一种小麦γ‑醇溶蛋白启动子区域甲基化的检测方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种针对小麦γ-醇溶蛋白启动子区域是否被甲基化的检测方法。

背景技术：

小麦籽粒主要由蛋白、核酸、脂类、糖类、水分等类型物质组成。小麦种子中储藏蛋白所占比例大，主要包括谷蛋白和醇溶蛋白两类，它们决定了小麦独特的加工品质。小麦面粉在加水揉和时可形成有弹性且能粘合的面团，其独有的粘合性是因其含有不溶于水的蛋白质，即麦谷蛋白和麦醇溶蛋白。一般而言，醇溶蛋白占小麦种子储藏蛋白总量的40~50%，是人类主要摄取蛋白营养的来源之一。

已有研究认为，小麦是主要的食物过敏原之一，因而小麦籽粒中蛋白质的含量和质量直接影响人的生活品质和健康。例如，小麦醇溶蛋白是乳糜泻的主要致病抗原，它主要以多肽单链的形式存在，富含谷氨酰胺和脯氨酸，根据醇溶蛋白在A-PAGE （pH=3.1）电泳迁移率的不同，可将其分为α（最快）、β、γ和ω（最慢）四种类型，这些蛋白的毒性被认为对粘膜损害较大。因此，对醇溶蛋白的克隆和功能解析也日渐成为当今小麦基因组研究的主要任务之一，尤其对小麦中特定醇溶蛋白（如γ-醇溶蛋白TaWG04）的克隆、分析，可为特定过敏人群的健康提供基础性的研究保障。

就基因序列（如启动子序列）而言，当其被特定改造或化学修饰后，通常即意味着表达活性的丧失。作为化学修饰中的一种，DNA甲基化属于一种经典的表观遗传学现象，也是一种较为常见、研究的较为深入的一种基因修饰方式。DNA甲基化过程为：在DNA甲基转移酶的催化下，甲基基团转移到胞嘧啶碱基（C）上。DNA甲基化修饰后，DNA 序列并不发生改变，但基因的转录和表达通常会受到明显影响，甚至可能引起基因的沉默。

就γ-醇溶蛋白TaWG04的研究而言，现有研究已对其基因序列、基因表达模式有了基础性的研究。但在进一步研究中发现，不同品种之间该基因的表达量存在着一定的差异，而对造成这一差异的原因：例如是由于基因序列差异、还是启动该基因表达的启动子的差异，则需进一步研究。就启动子研究而言，则需对是由于启动子序列差别，还是化学修饰原因进行进一步甄别。而基于这些研究，则可对特定蛋白的表达进行基因调节，从而较为彻底解决过敏原蛋白问题，因而具有十分重要的应用意义。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种针对γ-醇溶蛋白TaWG04的启动子pTaWG04的碱基是否发生甲基化的检测方法，从而便于判定γ-醇溶蛋白TaWG04能否得到有效表达，进而为小麦品质改良奠定应用基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种小麦γ-醇溶蛋白启动子区域甲基化的检测方法，所述小麦γ-醇溶蛋白为γ-醇溶蛋白TaWG04，所述启动子为启动γ-醇溶蛋白TaWG04进行翻译表达的启动子pTaWG04，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；具体检测步骤如下：

（1）提取小麦样品的DNA，并用重亚硫酸盐处理DNA提取物；

（2）利用在线甲基化引物设计软件进行特异性引物的设计，（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）引物序列如下：

正向引物F：5’-ATTTTTTGAGGAATTTTATATTTGGTT-3’，

反向引物R：5’-ATCCRTTTCAATTAAATCTTCCA-3’；

（3）以步骤（1）中处理后DNA为模板，利用步骤（2）中所设计的引物序列，进行甲基化特异PCR（MSP）反应；10μL的 PCR检测反应体系设计如下：

25mM Mgcl₂，1μL；

10×Maxima Hot Start Taq buffer，1μL；

Maxima Hot start Taq DNA Polymerase，0.1μL；

2.5mM dNTP mix，1μL；

正向引物F，0.2μL；

反向引物R，0.2μL；

步骤（1）中处理后的DNA模板，1μL；

ddH₂O，5.5μL；

PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延长1min，30个循环；72℃后延伸10min；

（4）回收步骤（3）中PCR扩增产物，利用TA克隆技术，将所回收的PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上，经转化、筛选、验证后，挑选阳性克隆质粒进行测序；

