一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白及其应用的制作方法

本发明属于基因工程疫苗
技术领域：
，具体涉及一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白、基于该丙型肝炎病毒融合抗原蛋白的丙型肝炎病毒基因工程疫苗及其制备方法与用途。
背景技术：
：丙型肝炎病毒是丙型肝炎的致病因子，该病毒感染的世界总人数超过1.7亿，我国感染人数超过4000万。大多数丙型肝炎病毒感染者为持续性感染，进而引起慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。据报道，全球40％的慢性肝病和80％的肝细胞癌与丙型肝炎病毒有关，每年全球用于丙型肝炎治疗费用超过1000亿美元。现有的治疗药物只对部分丙型肝炎肝病毒感染者有效，且治疗时间长，成本高和有副作用。疫苗是防治，特别是预防病毒性疾病的一种极其经济、简单和有效的手段。近年来，针对丙型肝炎病毒的疫苗包括灭活疫苗，重组蛋白疫苗，DNA疫苗，融合抗原疫苗等研制工作虽然取得了一些进展。但是，迄今为止，尚没有一种疫苗已经完成临床试验，并能够应用于人类的丙型肝炎预防和治疗(AbdelwahabandAhmed,2016)。丙型肝炎病毒基因组具有高变异性，采取多种方式逃避宿主免疫反应。自愈的丙肝患者和黑猩猩在急性期可检测到高滴度的多种中和抗体、强烈而广泛的T细胞免疫应答。而进入到慢性期的丙肝感染者和黑猩猩则产生中和抗体较晚、细胞免疫应答微弱且特异性过于集中。因此，成功的丙型肝炎病毒疫苗应该诱导产生高滴度的多种中和抗体和强烈而广泛的T细胞免疫应答(Torresietal.,2011)。基因工程融合抗原疫苗同时携带多个抗原表位，一方面可以避免传统的灭活或减毒疫苗存在的生物危害性和毒力返祖等问题,另一方面因为也可以诱导产生多种中和抗体应答、以及广泛的细胞免疫应答。因此，重组基因工程融合抗原疫苗成为获得成功的丙型肝炎病毒病毒疫苗的一个热点和发展方向。现有技术中尚没有临床可用的丙肝疫苗，本专利提供了一种新的植物生产的丙型肝炎病毒融合抗原蛋白，该融合抗原蛋白具有较强的中和抗体诱导能力，与丙肝病人血清有广泛反应性，体外可抑制丙型肝炎病毒感染，为丙肝疫苗或诊断试剂盒提供了新的解决方案。与本发明有关的
背景技术：
如下文献所示：Abdelwahab,K.S.andAhmed,S.Z.(2016)StatusofhepatitisCvirusvaccination:Recentupdate.WorldJGastroenterol22(2),862-73.Baulcombe,D.C.,Chapman,S.andSanta,C.S.(1995)Jellyfishgreenfluorescentproteinasareporterforvirusinfections.PlantJ7(6),1045-53.Kong,L.,Fujimoto,A.,Nakamura,M.,Aoyagi,H.,Matsuda,M.,Watashi,K.,Suzuki,R.,Arita,M.,Yamagoe,S.,Dohmae,N.,Suzuki,T.,Sakamaki,Y.,Ichinose,S.,Suzuki,T.,Wakita,T.andAizaki,H.(2016)ProlactinRegulatoryElementBindingProteinIsInvolvedinHepatitisCVirusReplicationbyInteractionwithNS4B.JVirol90(6),3093-111.Torresi,J.,Johnson,D.andWedemeyer,H.(2011)ProgressinthedevelopmentofpreventiveandtherapeuticvaccinesforhepatitisCvirus.JHepatol54(6),1273-85.Xiang,Z.H.,Cai,W.J.,Zhao,P.,Kong,L.B.,Ye,L.B.andWu,Z.H.(2006)PurificationandapplicationofbacteriallyexpressedchimericproteinE1E2ofhepatitisCvirus.ProteinExprPurif49(1),95-101.技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白，所述丙型肝炎病毒融合抗原蛋白融合了丙型肝炎病毒的衣壳蛋白Core、包膜蛋白E1和包膜蛋白E2的强免疫原性区域。所述丙型肝炎病毒融合抗原蛋白的氨基酸序列可源自丙型肝炎病毒基因型1b，所述丙型肝炎病毒基因型1b的GenBank登录号为:AEJ86549.1。所述丙型肝炎病毒融合抗原蛋白可由丙型肝炎病毒Core蛋白的1-92氨基酸,E1蛋白的55-122氨基酸和E2蛋白的63-218氨基酸共同组成。所述丙型肝炎病毒融合抗原蛋白的蛋白质序列可如SEQIDNO.1所示的蛋白序列，或具有同SEQIDNO.1所示序列的蛋白诱导交叉免疫反应的免疫原。