专利名称：在干果的开裂区中表达的启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子，它允许一种相关的基因在干果开裂区(dehiscence zone)的 细胞中的特异性表达。
背景技术：
在进化过程中，各种植物已经为散播其种子建立了不同的体系。对于具有千开裂果的 植物来说，包含在果实中的种子是在成熟时所述果实的自发的张开后散播的。这种张开通 过一个或多个开裂区而发生。
一个开裂区包括在两个区域(以下称为边缘(margin))的细胞之间的一个非木质化的 细胞的区域(以下称为破裂区)，这些细胞在果实成熟的过程中变为木质化；由这种木质 化作用引发的应力致使相邻的破裂区裂开。在细胞壁中的水解酶也可能参与了开裂区的破 裂。
存在着不同类型的干开裂果。特别要提及的是荚果和长角果，它们分别属于豆科 (Fabaceae)和十字花科(Brassicaceae),这两科包括许多具有农学价值的植物。
荚果是一种源自单一心皮的干开裂果，该单一心皮通过胎座边缘上的一个缝而闭合； 荚果通过两个开裂区张开， 一个开裂区位于该胎座缝处而另一个位于心皮的中隔(median rib)处。
长角果是一种源自两个心皮(也称为瓣(valve))的干开裂果，这些心皮在其边缘处 结合在一起并被一个间隔物(胎座框)分开。开裂区沿着瓣和胎座框之间的连接处定位。 每个开裂区包含一个破裂区，该破裂区一方面以瓣边缘的木质化的细胞为界，而另一方面 以胎座框的木质化的细胞为界。在这个区域的撕裂导致这些瓣和胎座框的分离以及长角果 的张开。
图1表示拟南芥的一个长角果的横切面，表明瓣和胎座框的位置；破裂区(zR)的位 置以及瓣边缘的木质化的细胞(CL)的位置也在图的左侧部分标注。
在果实达到成熟时发生的自发开裂在大量作物植物例如油菜或大豆中引发了不同的 问题。
自发开裂的主要的不利后果是产量的一个相当大的损失。这是因为在长角果张开时一
3些种子落到地上并因此在收割机经过时没有收获，这导致了不仅是产量的一个相当大的损 失(从10%到25%)，而且还有再生长问题，这损害轮作。此外，荚果或长角果不开裂也 使之有可能在一些植物例如大豆或滨豆中减少被某些害虫或疾病侵染(ROBERTS et al， A腿ls of Botany， 86, 223-235, 2000)。
已经提出几种方法以克服由自发性开裂引起的问题。某些涉及耕作的实践，例如改善 收割机。其他方法是基于寻找在成熟时有更少的长角果开裂的品种。例如，已经对油菜提 出这种方法。因为在用于产油而种植的欧洲油菜(^ra^/ca "a/w^品种中关于这种特性存在 很少的遗传变异，所以已经尝试利用芜青rBra^/c" ra;^J渗入一种或多种负责减少长角 果开裂的基因，在芜青中对于这种特性的遗传变异更大。然而，人们观察到同时渗入了其 他一些可能不利的特性。
目前引起极大兴趣的一种方法在于通过基因工程来修饰与干果的开裂有关(并且特别 是与长角果的开裂有关)的基因的表达，以便控制所述开裂。
已经识别了与长角果开裂有关的不同的基因(关于综述，参照例如，FERRANDIZ, J of Exp. Botany 53, 377, 2031-2038, 2002)。
在许多情况中，它们是与开裂区的细胞分化有关的基因。在这个类别中，应提及例如 S/^r7E7 /^(90F / CWJ禾卩5T^r7^/ 尸/ (90/^ f57 2J基因，它们编码与毗连破裂区的 瓣的边缘的木质化有关的MADS-box转录因子(LILJEGREN et al Nature, 404: 766-770， 2000)。当使这些基因失活时，未观察到瓣的边缘的木质化或开裂区的形成。
在瓣中表达的/^L^TFMjL基因(Fw/)(它是另一个MADS-box转录因子)负向地控 制SW和脂的表达(FERRANDIZ et al., Science, 289: 436-438, 2000)。当它被过表达时， 观察到与这两个基因的失活所产生的表型相似的一种表型。相反地，JO4M0ra基因 正向地控制和幼2的表达。
J1C477"Z基因(Wc)是一种bHLH (碱性螺旋-环-螺旋)结构域蛋白，它使得发生 开裂区裂开的非木质化的区域能够特化(RAJANI and SUNDARESAN, Curr Biol 11, 1914-1922,2001)。在这个基因被失活的突变体中，这个非木质化的区域不存在，导致果实 不开裂。