将测序结果与确定的未甲基化序列进行比对，最终判定启动子pTaWG04区域碱基序列的甲基化情况，判定方法为：

经甲基化特异PCR反应后，DNA序列中非甲基化的胞嘧啶（C）会完全转化为尿嘧啶（U），而如果含有甲基化碱基，则甲基化的5-甲基胞嘧啶会保持不变。

所述确定的未甲基化序列，为小麦品种中γ-醇溶蛋白TaWG04正常表达所对应的的启动子pTaWG04的序列。

所述γ-醇溶蛋白TaWG04正常表达所对应的的启动子pTaWG04的序列，所对应小麦品种具体例如为郑麦004。

所述pTaWG04启动子，发生甲基化的小麦品种，具体例如为郑麦366、西农979、新麦26、郑麦9023或济麦20。

甲基化修饰的pTaWG04启动子在小麦品种改良中的应用，pTaWG04启动子的-749bp处胞嘧啶（C）和-729bp处胞嘧啶（C）发生甲基化修饰时，抑制γ-醇溶蛋白TaWG04的表达；

所述甲基化修饰的pTaWG04启动子，其对应小麦品种来源，具体例如为郑麦366、西农979、新麦26、郑麦9023或济麦20。

基于上述甲基化检测方法，检测结果表明，小麦品种郑麦366中醇溶蛋白TaWG04的启动子pTaWG04上游的区段TTGCACACGGTGTATCAAATACAATGACGCA（-756bp ~-726bp）中的-749bp的胞嘧啶（C）和-729bp的胞嘧啶（C）被甲基化修饰，而甲基化修饰后，抑制了醇溶蛋白TaWG04的表达；进一步实验表明，针对相应甲基化碱基去甲基化后，醇溶蛋白TaWG04基因的表达得到了增强。

在前期研究中，发明人发现γ-醇溶蛋白TaWG04的基因组DNA序列在郑麦366和郑麦004中无差异。然而，该基因表达水平在两个品种中具有明显差异，该基因的表达在郑麦366明显受到抑制，结合其他研究情况，发明人推测γ-醇溶蛋白TaWG04的启动子pTaWG04区域部分碱基序列可能存在甲基化现象。

针对基因的甲基化检测方法中，甲基化特异PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）是一种快速检测基因是否甲基化的方法，其技术原理是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶（C）完全转化为尿嘧啶（U），而尿嘧啶（U）在DNA复制过程中转化为胸腺嘧啶（T），而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变，从而对相关基因是否被甲基化修饰做出判定。由于该方法可以进行微量分析和同源基因分析，因而在相关基因分析中具有一定的应用前景。但就本申请而言，由于前期仅是推测启动子部分碱基序列可能存在甲基化现象，但是否真实存在甲基化以及是否仅是由于启动子部分甲基化造成的基因表达差异，则是未知的，也因此，在面临未知序列时，仅仅依赖于甲基化特异PCR对部分碱基进行检测判定时，是存在较大不确定性的。

总之，本申请所提供的甲基化检测方法特异性针对小麦γ-醇溶蛋白启动子区域进行检测，具有检测周期短、特异性高、准确度高等优点；其直接应用效果是可对启动子是否存在甲基化进行判定，依据此结果，进而可有效识别γ-醇溶蛋白TaWG04在小麦品种中分布情况（或者说可判定γ-醇溶蛋白TaWG04是否得到有效表达），从而为小麦品质改良奠定理论依据和应用基础。

附图说明

图1为郑麦366和郑麦004中TaWG04基因的定量PCR结果；结果表明，TaWGG04基因在郑麦366中表达量较低，该基因的表达可能受到抑制，图中“**”表示TaWG04基因在两个材料中的表达量具有显著性差异；

