本发明属于医疗检测用品技术领域，具体涉及一种用于PARP抑制剂药物敏感诊断的引物组合及检测试剂盒。
背景技术：
PARP抑制剂通过抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞发生凋亡，从而可增强放疗以及烷化剂和铂类药物化疗的疗效。如olaparib、rucaparib、niraparib和veliparib都属于PARP抑制剂。
除了可提高化疗药的疗效外，PARP抑制剂被FDA批准用于治疗由于BRCA1、BRCA2突变引起的妇科肿瘤患者。即PARP抑制剂作为单药对BRCA突变的患者也有效：PARP和BRCA是细胞内负责修复DNA突变的两个主要基因，保护乳腺、卵巢正常发挥作用时基因信息的稳定，从而维持这两个组织的稳定。使用PARP抑制剂(如niraparib)，BRCA突变癌细胞会彻底无法修复DNA，因此崩溃，而正常细胞因为还有BRCA存在，没有PARP仍然能修复DNA，只是效果差一些，但能够存活。这就是PARP抑制剂作为靶向药物，选择性杀死BRCA突变癌细胞的原因。
由于上述的原因，目前的用于PARP抑制剂药物敏感诊断的检测试剂盒往往只检测患者的BRCA是否突变，对其他基因位点的突变不进行检测，而PARP抑制剂能够治疗多种基因位点突变引起的肿瘤，如TP53、PTEN和RB1等，造成现有的检测试剂盒筛选出的患者数目偏少，PARP抑制剂药物有效性的检出率低，使用范围有限等问题。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种用于PARP抑制剂药物敏感诊断的引物组合及检测试剂盒。所述引物组合和含有该引物组合的检测试剂盒不止能够检测出BRCA1和BRCA2基因的突变，还能够检测出TP53、PTEN和RB1基因的突变，增大了筛选患者的范围和数量，以便能够更好地指导肿瘤患者使用PARP抑制剂。
本发明所采用的技术方案为，一种用于PARP抑制剂药物敏感诊断的引物组合，包括以下引物组：M1775K引物组、P151T引物组、G129E引物组、C712R引物组和Q569K引物组，所述M1775K引物组包括M1775K-wild-F引物、M1775K-wild-R引物、M1775K-mutant-F引物和M1775K-mutant-R引物；所述P151T引物组包括P151T-wild-F引物、P151T-wild-R引物、P151T-mutant-F引物和P151T-mutant-R引物；所述G129E引物组包括G129E-wild-F引物、G129E-wild-R引物、G129E-mutant-F引物和G129E-mutant-R引物；所述C712R引物组包括C712R-wild-F引物、C712R-wild-R引物、C712R-mutant-F引物和C712R-mutant-R引物；所述Q569K引物组包括Q569K-wild-F引物、Q569K-wild-R引物、Q569K-mutant-F引物和Q569K-mutant-R引物；所述M1775K-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述M1775K-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述M1775K-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：3所示，所述M1775K-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：4所示，所述P151T-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：5所示，所述P151T-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：6所示，所述P151T-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：7所示，所述P151T-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：8所示，所述G129E-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：9所示，所述G129E-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：10所示，所述G129E-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：11所示，所述G129E-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：12所示，所述C712R-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：13所示，所述C712R-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：14所示，所述C712R-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：15所示，所述C712R-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：16所示，所述Q569K-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：17所示，所述Q569K-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：18所示，所述Q569K-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：19所示，所述Q569K-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：20所示。
SEQ ID NO：1的序列为：TTGCTATGGGCCCTTCACCAACADDT；
SEQ ID NO：2的序列为：TCTCTCGCCACGCTCCCTCCGCCCAGGCTCTTACCTGTGGGCDDA；
SEQ ID NO：3的序列为：TTGCTATGGGCCCTTCACCAACADDA；
SEQ ID NO：4的序列为：CTCACTGTAGCACGTCGACCCCCAGGCTCTTACCTGTGGGCDDT；
SEQ ID NO：5的序列为：GTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACADDC；
SEQ ID NO：6的序列为：TCTCTCGCCACGCTCCCTCCGACGCGGGTGCCGGGCGGGGDDG；
SEQ ID NO：7的序列为：GTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACADDA；