T^/lLf/Mi^SS基因(i ; /)是一种与胎座框的安置有关的同源结构域基因(ROEDER et al., Curr Biol, 13, 1630-5, 2003)。另一种同源结构域转录因子/M^/Z/SC五AT 也已 知与开裂区的分化有关(LILJEGREN et al., Cell, 116， 843-53， 2004)。
另一类与开裂有关的基因包括对参与细胞壁水解酶进行编码的基因。例如，已经观察
4到与果胶降解有关的一种多聚半乳糖醛酸酶(PG)是在开裂区中表达(JENKINS etal., J. Exp. Botany 47, 1111-1115, 1996; PETERSEN et al., Plant Mol Biol, 31， 517-527, 1996)。
为了控制开裂，已经提出针对与这种开裂有关的不同基因的表达开展工作。 作为举例PCT申请WO 97/13865提出，为了推迟开裂，在开裂区的细胞中表达要么 是抑制细胞壁水解酶表达的一种RNA、要么是干扰新陈代谢(所述细胞的生理学或者发育) 的一种蛋白；PCT申请WO 01/79517提出通过抑制在开裂区中/^￡ ￡///1 6^^7基因的表达来 推迟开裂。
作用在一种基因的表达或者其产物的活性的一个常规的方法是在同一细胞中表达一 种外源DNA序列，该序列的转录或翻译产物取决于所考虑的应用而正向地或负向地干预所 述蛋白的表达或活性。作为举例，应提及所讨论的基因、或其同源物、或这种基因的表达 的一种激活物的过表达，或者，相反地，反义抑制技术、或通常用于调节靶基因的表达的 RNA干扰技术。
在许多情况下，优选的是把这种外源DNA序列的表达靶向于特定的细胞和特定的组 织，以避免对植物的其他功能的任何干扰。因此，为了对长角果的开裂起作用，人们希望 拥有对组成长角果并且具体是开裂区的不同细胞类型具有特异性的启动子。
发明内容
诸位发明人己经从拟南芥中分离出一种启动子，以下称为pDRQ39启动子，并且已经 在这种启动子的控制下表达了编码P-葡糖醛酸酶的w'W(GUS)报告基因。他们因此已经观察 到该报告基因的表达被限制于长角果瓣边缘的木质化的细胞。
这种pDRQ39启动子位于拟南芥的At2g27220基因的翻译起始密码子上游的一个361 bp 区域。这个区域的序列如下(SEQIDNO:l)。
CAGAATA
这条序列也在图2中列出，图中还指明可能与调控这个基因的表达有关的那些主要的 预测框。诸位发明人已经将对于获得在长角果边缘的木质化的细胞中的特异性表达必须的这 种启动子的部分局限在相对于At2g27220基因的翻译起始密码子的从-361位核苷酸到-201 位核苷酸的区域中(这些位置对应于序列SEQIDNO:l的1到161位)。
在本披露的上下文中，在参照由两个核酸的位置所限定的一个范围来定义一条序列 时，它被认为第一个标出位置的核苷酸是包括在这条序列中的，而第二个标出位置的核苷 酸不包括在这条序列中。
因此，范围从At2g27220基因的ATG上游的-361到-201位的序列如下(SEQ IDNO:2):
本发明的主题是一种分离的多核苷酸，它能够用于对邻接干开裂果的破裂区边缘的木 质化的细胞具有特异性的启动子的构建，该多核苷酸的特征在于
-它与序列SEQIDNO:2的多核昔酸具有至少80Q/q的同一性，优选为至少90%的同一 性，并且完全优选为至少95%的同一性；
-它包含具有序列TAGTT的模体，该模体部分重叠具有序列TTGAC的"Wbox"; 具有序列AAAG的"DOF"框；以及具有序列GATA的"GATAMybstl"框。
有利的是，在57i4rr五i 尸; ooF/和s/^rr^ /^ooF2以及/m^//zsc￡at基因的启
动子中也发现了该TAGTT模体，这些基因具有相似的组织表达特异性，因而提示这种模 体与在长角果瓣边缘的木质化的细胞中这些基因的耙向表达有关。
本发明的主题还在于对邻接干开裂果的破裂区边缘的木质化的细胞具有特异性的启 动子，其特征在于它包含如以上定义的根据本发明的多核苷酸。
"对邻接干开裂果的破裂区边缘的木质化的细胞具有特异性的启动子"的表述意指 一种启动子，该启动子能够在这些细胞中诱导一个表达水平，该水平比它在该植物其他组 织的细胞中诱导的表达水平高至少10倍，优选为至少20倍。
