肽酶和级联激活的aa表达载体的构建在一个具有两个步骤的过程中构建底物。首先，这两种产品用cx0325正向引物和底物特定的反向引物(cx0720aanl、cx0722ptnl、cx0724ptn和cx0758devd)进行pcr扩增，另一个用cx0564反向引物和底物特定的前向引物正向引物(cx0721aanl、cx0723ptnl、cx0725ptn和cx0754devd)进行pcr扩增。在两种情况下pcr扩增的底物是抗-vegfmmp-9306scfv。其次，两种产品结合并用引物cx0325和cx0564进行pcr扩增。用ecori和xhol酶切位点将最终产品克隆到pfil2cl-抗-vegflc。豆类天冬氨酸蛋白内切酶激活aas的表达和纯化根据制造商协议(invitrogen公司)，使用脂质体200(invitrogen公司)将3μgofpfilvegf-hl和3μgpfil2-306-底物-vegf-light共转染到cho-s细胞(invitrogen公司)。转染细胞在cho底物(invitrogen公司)中培养并选择抗博莱霉素和杀稻瘟素。用有限稀释法分离出单个克隆体并通过elisa为能够结合egfr人igg表达选定单个克隆体。所有的抗体和aas使用的标准技术用蛋白-a色谱纯化。scfvaa消解试验说明在测试缓冲液中将scfvaa稀释到200nm，并加入2ug/ml在稀释在测试缓冲液中稀释的rhlegumain。消化物在室温下孵育过夜。将iggaa在缓冲液稀释到200nm，并加入缓冲液稀释的rhlegumain，浓度为2-40mg/ml，rhlegumain的最终浓度lug/ml,5ug/ml,20ug/ml，5ug/ml，20ug/ml。消化物在37℃孵育过夜。消化后，激活的程度，通过aa与在elisa板上的vegf的结合程度测定，用抗-人类-fc实现可视化。图27中的面板a显示含有aanl和ptnl底物接着用5mg/ml天冬酰胺内肽酶处理的scfvaas的激活。面板b显示抗含有天冬酰胺内肽酶底物pntl的vegfiggaa的激活。天冬酰胺内肽酶激活的aa的体内稳定性四个12周龄balb/c小鼠分别给予100微克的纤溶酶原激活的aa、aaplasvegf、或天冬酰胺内肽酶激活的aa、aaaanlvegf或aaptnlvegf之一的单次注射。在注射后15分钟、1天、3天、7天收集血清。通过elisa法测量血清中的总人类fc计算总aa浓度。从人的vegf结合elisa的测量计算激活抗体的浓度，如图28所示。注射7天后从血清中分离出的天冬酰胺内肽酶激活的aa仍然保持掩蔽(n＝4)。在每个时间点，激活aa与总aa的比率是对动物个体的测量的平均值，并以百分比表示，如图28所示。而由纤维蛋白溶酶激活的aa在7天内几乎完全被激活。而两种由天冬酰胺内肽酶激活的aa仅最低限度地被激活。实施例18:aas的血清半衰期图29显示了一个掩蔽的单链抗体fv-fc融合的亲代抗体表现出提高了的血清半衰期。一个掩蔽多肽被连接到一个抗体的n-末端，这样掩蔽可以与抗体的结合点相互作用以提高热力学稳定性或阻碍中和抗体抗体。一种蛋白酶底物可用于在血清或特定组织中以不同速率清除这种掩蔽。图30显示，超过10天的健康小鼠的scfv-fc在血药浓度。c57bi/6小鼠(每个时间点n＝3)分别给予单剂量(150ug)抗vegfscfv-fc、aammpvegf(aa1)或aaplasmmvegf(aa2)。在指定的时间收集血清和用elisa法检测总的scfv-fc浓度。aa的浓度在给予剂量7天后保持稳定，而亲代的scfv–fc浓度第3天后下降，并在10天后几乎检测不到。图31显示，与在荷瘤小鼠的亲代scfv-fc相比，aa的scfv-fc浓度升高并在血清中维持较长时间。相当于单剂量抗vegfscfv-fc，aammpvegf(aa1)或aaplasmnvegf(aa2)给予苛有ht29异种移植(a)或mda-mb-231异种移植(b)的裸鼠。在指定的时间收集血清，用elisa法检测总的scfv-fc浓度。在这两项研究中，在3天(b)及3和7天(a)，在血清中检测到与初始aa剂量相比的更高比例的浓度。图32显示了在一项多剂量研究研究中aa维持在较高的浓度：荷瘤balb/cnu/nu小鼠血注射5mg/kg亲代vegfscfv-fc、aa1，没3天2次或3次。在指定的时间收集血并用elisa法检测aa的浓度，在整个研究过程中，所有三种aa比亲代保持显著的血清浓度。vegfscfv-fcsaa的氨基酸序列对比亲代抗体，aa表现出提高了的血清半衰期。8个12周龄的balb/c小鼠分别给予100μgmmp激活的aa、aammpvegf、纤溶酶激活的aa，aaplasvegf或亲代抗-vegf抗体ab–vegf进行单次推注。在注射后15分钟、8小时、1天、3天、7天、10天收集血清。通过elisa法测量血清中的总人类fc计算总aa浓度。在各个时间点，以对动物个体测量的平均和作为初始剂量的百分比表示的总aa浓度如图33所示。氨基酸和亲代抗体的分布类似并符合预期。在15分钟达到一个高和相等的浓度并在第一天分布到组织中。与超过10天后亲代抗体几乎完全消除相比，在试验期间两种aa在血清中的浓度都保持在较高水平。实施例19：基于aa供给的副作用降低被典型地供给一种传统egfr抗体治疗时，大于80％的患者在人体最大的器官皮肤上表现出毒性。当患者供给直接对抗egfr的aa时，预计对皮肤有很小或没有毒性，因为缺乏疾病特异性cm，aa将在皮肤中不被激活。因此，预计，aa的抗-egfrab将不能与egfr的靶点特异性结合。此外，预计在这样的患者中，因为aa不会在皮肤中激活，aa将不会被隔离，并预期，aa将保持高水平的血药浓度，从而提高了aa在病变组织中的浓度，有效地提高有效剂量。基于疾病的环境，cm在病变组织中水解将导致一个激活的aa，允许解掩蔽及ab与egfr靶点的特异性结合，并会导致理想的治疗效果。虽然用针对具体实施例的参考文献对本发明经了描述。本专业的技术人员应该理解，在不离开本发明的真实精神和范围的情况下，可以提出各种变化和等价替换。此外，也可提出许多修改，以适应特定情况下、材料、物质的组成、过程、一个或多个过程步骤或步骤、本发明的目的、精神和范围。所有这些修改的目的均在所附的权利要求范围内。当前第1页12