图2为郑麦366和郑麦004甲基化特异性PCR检测后，TaWG04基因启动子上游-726bp到-756bp的序列对比图；从序列对比中可以看出，在郑麦004中，-749bp和-729bp位置处C转化为T，而在郑麦366中， -749bp和-729bp位置处没有发生转化；其中Un-郑麦366表示甲基化PCR检测处理前核苷酸序列，T-郑麦366-1~10表示10份郑麦366样品的甲基化PCR检测结果，T-郑麦004-1~10表示10份郑麦004样品的甲基化PCR检测结果；

图3为5种不同强筋品种小麦（郑麦366、西农979、新麦26、郑麦9023、济麦20）的TaWG04基因启动子上游的甲基化特异PCR检测结果，其中图A为甲基化特异PCR（MSP）检测后电泳图，图B为甲基化特异PCR（MSP）检测后TaWG04基因启动子上游的序列比对图；图B中Un-郑麦366表示甲基化特异PCR检测前的碱基序列，T-郑麦366、T-西农979、T-新麦26、T-郑麦9023和T-济麦20表示甲基化特异PCR检测后的碱基序列；

图4为利用去甲基化试剂处理5种不同强筋品种小麦（郑麦366、西农979、新麦26、郑麦9023、济麦20）后，定量PCR对TaWG04基因表达量的检测结果；结果表明，经去甲基化处理后，TaWG04基因的表达量明显提高；其中“**”表示TaWG04基因在两个材料中的表达量具有显著性差异。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案进一步详细的说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分物料情况简要介绍说明如下。

生物材料：

郑麦366（强筋品种）、西农979（强筋品种）、新麦26（强筋品种）、郑麦9023（强筋品种）、济麦20（强筋品种）、郑麦004（弱筋品种），均由河南省农科院提供，这些品种均属于可公开获得的商品化小麦品种；

大肠杆菌DH5α菌株，购自北京全式金公司；

实验试剂：

DNA分子量标记（DNA Marker）、PCR mix等为TaKaRa公司产品；

高保真酶Phusion、pMD18-T载体、cDNA第一条链合成试剂盒购自Fermentas公司；

质粒小提试剂盒、胶回试剂盒、RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；

用于甲基化DNA样品提取的试剂盒购自于QIAGEN公司 (DNEASY PLANT MiNi Kit)；

甲基化分析试剂盒购自于QIAGEN公司 (EpiTect Bisulfite Kit)。

实施例1

在前期研究基础上，发明人已知γ-醇溶蛋白TaWG04基因的启动子pTaWG04序列如SEQ ID NO.1所示，因此发明人初步认为郑麦366和郑麦004的γ-醇溶蛋白TaWG04基因的启动子pTaWG04的序列也是相同的。

虽然碱基序列相同，但进一步Real time PCR分析表明，TaWG04基因的表达量（即γ-醇溶蛋白TaWG04的含量）在郑麦366和郑麦004中有明显差异。下面就Real time PCR分析实验简要介绍如下。

（1）首先提取RNA（RNA提取试剂盒），并反转录为cDNA（cDNA第一条链合成试剂盒），具体操作过程为：

分别取郑麦366、郑麦004授粉28天后种子，提取其RNA，并反转录成cDNA；

（2）以Actin作为内参基因，设计特异性引物，以上述所制备cDNA为模板，进行Real time PCR分析；

所用定量引物设计为：

TaWG04-F：5’- TGCATGTCCCATCTGATTGC-3’，

TaWG04-R：5’-TTTCCATTGCTACATCGATGGT-3’；

Actin-F:：5’- GGCCCTTGCTCCTAGCAGTA-3’，

Actin-R：5’- CCGGGACCAGACTCATCGTA-3’；

Real time PCR的20μL反应体系设计如下：

cDNA 模板，60ng/μL、8.4μL；

TaWG04-F，10μM、0.8μL；

TaWG04-R，10μM、0.8μL；

SYBR Green Real-time PCR Master Mix，10μL；

Real time PCR 扩增程序如下为：95℃、2min (1个循环)；95℃、10s，60℃、10s，72℃、30s (40个循环)；95℃、10s (1个循环)；65℃至95 ℃ 5s。