SEQ ID NO：8的序列为：CTCACTGTAGCACGTCGACCACGCGGGTGCCGGGCGGGGDDT；
SEQ ID NO：9的序列为：GCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGGDDG
SEQ ID NO：10的序列为：TCTCTCGCCACGCTCCCTCCGTATCATTACACCAGTTCGTDDC；
SEQ ID NO：11的序列为：GCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGGDDA；
SEQ ID NO：12的序列为：CTCACTGTAGCACGTCGACCTATCATTACACCAGTTCGTDDT；
SEQ ID NO：13的序列为：TATGATGTGTTCCATGTATGGCATADDT；
SEQ ID NO：14的序列为：TCTCTCGCCACGCTCCCTCCGGTCTATATTCTTCACTTTGCDDA；
SEQ ID NO：15的序列为：TATGATGTGTTCCATGTATGGCATADDC；
SEQ ID NO：16的序列为：CTCACTGTAGCACGTCGACCGTCTATATTCTTCACTTTGCDDG；
SEQ ID NO：17的序列为：TGGAAGCTGGCCAGCCACCACCACADDC；
SEQ ID NO：18的序列为：TCTCTCGCCACGCTCCCTCCGCTTCAAAGCTACAGAATTCTDDG；
SEQ ID NO：19的序列为：TGGAAGCTGGCCAGCCACCACCACADDA；
SEQ ID NO：20的序列为：CTCACTGTAGCACGTCGACCCTTCAAAGCTACAGAATTCTDDT。
其中，所述M1775K引物组用于检测BRCA1的基因突变，M1775K为BRCA1基因上的位点代号；P151T引物组用于检测TP53的基因突变，P151T为TP53基因上的位点代号；G129E引物组用于检测PTEN的基因突变，G129E为PTEN基因上的位点代号；C712R引物组用于检测RB1的基因突变，C712R为RB1基因上的位点代号；Q569K引物组用于检测BRCA2的基因突变，Q569K为BRCA2基因上的位点代号。
以上五组引物组共同作用，能够同时检出BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN和RB1基因突变的情况，增加PARP抑制剂药物有效性的检出率，让更多的肿瘤患者受益于靶向特异性药物。
采用双脱氧核糖核苷酸作为引物的末端碱基，只有在与模板完全匹配的情况下，才能被切除，启动扩增反应。而不匹配的情况下，不能匹配切除，从而扩大了差异识别的准确性。为了提高PCR的准确性和识别的特异性，ARMS法在3端或附近人为地增加错配的碱基，末端不能匹配的引物，不能进行扩增反应。本发明中，在引物序列中不引入错配序列，仅通过单一核苷酸实现单一位点的区分，增加了检测区域的特异性。本发明除通过碱基适配性识别以外，错误的碱基是双脱氧碱基，不具有可以形成二酯键的能力。本发明采用的酶具有3-5外切酶活性，如果引物中的双脱氧碱基与模板链相匹配，经过切除后，再行扩增，使扩增反应得以进行。将识别、阻碍更有效的结合在一起。仅仅在末端而不是在末端附近引入错配碱基，增加了序列特异性。利用变异脱氧核糖核苷酸聚合酶切除可以配对的阻隔核糖核苷酸，而不能进行配对的阻隔核糠核苷酸因不能进行配对不能进行扩增反应，实现序列校正放大。
本发明还提供了一种含有所述引物组合的检测试剂盒，包括反应缓冲液、dNTP混合物、聚合酶、第一探针和第二探针，所述第一探针的序列如SEQ ID NO：21所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO：22所示；所述第一探针的首端连接有FAM、末端连接有Dabcyl进行修饰；所述第二探针的首端连接有HEX、末端连接有Dabcyl进行修饰。
SEQ ID NO：21的序列为：CGGAGGTCTCTCGCCACGCTCCCTCCG；
SEQ ID NO：22的序列为：CCGGTCTCACTGTAGCACGTCGACCGG。
如实施例3所示，本发明提供了一种使用所述检测试剂盒同时检出BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN和RB1基因突变的方法及结果判定。
本发明采用引物识别指示系统，在引物中增加探针识别序列，这个序列不是模板上的序列，也不是扩增靶区序列，使得探针的使用具有通用性，降低了探针设计的难度。与蝎形ARMS指示系统不同。而本发明采用的是识别引物的探针，增加了探针引物的通用性。另外，本发明采用双引物阻滞法，上下游引物均设计了阻隔核苷酸，增加了序列检测的特异性。
另外，常规PCR、ARMS检测法，在可变区段设计最优引物，不同的检测引物，产物长度一般在100至数百个碱基因对，而本方法由于引物设计的产品限制65-85碱基对之间，降低了反应产物不一致所产生的实验误差。
所述反应缓冲液中含有的组分及浓度如下：500mM的Tris-HCl、200mM的KCl、200mM(NH4)2SO4和20mM的MgSO4。
所述dNTP混合物的浓度为0.25mM。
所述聚合酶为Klenow聚合酶。常规情况下，链式扩增反应采用的是II型DNA聚合酶(如Pfu)，可以用来进行采用少环核阻隔的单向或双向焦磷酸化反应，但是不能进行双脱氧核甘酸阻断的焦磷酸解反应，所述试剂盒采用一新型酶类，这一酶催化对采用双脱氧核糖核苷酸作为末端阻断法进行序列的特异性识别。
为进一步增加检测的准确性，方便实验人员对照使用，优选的技术方案为：还包括阳性对照物和阴性对照物。所述阳性对照物包括含有BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN和RB1突变序列的质粒和含有BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN和RB1野生序列的质粒，所述阴性对照为不含有BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN和RB1突变序列和野生序列的质粒。
当然，所述阴性对照物也可为无模板对照或无引物对照，所述无模板对照中用等容积超纯水替代DNA模板；所述无引物对照中用等体积超纯水替代反应用引物。
根据本发明的一个实施例，使用PBR322质粒作为阳性对照物和阴性对照物中的质粒载体，且在阳性对照物中含突变序列的质粒与含野生序列的质粒的摩尔比为1:1。