根据本发明的启动子的一种优选的实施方式，除了以上定义的那些框和模体外，它还 包括具有序列TGTCACA的"fruitbox"。有利地，根据本发明的启动子包含具有序列SEQ IDNO:l的多核苷酸。
根据本发明的启动子的另一种优选的实施方式，它是一种嵌合启动子，其中根据本发 明的多核苷酸与最小启动子组合。
在植物中发挥功能的嵌合启动子的构建本身是众所周知的；将一种最小启动子与根据 希望获得的表达特性(特异性，诱导性，表达水平)选择的异源性调控性元件组合。 一种最小启动子至少包含用于起始RNA聚合酶II转录的序列。例如， 一个最小启动子一般而 言除了包含一个转录起始位点外，还包含位于转录起始位点的上游大约20 bp到40 bp位 置的至少一个TATA框，和/或位于转录起始位点水平的至少一个INR (INitiatoR)元件。
通过将最小启动子与不同的顺式调控元件组合而得到的嵌合启动子的构建描述在例 如美国专利6555673，或另外在RUSHTON等人(Plant. Cell" 14, 749-762, 2002)，或 BHULLAR等人(Plant. Physiology" 132, 988-998, 2003)或DEABEAUJON等人(Plant Cell, 15,2514-2531,2003)的出版物中。
本发明的主题还在于根据本发明的一种启动子的用途，该用途是在邻接干开裂果的破 裂区边缘的木质化的细胞中特异性表达一种相关的多核苷酸。
本发明还包括
-重组表达盒，它除了根据本发明的启动子外还包含置于所述启动子的转录控制下的 相关的一条异源序列(或者允许所述相关的序列插入的一个或多个限制酶切位点)；
-通过将根据本发明的启动子或表达盒插入宿主载体中所产生的重组载体。
所述相关的序列具体可以是与干果(特别是长角果)的开裂有关的一个基因。它还可以 是用于调节与这种开裂有关的一个或多个基因的表达的多核苷酸；这种调节可以例如通过 反义抑制或共抑制、通过干扰性RNA (iRNA)的产生来实现。还有可能将希望对之评价 对开裂的影响的多核苷酸置于根据本发明的启动子的控制之下。
根据本发明的这些表达盒和重组载体当然还可以包含通常用于这种类型的构建物的 其他序列。常规地，将由本领域的普通技术人员具体根据标准(例如所选择的宿主细胞、 所考虑的转化方案等等)对这些其他的序列做出选择。
作为非限制性举例，应提及转录终止子，前导序列，增强子序列，聚腺苷酸化位点， 等等。这些序列对启动子的特异性没有任何影响，但是它们能够从定性地或定量地改善整 体的转录以及在适当情况下的翻译。
在通常用于表达盒和重组载体的构建的其他的序列中，还应提及用于以下转化以及用 于识别和/或选择被转化的细胞或有机体的序列。它们具体地可以是赋予这些细胞或有机体 一种可容易识别的表型的报告基因，或另外是选择性标记基因。
本发明的一个主题还在于一些细胞，所述细胞含有根据本发明的至少一种重组表达盒 或一种载体。它们可以是原核细胞或真核细胞。在原核细胞的情况中，它们具体可以是土 壤杆菌属，例如根瘤土壤杆菌04gra6""er/iwj fw附e/ac/em")或发根土壤杆菌(/lgra&a"en'w附 A/加ge朋"。在真核细胞的情况中，它们具体可以是植物细胞。本发明还包括转基因植物，这些植物在它们的基因组中包含至少一个拷贝的一种转基 因，该转基因含有根据本发明的表达盒。这个定义当然包括产生于原始基因转移的那些植 物的子代，条件是它们在其基因组中保存该转基因的至少一个拷贝。
有关的植物是所有那些产生干开裂果的植物，并且特别是十字花科植物，例如油菜， 或者是豆科植物，例如大豆，豌豆，豆(bean)等等。
从这些细胞或植物获得的植物材料(原生质体、愈伤组织、切条、种子等等)也是本 发明的主题的一部分。本发明还包括从根据本发明的这些植物获得的产物，具体是粗词料、 木材、叶、茎、根、花以及果实。
具体实施例方式
通过以下的进一步说明将更清楚地理解本发明，该说明提及阐明pDRQ39启动子的获 得及其用于表达一个异源基因的用途的非限制性实例。
实施例1:在AT2G27220基因的上游区域的不同片断的控制下一个报告基因的表达