最后，依照2^{−ΔΔ Ct}方法，利用Bio-Rad CFX Manager软件分析Real-time PCR 的结果。根据表达量均值±SEM作图。

结果如图1B所示。从Real time PCR结果可以看出，γ-醇溶蛋白TaWG04基因在郑麦366和郑麦004的表达情况有十分明显的差异。

需要说明的是，相关操作参考相应试剂盒说明书进行操作即可，不再赘述。

实施例2

从上述实施例1可以看出，虽然γ-醇溶蛋白TaWG04基因的启动子pTaWG04序列相同，但在不同品种中γ-醇溶蛋白TaWG04基因表达量差异较大。发明人初步判定这一差别是由于启动子pTaWG04序列存在一定差异造成的，而由于已知其碱基序列是相同的，那么这种差别极有可能是其中一个品种中的启动子中部分碱基序列被化学修饰所造成的。由于甲基化修饰是化学修饰中最为普通和常见的一种改变碱基活性的形式，因而发明人首先利用甲基化特异PCR技术对γ-醇溶蛋白TaWG04基因的启动子pTaWG04的碱基序列是否存在甲基化现象进行了分析，具体检测实验过程简要介绍如下。

（1）提取小麦样品DNA，参考植物DNA提取试剂盒（QIAGEN公司，DNEASY PLANT MiNi Kit）的说明书，分别提取郑麦366和郑麦004的DNA，具体操作步骤如下：

（A）首先用液氮快速冷冻的方法研碎样品（郑麦004和郑麦366种子），然后加入400 μL Buffer AP1与4 μL Rnase A（用前不可混匀），65℃条件下孵育15min，孵育过程中每2~3min颠倒一次（可根据需要适当增长孵育时间，使RNA充分降解）；

（B）向步骤（A）的反应液中加130 μL的Buffer P3，混匀，冰浴5min；然后17000g离心5min；

吸取上清至新的Qiagen shreader吸附柱(紫色)中，再17000g离心2min；

吸取收集液至新的EP管（2mL）中，加1.5mL Buffer AW1，吹打混匀；

再吸取上清650 μL至DNeasy吸附柱（白色）中，10000g离心1min，倒掉上清，重复直至溶液全部移完；

（C）放入新的2mL EP管中，加入500μL Buffer AW2，10000g、离心1min，倒掉上清；

再加入500μL Buffer AW2，17000g、离心2min；

将收集管放入新的1.5mL Ep管中，静置5min（充分除掉乙醇，可在超净工作台中进行）；

（D）100μL Buffer AE溶解，室温放置5min，10000g、离心1min（为提高DNA浓度可减少溶解液的量）；

重复此步骤（将液体重新吸入，再次离心提高样品获得量）。

（2）重亚硫酸盐转化DNA，以便进行甲基化分析，具体为：

利用QIAGEN公司的甲基化分析试剂盒（EpiTect Bisulfite Kit）对步骤（1）中所得DNA进行重亚硫酸盐转化处理，具体处理步骤如下：

（A）开始前准备工作：

Buffer BW中加入30mL 无水乙醇（用之前颠倒混匀），15~25℃保存备用；

Buffer BD中加入27mL 无水乙醇（96%~100%），2~8℃保存备用（使用之前摇匀，使用之后立即盖上盖子）；

加310uL Rnase-free 到Lyophilized Carrier RNA（310μg）中，配成1μg/μL浓度的溶液，涡旋均匀（Carrier RNA使DNA与Epitect膜结合更加紧密）；

将溶解Carrier RNA的溶液与Buffer BL以1:10的比例进行混匀；

实验过程中，如果Buffer BL有析出物，可放置（<70℃）水浴中，柔和搅拌使其溶解；但使用前应使各溶液保持同一室温；

（B）重亚硫酸盐转化DNA，具体过程为：

a、将800μL Rnase-free water 加入到 Bisulfite Mix中，混匀大约5min直至Bisulfite Mix完全溶解（溶解过程中可加热至60℃左右以促进溶解，溶解后千万不要放置在冰上）；