本发明提供了一种用于PARP抑制剂药物敏感诊断的引物组合及检测试剂盒。所述引物组合和含有该引物组合的检测试剂盒不止能够检测出BRCA1和BRCA2基因的突变，还能够检测出TP53、PTEN和RB1基因的突变，增大了筛选患者的范围和数量，以便能够更好地指导肿瘤患者使用PARP抑制剂。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种用于PARP抑制剂药物敏感诊断的引物组合，包括以下引物组：M1775K引物组、P151T引物组、G129E引物组、C712R引物组和Q569K引物组，所述M1775K引物组包括M1775K-wild-F引物、M1775K-wild-R引物、M1775K-mutant-F引物和M1775K-mutant-R引物；所述P151T引物组包括P151T-wild-F引物、P151T-wild-R引物、P151T-mutant-F引物和P151T-mutant-R引物；所述G129E引物组包括G129E-wild-F引物、G129E-wild-R引物、G129E-mutant-F引物和G129E-mutant-R引物；所述C712R引物组包括C712R-wild-F引物、C712R-wild-R引物、C712R-mutant-F引物和C712R-mutant-R引物；所述Q569K引物组包括Q569K-wild-F引物、Q569K-wild-R引物、Q569K-mutant-F引物和Q569K-mutant-R引物；所述M1775K-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述M1775K-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述M1775K-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：3所示，所述M1775K-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：4所示，所述P151T-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：5所示，所述P151T-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：6所示，所述P151T-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：7所示，所述P151T-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：8所示，所述G129E-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：9所示，所述G129E-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：10所示，所述G129E-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：11所示，所述G129E-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：12所示，所述C712R-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：13所示，所述C712R-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：14所示，所述C712R-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：15所示，所述C712R-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：16所示，所述Q569K-wild-F引物的序列如SEQ ID NO：17所示，所述Q569K-wild-R引物的序列如SEQ ID NO：18所示，所述Q569K-mutant-F引物的序列如SEQ ID NO：19所示，所述Q569K-mutant-R引物的序列如SEQ ID NO：20所示。
实施例2
一种含有实施例1所述引物组合的检测试剂盒，具体成分如下表所示：
表1：检测试剂盒成分表
实施例3
本实施例为实施例2中检测试剂盒使用方法和实例结果判定。
一种使用所述检测试剂盒同时检出BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN和RB1基因突变的方法，包括以下步骤：
1、取肿瘤组织提取基因组DNA，将所提取的DNA样品用超纯水溶解，调整终浓度为500ng/ul
2、根据检测的样本量按以下公式配备反应混合液，其中N为样本数
按以上次序，在冰上将各组分按比例加入到加样槽中，混匀制成测试工作液
3、在荧光定量PCR的96孔板，分别在每一列的A-G孔中加入48ul测试工作液，A-G孔中分别加入1ul 6A，6B，6C，6D，6E，6F，6G溶液；
4、在第一列的A-E孔中5个孔中，分别加入1ul 6F管中的阳性对照样本，
5、然后在1F，2F孔中加入1ul超纯水作为无引物对照。
6、在1G，2G孔中加入阴性对照溶液1ul作为无模板对照。
7、如果有多个样本，在相应的列中每一列的A-G孔中加入48ul测试工作液，A-E孔中分别加入1ul 6A，6B，6C，6D，6E，6F，6G溶液；
8、在样品列的A-E孔中分别加入1ul DNA样品。
9、用透明膜封好
10、震荡混匀
11、在4度下，1500RPM离心5分钟
12、用ABI 7900HT进行PCR反应。
13、PCR反应中温度循环的设置：
回到第二步进行循环：共循环：50次
结果判定
1、所有检测样品的1A-1E管，FAM和HEX的CT值均低于30，同时F管、G管中的CTFAM、CTHEX值均高于35时，表明阳性和阴性对照质控合格，实验数据可信；
2、突变型和野生型比例判定：突变型：野生型＝1:2(CTHEX-CTFAM)，CTHEX，CTFAM是扩增反应的CT值。
3、当样品中的A、B、C、D、E管中有任何一管中的药物敏感细胞含量高于1％时，检测为阳性，患者适于使用PARP抑制剂。当样品中的A、B、C、D、E管中有没有任何一管中的药物敏感细胞含量高于1％时，检测为阴性，患者不适于使用PARP抑制剂。
4、检测结果判定示例
表2：实验结果表
从以上实例能够看出，本发明提供的用于PARP抑制剂药物敏感诊断的引物组合及检测试剂盒能够同时检出BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN和RB1基因突变的情况，增加PARP抑制剂药物有效性的检出率，让更多的肿瘤患者受益于靶向特异性药物。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 佳学基因医学技术（北京）有限公司
<120> 一种用于PARP抑制剂药物敏感诊断的引物组合及检测试剂盒
<130> 2010
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<170> PatentIn version 3.3
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