从一个拟南芥的基因组DNA文库中获得位于At2g27220的ATG的5'端的大约1500 bp的一条序列。
通过GATEWAY 技术根据厂商的建议方法使用INVITROGEN试剂盒，将这条序列 的不同片断在编码GUS报告基因的序列的上游克隆进入pRlR2 GUS载体。使用的受体载 体pRlR2 GUS (BAUDRY et al. Plant J, 39， 366-380, 2004)含重组盒(recombination cassette) LR，这是编码来自大肠杆菌的P-葡糖醛酸酶的基因的编码序列和胭脂氨酸合酶基因的 nos-ter终止子。该载体还包含卡那抗性盒。
首先用包含重组位点Bl和B2的引物通过PCR扩增出启动子序列，并且然后将这些 启动子序列通过BP重组引入到入门载体(entry vector)中(pDONR 207， INVITROGEN)。 接着将含有所希望的片段的重组载体重组进入pRlR2 GUS载体以便产生用于转化植物的 二元载体。
所制备的构建物如下
-Pl:这个构建物包含从At2g27220基因的ATG上游的-1471位到-4位的全长1467 bp 的序列。用寡核苷酸pDRQ39-1500/pDRQ39REV扩增该DNA 。
-P2:这个构建物包含从At2g27220基因的ATG上游的-1158位到-4位的全长1154 bp 的序列。用寡核苷酸pDRQ39-1158/pDRQ39REV扩增该DNA。
-P3:这个构建物包含从At2g27220基因的ATG上游的-591位到-4位的全长587 bp的序列。用寡核苷酸pDRQ39-590/pDRQ39 REV扩增该DNA。
-P4:这个构建物包含从At2g27220基因的ATG上游的-360位到-4位的全长356 bp 的序列。用寡核苷酸pDRQ39-361/pDRQ39 REV扩增该DNA。
-P5:这个构建物包含从At2g27220基因的ATG上游的-201位到-4位的全长197 bp 的序列。用寡核苷酸pDRQ39-201/pDRQ39 REV扩增该DNA。
这些不同的构建物的界限示于图2中。
所使用的寡核苷酸表明如下(5'-3'方向，用粗体的序列对应于Gateway重组序列)； (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4)
pD卿9 -5卯GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTACATTTGCGACCACATT
(SEQ ID NO :5)
pDR(^39 -361: GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGTACATATTTTTCCCATTT
(SEQ ID NO:6)
pD卿9 -201: GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCCATAATTTGCTGCTCATC
(SEQ ID NO:7)
(SEQIDNO:8)
通过植物渗入(floral infiltration)的方法(BECHTOLD et al.， C.R. Acad. Sci., 316， 1194-1199, 1993)将这些不同的构建物转移进入生态型为Wassilewskija的拟南芥植物中。 将这些种子灭菌并将初级转化体在含有选择剂卡那霉素(100 mg/l)的MS培养基(Duchefa， M02 555，pH5.6)上进行选择。随后将所选的植物转移进入罐(pot)中并在玻璃下生长。 只将显示正常表型的能繁育的植物保留用于分析。
在Tl代和T2代的营养器官、长角果以及种子中寻找gus基因的表达。 通过一种组织化学测试的手段检测(3-葡糖醛酸酶活性，即通过检测由5-溴-4-氯-3-吲哚 -p-D-葡萄糖醛酸(X-gluc根据JEFFERSON等人描述的方案(Plant Mol. Biol. Report 5， 387-405,1987))的水解反应产生的蓝色显色。
gUS基因在营养器官中的表达
在体外对叶、玻璃下面的茎以及根进行分析。在那些非转化植物中没有检测到gus的 活性。在转化有P1、 P2、 P3、 P4和P5构建物的这些植物的情况下，在X-Gluc存在下孵 育后没有检测到活性。这些结果表明At2g27220启动子不允许gus基因在所测试的器官中 的表达。