b、配制140 μL重亚硫酸盐转化反应液，具体为：

DNA solution(1ng~2ug)，10 μL；

Rnase-free water，10μL；

Bisulfite Mix，85μL；

DNA Protect Buffer，35μL；

混匀反应液后，置于室温（15~25℃）条件下以充分混匀；

需要说明的是，DNA Protect Buffer加入后，溶液会从绿变蓝，此时表明混匀充分且PH值正确；

c、将上述混匀的反应液置于进行重亚硫酸盐转化DNA反应，反应大约5h（整个反应过程不要超过6h）；具体反应过程为：

变性，95℃、5min；保温孵化，60℃、25min；变性，95℃、5min；保温孵化，60℃、85min；变性，95℃、5min；保温孵化，60℃、175min；保存，20℃、30min。

需要说明的是，重亚硫酸盐转化DNA后，转变后DNA可以保存在PCR仪中，不会有性能损失。

（C）纯化重亚硫酸盐转化的DNA，具体为：

将步骤（B）中反应完全的反应液转移到新的1.5mL离心管中(沉淀不影响后续实验，但尽量不要沉淀)；加560μL Buffer BL（含有10μg/mL Carrier RNA），涡旋并瞬时离心；

吸全部混合液于吸附柱中，12000g离心1min，倒掉收集液；

向吸附柱中加入500μL Buffer BW，12000g离心1min，倒掉收集液；

向吸附柱中加入500μL Buffer BD，室温（15~25℃）孵育15min，盖好盖子，12000g离心1min，倒掉收集液；

向吸附柱中加入500μL Buffer BW，12000g离心1min，倒掉收集液；重复此步骤一次；

将吸附柱放入新的2mL收集管中，12000g离心1min，去掉残余液体；

将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，56℃孵育5min，以便让残余液体蒸发；

向吸附柱的滤膜中加入20μL Buffer EB，15000g离心1min洗脱DNA，洗脱的DNA用于后续实验或保存于-20℃备用。

（3）PCR扩增，转化、筛选，并进行测序，以便对碱基是否发生了甲基化进行判定，具体过程为：

首先设计特异引物，以步骤（2）中洗脱的DNA为模板，进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

正向引物F：5’-ATTTTTTGAGGAATTTTATATTTGGTT-3’，

反向引物R：5’-ATCCGTTTCAATTAAATCTTCCA-3’；

10μL 的PCR扩增体系设计如下：

25mM Mgcl₂，1μL；

10×Maxima Hot Start Taq buffer，1μL；

Maxima Hot start Taq DNA Polymerase，0.1μL；

2.5mM dNTP mix，1μL；

正向引物F，0.2μL；

反向引物R，0.2μL；

步骤（2）中洗脱DNA（Template DNA），1μL；

ddH₂O，5.5μL；

PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延长1min，30个循环；72℃后延伸10min。

对PCR扩增产物进行电泳检测（胶浓度为1.2%），目标条带约300bp，切取含有目标条带的胶块于2mL离心管中，利用天根公司的胶回收试剂盒进行PCR产物的回收。回收的PCR产物构建到pMD18-T载体上（Fermentas公司），10μL连接体系如下：

pMD18-T Vector，1μL；

Solution I，5μL；

回收产物， 4μL；

16℃连接3小时

将连接产物转化大肠杆菌DH5α中，涂布于固体LB筛选培养基（Amp抗性，浓度为100mg/mL），放于37℃恒温培养箱中培养14h。挑取单克隆并送生工生物工程（上海）进行片段测序。

测序结果表明：郑麦366和郑麦004的启动子pTaWG04碱基序列完全相同（测序结果如序列表SEQ ID NO.1所示），其上游-726bp到-756bp处基因碱基序列具体为（如图1A所示）：

郑麦366（郑麦004）： -756 TTGCACACGGTGTATCAAATACAATGACGCA -726。

但基于上述甲基化检测结果表明：小麦品种郑麦366中γ-醇溶蛋白TaWG04基因的启动子pTaWG04上游的区段TTGCACACGGTGTATCAAATACAATGACGCA（-756bp ~-726bp）中可以看出，在-749、-735、-727、-729位置上C均未发生变化，表明在这四个位置上出现甲基化现象，但序列比对发现-749、-729在郑麦004中没有发生甲基化，（如图2所示），而正是由于这一甲基化修饰的差异，抑制了γ-醇溶蛋白TaWG04在郑麦366中的表达（如图1所示）。

