AKT1基因突变检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因AKT1基因突变检测试剂盒。
背景技术：
：近年来，PI3K/AKT通路受到很大关注，AKT1是该通路中的关键分子，其持续活化与细胞增殖密切相关，AKT1的多种底物均具有促进细胞生长增殖的作用。本研究结果显示，AKT1在大肠腺癌中的表达率与正常大肠粘膜中的表达率相比差异有非常显着统计学意义(P<0.01)，提示在大肠腺癌的发生发展过程中，AKT1的高表达与肿瘤的演变过程中起着重要作用。可以作为大肠腺癌基因治疗的一个良好靶点。某些人类癌症中，AKT1激酶的plekstrin同源区（plekstrinhomologydomain，PHD）含有一个点突变，促进膜结合（membraneassociation）和肿瘤形成。AKT1/PKB激酶是PI3K信号传递途径（在人类癌症中常常失控）的一个下游靶标，依赖于膜结合和随后的磷酸化而活化。AKT的PHD（plekstrin同源区）与PIP3或PIP2磷脂结合，调控膜定位。体外实验中，AKT的膜结合突变会改变啮齿类和人类的细胞。虽然磷酸化的AKT在几种人类癌症中都有上升，但至今未有关于AKT的致瘤性突变的报道。最近，JohnD.Carpten与其同事证实，几种人类肿瘤样本中AKT1的PHD中的点突变有一致性，促进膜结合和细胞转化。研究人员对这些人类乳腺癌、结肠癌和卵巢癌样本的基因组进行测序，未曾发现AKT1的催化区（catalyticdomain）有突变，但至少6％的肿瘤样本中，AKT1PHD(AKT(E17K))的磷脂结合位点中，第17位的谷氨酸突变为赖氨酸。这种突变改变了PHD的构造，提高了AKT激酶在体外的活性。没有生长因子刺激时，PIP2和PIP3的细胞水平下降，AKT1仍停留在细胞质中。活细胞成像结果显示，AKT(E17K)即便在细胞饥饿时也能够联合质膜，说明PHD突变的膜结合不需要PIP2或PIP3，或者PHD突变能够结合低水平表达的磷脂。Rat1纤维原细胞表达AKT1，导致停泊和接触－非依赖性（anchorage-andcontact-independent）生长；表达AKT(E17K)和造血干细胞中IgH增强子驱动的c-Myc的小鼠会发展出白血病。AKT1/2抑制剂VIII和LY294002分别阻断AKT1(E17K)的膜结合和PI3K的活性，但这两种试剂对AKT1(E17K)的定位和活性无影响——为发展基于阻断致瘤性PI3K途径信号传递的癌症治疗策略提供了重要参考。PI3K途径通过促进磷酸化和膜结合，激活AKT。有趣的是，这些在人类肿瘤样本中发现的AKT1突变与其它PI3K途径突变不相符，证明AKT(E17K)即使在上游LI3K途径没有活性的情况下也能促进细胞转化。这种在AKT1的PHD区种发现的致癌性突变研究PI3K在人类癌症中的作用及发展PI3K抑制剂的重要进步。另外，68例Survivin表达阳性者中AKT1表达阳性者有61例，其表达强度也呈相同的变化趋势，为明显正相关，提示二者具有协同作用，说明在Survivin阳性组，AKT1一直处于激活状态，即p-AKT1水平与Survivin密切相关。而Survivin与AKT1之间是否有直接的相互作用，具体通过哪种机制相互影响，尚有待进一步证实和研究。另外本研究结果显示，AKT1与caspase-3、Survivin与caspase-3之间无明确相关性。在大肠腺癌中，AKT1、Survivin呈高表达，caspase-3呈低表达，提示AKT1、Survivin以及caspase-3在大肠癌癌变过程中发挥重要的作用，AKT1与Survivin之间呈正相关，它们相互协同，共同促进了大肠癌的发生发展。AKT1、Survivin在大肠腺癌中的表达明显高于正常对照组，可以作为大肠癌早期诊断的筛选指标。AKT1基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技术采用等位基因特异性扩增法对样本的基因突变进行区分，该方法成本较低，但检测率较高，容易出现假阴性结果；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种可用于Sanger测序法检测AKT1基因的技术具有重要的临床意义。技术实现要素：本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种AKT1基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中AKT1基因主要突变位点c.49G>A,p.E17K。本发明的AKT1基因突变检测试剂盒具体包括：（1）用于扩增样本中AKT1基因Exon3号外显子的特异性引物，具体序列如下:名称序列号Reverse5’-3’AKT1Ex3-FSEQIDNo.1GAGGGTCTGACGGGTAGAGTAKT1Ex3-RSEQIDNo.2TTACGCGCCACAGAGAAGTT（2）用于测序PCR的测序引物，用于对AKT1基因c.49G>A,p.E17K突变位点进行测序分析，具体序列如下：名称序列号Reverse5’-3’SEQ-A3SEQIDNo.3TTACGCGCCACAGAGAAGTT（3）1个装有AKT1野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒为AKT1基因上的c.49G>A,p.E17K突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：组份体积（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl21.525mMdNTPs0.4H2O10.35其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本试剂盒主要是根据AKT1基因的Exon3号外显子的保守序列分别设计AKT1基因c.49G>A,p.E17K突变位点的特异性引物，并纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：（1）引物设计：利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从AKT1基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计AKT1基因Exon3号外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQIDNOs：1-3。长度在20-25个碱基左右。（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因AKT1的Exon3号外显子片段回收用于测序。附图说明以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。图1为AKT1基因的Exon3号外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。图1中各标号的具体表示如下：1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；4：4号样本；5：5号样本；6：6号样本；M：DNAmaker，从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。图2-1为AKT1基因的Exon3号外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。图2-2为AKT1基因的Exon3号外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。具体实施方式1、引物设计根据AKT1基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如PrimerPremier5，从AKT1基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计AKT1基因Exon3号外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQIDNos：1-2。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列是SEQIDNos：3。2、PCR扩增2.1、质控品准备阳性质控品为AKT1野生型质粒和突变型质粒按质量比1:1的比例混合，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。2.2、试剂配制提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。确定反应数N，N=待检样本数（n）+质控品数+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下：组分PCRmix3（即PCR反应预混液）Taq酶体积（μl）19.75×N0.25×N取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。2.3、加样将AKT1阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加1.25μl（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。2.4、PCR扩增配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。回收得到的产物即可用于测序。序列表<110>中山大学广东凯普生物科技股份有限公司<120>AKT1基因突变检测试剂盒<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>AKT1Ex3-F<400>1gagggtctgacgggtagagt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>AKT1Ex3-R<400>2ttacgcgccacagagaagtt20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-A3<400>3ttacgcgccacagagaagtt20当前第1页1 2 3