9gUS基因在长角果和种子中的表达
为了确定在At2g27220启动子控制下GUS基因的表达位置，切割组织切片并通过光 子显微术进行观察。
对于P1、 P2、 P3或P4构建物，在长角果瓣边缘观察到大量的标记，而胚细胞、胎座 框细胞以及中果皮细胞未显示标记。对于P5构建物来说，未检测到标记，表明所述构建 物不再包含必需的的调控元件。
实例2: AT2G27220基因的启动子的结构分析
对At2g27220基因的启动子进行了分析以便寻找可能与控制表达有关的推定的调控模体。
将该启动子同拟南芥的57i47T￡7 /^0(9F /基因、S/^77^/ 尸7 0(9F 2基因(分别为 At3g58780， At2g42830)以及/^￡ ￡:///5(^7^7基因(Atlg00120)的启动子序列进行比较。
这个分析表明这些启动子共同存在一个5bp的模体(TAGTT)，并且这些启动子中不 存在在临近开裂区的细胞中表达的其他转录因子。
在pDRQ39启动子中所识别的其他推定的转录调控序列中，将具体指出以下这些 "DOF "框(ANAGISAWA and SCHMIDT, PlanU 17, 209-214 1999); " GATA Mybst 1 "框 (EAKLE et al., Plant Mol Biol. 50, 43-57 2002); "W"框(HEN et al., Plant Cell 14, 559-574， 2002)，它位于-361位和-201位之间。"Fruit box" (TGTCACA motif; YAMAGATA et al., J Biol Chem. 277, 11582-11590, 2002)也在位于-201位与翻译起始位点之间的区域中被识 别。这个框在调节位于-361和-201之间的那些框时可能起一定作用。
At2g27220基因的翻译起始密码子上游的1467bp序列示于图2。该翻译起始位点用粗 体和下划线表示。"DOF" 、 "GATA" 、 "W"框以及"Fruitbox"用实线框入。TAGTT 模体用虚线框入。
10
权利要求
1.能够用于构建对邻接一种干开裂果的破裂区边缘的木质化的细胞具有特异性的启动子的分离的多核苷酸，该多核苷酸的特征在于-它与序列SEQ ID NO2的多核苷酸具有至少80％的同一性，优选为至少90％的同一性，并且完全优选为至少95％的同一性；-它包含具有序列TAGTT的模体，该模体部分重叠具有序列TTGAC的“Wbox”；具有序列AAAG的“DOF”框；以及具有序列GATA的“GATA”框。
2. 分离的启动子，该启动子允许在邻接干开裂果的破裂区的边缘的木质化细胞中的相 关的多核苷酸的特异性表达，其特征在于它包含根据权利要求1所述的多核苷酸。
3. 如权利要求2所述的启动子，特征在于它包含多核苷酸序列SEQIDNO: 1。
4. 嵌合启动子，包含根据权利要求1的多核苷酸，该多核苷酸与最小启动子组合。
5. 如权利要求1至4中的任一项所述的启动子在邻接干开裂果的破裂区的边缘的木质 化的细胞中用于特异地表达相关的多核苷酸的用途。
6. 重组表达盒，其特征在于它包含根据权利要求2至4中的任一项所述的启动子，以 及置于所述启动子的转录控制下的相关的基因。
7. 重组载体，包含根据权利要求6所述的表达盒。
8. 宿主细胞，它被转化为具有根据权利要求6所述的表达盒。
9. 如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于它是植物细胞。
10. 转基因植物，包含至少一种转基因，该转基因包含根据权利要求6所述的表达盒。
11. 如权利要求IO所述的转基因植物，其特征在于它是十字花科(Brassicaceae)的一 种植物或一种十字花(cruciferous)植物。
全文摘要
本发明涉及对干果的开裂区细胞具有特异性的启动子，并涉及这种启动子用于在这种开裂区中特异性表达所相关的基因的用途。
文档编号C12N15/82GK101495638SQ200780025229
公开日2009年7月29日 申请日期2007年7月6日 优先权日2006年7月6日
发明者卢瓦克·莱皮尼克, 贝特朗·迪布勒克 申请人:法国植物基因组研究计划-华莱