同郑麦366一样，发明人进一步对西农979、新麦26、郑麦9023和济麦20中的启动子pTaWG04进行了甲基化特异PCR和测序分析，结果如图3所示。从图3A中可以基本判定，这些品种的启动子序列是相同的，但从图3B的测序结果可以看出，这些品种中的启动子的部分碱基同样发生了甲基化修饰现象。

实施例3

在实施例2检测结果基础上，为进一步验证碱基的甲基化修饰是唯一的影响γ-醇溶蛋白TaWG04表达的原因，因而有必要就甲基化碱基重新去甲基化，同时检测去甲基化后γ-醇溶蛋白TaWG04的表达情况，如果检测结果表明，去甲基化后，γ-醇溶蛋白TaWG04的表达量得到了明显提高（或者说表达量得到了恢复），那么即可认为启动子pTaWG04中部分碱基的甲基化是影响γ-醇溶蛋白TaWG04表达的唯一原因。实际结果也证明了，启动子pTaWG04中部分碱基的甲基化确实是唯一影响因素。下面就相关实验过程简要介绍如下。

（一）甲基化的启动子pTaWG04中部分碱基的去甲基化

利用去甲基化试剂（5-Aza-2′-deoxycytidine ，Sigma公司）分别对郑麦366、西农979、新麦26、郑麦9023和济麦20进行处理，具体的去甲基化实验过程为：

1、取12mg的5-Aza-2′-deoxycytidine（5-氮杂-2’-脱氧胞苷）试剂加入到50mL无菌水中溶解，配制成1mM 的溶液备用；

2、将12.1g 的Tris溶解到无菌水中，用Hcl调节pH到7.5，定容至100mL，配制成1M Tris-Hcl（pH 7.5）；

3、制备用于小麦种子样品处理的去甲基化试剂缓冲液，其对照组与实验组缓冲液的配置方案如下：

；

4、将小麦种子消毒灭菌后，用上述实验试剂分别处理，发芽后，移入温室种植，具体过程为：

首先，分别取不同品种的小麦种子，分别进行消毒灭菌，具体灭菌程序为：70%酒精浸泡1min，然后洗涤2-3次；30% H₂O₂浸泡5min，再洗涤3-5次；

其次，将种子晾干后，置于加有一层滤纸的培养皿上，加入2mL无菌水， 37℃培养16h；

然后，将培养后的种子分别置于加有一层滤纸的新培养皿上，标注为A（对照组）和B（实验组），向A（对照组）加入2mL A缓冲液，25℃、黑暗培养48h，向B（实验组）加入2mL B缓冲液，25℃、黑暗培养48h；

最后，待种子发芽后移入温室种植，培育条件如下：

光周期为16 小时光照和8 小时黑暗，光照强度500μmol/m²/s，苗期光照时温度为20℃、黑暗时温度为15℃，孕穗及灌浆期光照时温度为30℃、黑暗时温度为20℃。

（二）利用实时定量荧光PCR对γ-醇溶蛋白TaWG04的表达量进行检测

分别采集上述去甲基化试剂处理后的郑麦366、西农979、新麦26、郑麦9023和济麦20小麦成熟种子，提取种子RNA并反转录为cDNA，利用实时定量荧光PCR（qPCR试剂盒，TOYOBO公司）技术对γ-醇溶蛋白TaWG04的表达量进行检测，具体检测过程如下。

（1）首先提取RNA（RNA提取试剂盒），并反转录为cDNA（cDNA第一条链合成试剂盒），具体操作过程为：

（2）以Actin作为内参基因，设计特异性引物，以上述所制备cDNA为模板，进行Real time PCR分析；

所用定量引物设计为：

TaWG04-F：5’- TGCATGTCCCATCTGATTGC-3’，

TaWG04-R：5’-TTTCCATTGCTACATCGATGGT-3’；

Actin-F:：5’- GGCCCTTGCTCCTAGCAGTA-3’，

Actin-R：5’- CCGGGACCAGACTCATCGTA-3’；

Real time PCR的20μL反应体系设计如下：

cDNA 模板，60ng/μL、8.4μL；

TaWG04-F，10μM、0.8μL；

TaWG04-R，10μM、0.8μL；

SYBR Green Real-time PCR Master Mix，10μL；

Real time PCR 扩增程序如下为：95℃、2min (1个循环)；95℃、10s，60℃、10s，72℃、30s (40个循环)；95℃、10s (1个循环)；65℃至95 ℃ 5s。

最后，依照2^{−ΔΔ Ct}方法，利用Bio-Rad CFX Manager软件分析Real-time PCR 的结果。根据表达量均值±SEM作图。

结果如图4所示。从Real time PCR结果可以看出，去甲基化试剂处理后的郑麦366、西农979、新麦26、郑麦9023和济麦20中γ-醇溶蛋白TaWG04的表达量明显提高。

综上所述，通过一系列的甲基化和去甲基化实验，可以认为，启动子pTaWG04中部分碱基的甲基化是唯一影响γ-醇溶蛋白TaWG04表达量的影响因素。基于此特性，可为小麦品种改良奠定良好的理论基础和应用基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院小麦研究所

<120> 一种小麦γ-醇溶蛋白启动子区域甲基化的检测方法

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1571

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

tagatcccct gttgtaattt atcaaaaatt tatacacaag ctgcctttcc ataatttgaa 60

acattgtact ttctacttgc ctgcaggaag aactcttttg ttatggaccc ccttatctgg 120

cgaatagtcg ccaggagggg gtggcatttg cgaatgattc gctggcagtt ttagtttgag 180

ggatggaagt ttacatcagg gcgacatgac aatttctttt tgagaaggca aattgttgtt 240

ttaaataggc atcgtttgat cttgtctcgg aaccgaaact gccatcgaaa gagtttcgtt 300

tgccacctct ctcccagcaa acgattgcca attatgatta ccgtttgtta tatgcatgaa 360

ctgtgcgtct acagttggcg gcagcgaggt tgaggagacc ggtgtcatcg gcagcggctt 420

cagccggtgg aggcgtccta tggttgacgg ccgtgctcct tcctgctcga gaagagaagt 480

gagagggtgg tgagaggtga agagagcagg aggcggcagc ctggtgctgc tgcgggtcgt 540

agtaggagcc aaggcggcgg tgctgggtgg ctcgggctgt tatgcgggcg cgcgagcgac 600

accaagccct caacaaccgt gtccgtttca gttgggtctt ccatgttggg tacactggtg 660

gtgtccggct ctccgtctgc gtccattgtc cgttttggcg acccaaacgg acaaaaagcg 720

gacaaaaatt cgtgtccgtt tgagtcattg cgttgaagtt ggccttatgc tattccacag 780

tatactcaac gcactctaat tcacattgca tgctattaca tgcgtcattg tatttgatac 840

accgtgtgca atattttttt tctggtgaca atatatctac tatcgaacca agtataaagt 900

tcctcaaagg gtttaatatc atgttcatgg tgttcccgcg gaaatgcatg ggaatcatct 960

agtgtctatt aacaactata cgacattact aacattggca taaaaaaaag aattgatgag 1020

tcatgtatgc ttgttcatct taccatcata ttacacaaaa ctacgaagtt agttcagaaa 1080

gaaatagtct agaacaatct tcatattaat agtatgatct atcttaacaa cgccaagcaa 1140

gactataaac ttagttcccg acaagctatg ccaacctaga tgtgcctaac aacttgcaga 1200

acattacaaa cttagtttta gaaaggggtg taatatagat aagtgtttcg catgtaaaat 1260

gaatatgatg agtcattacg attatcaagc tttcctggca ctccatggat gtgtgctgca 1320

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acataccaaa ggatcagttt gataagagta gaggaacttt acaagaaagc aaatgtgaag 1440

acgaaaagaa atcatttcat ggcagctata aatagccata cgccatgaag acccccttcc 1500

atcatccatc cttcagaaat ttggagcaca agcatccata ataaacaatc aagagtaacc 1560

acaaattcac c 1571