本发明还提供了一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白表达载体，所述表达载体能够借助宿主表达上所述的任一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白。所述丙型肝炎病毒融合抗原蛋白表达载体可以是马铃薯X病毒载体PVX201，以能够编码上所述任一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白的核酸序列为编码序列，以烟草为表达宿主。所述的丙型肝炎病毒融合抗原蛋白的克隆可使用核酸序列为如SEQIDNO.26所示的序列，其组成从5’端至3’端依次为：保护碱基CAT，ClaI酶切位点，烟草偏爱Kozak序列，6个组氨酸组成的组氨酸标签编码序列，丙型肝炎病毒融合抗原编码序列，终止密码子，SalI酶切位点和保护碱基CTC。本发明还提供了如上所述任一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白、或如上所述任一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白表达载体表达的丙型肝炎病毒融合抗原蛋白在制备丙型肝炎病毒疫苗或丙型肝炎病毒引起的疾病的治疗制剂或预防制剂中的应用。本发明还提供了如上所述任一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白、或如上所述任一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白表达载体表达的丙型肝炎病毒融合抗原蛋白在制备丙型肝炎病毒诊断制剂或诊断试剂盒中的应用。本发明还提供了如上所述任一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白、或如上所述任一种丙型肝炎病毒融合抗原蛋白表达载体表达的丙型肝炎病毒融合抗原蛋白作为丙型肝炎病毒感染抑制剂的应用。为了本发明的目的，更为具体地，本发明做了如下一些实验：(1)构建丙型肝炎病毒基因型1b(GenBank登录号为:AEJ86549.1)Core,E1和E2蛋白的全长及截短突变体基因表达载体，构建的截短突变体基因表达载体转染烟草表达Core,E1和E2蛋白的系列截短突变体蛋白，烟草表达的截短突变体蛋白免疫小鼠，ELISA实验测定Core,E1和E2蛋白中具备强免疫原性的区域。实验结果表明：Core1-92疫原性强于Core93-190，E155-122免疫原性强于E11-54和E1123-199，E263-218免疫原性强于E21-62和E2219-344。(2)构建包含强免疫原性的Core1-92，E155-122和E263-218的融合抗原表达载体，转染烟草表达融合抗原Core1-92/E155-122/E263-218(命名为HCVles)。表达的融合抗原HCVles皮下多点注射方式免疫小鼠三次(免疫时间为1，14和28天)，Core，Core1-92，E1,E155-122,E2和E263-218免疫鼠作为对照。初次免疫35天后，眼静脉采血，1:400稀释，与丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子(携带荧光素酶基因)37℃孵育2小时，未用上述烟草表达蛋白免疫鼠血清孵育的假病毒粒子作为阴性对照，0.5mg/ml的CD81抗体孵育的假病毒粒子作为病毒感染抑制的阳性对照。病毒粒子感染细胞。三天后，收获病毒感染的细胞，荧光素活性(病毒滴度的指示剂)实验测定每种细胞内的病毒滴度，实验结果表明：与Core，Core1-92，E1,E155-122,E2和E263-218相比，融合抗原Core1-92/E155-122/E263-218(HCVles)诱导了更强的中和性抗体。而且HCVles免疫小鼠前后，监测鼠体温和饮食，发现HCVles对鼠没有明显毒性。(3)为了分析烟草表达的HCVles与丙型肝炎病毒感染者血清的反应性，ELISA实验测定1型丙型肝炎病毒感染者血清与HCVles的反应性。Core，Core1-92，E1,E155-122,E2和E263-218也被分析作为对照。实验结果表明：与Core，Core1-92，E1,E155-122,E2和E263-218相比，融合抗原HCVles的血清反应性显著提高，对1型丙型肝炎病毒感染者血清的检出率高达98％。(4)为了测定HCVles对丙型肝炎病毒粒子进入细胞的竞争性抑制效果，Huh7细胞用烟草表达蛋白(HCVles，Core，Core1-92，E1,E155-122,E2或E263-218)37℃孵育2小时，未用上述烟草表达蛋白孵育的Huh7作为阴性对照。然后使用丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子(携带荧光素酶基因)感染Huh7细胞。三天后，收获病毒感染的细胞，荧光素活性(病毒滴度的指示剂)实验测定每种细胞内的病毒滴度，实验结果表明：与Core，Core1-92，E1,E155-122,E2或E263-218相比，融合抗原HCVles抑制病毒感染的能力最强，使病毒感染性降低了93％。附图说明图1为Core,E1和E2截短突变体(Core1-92，Core93-190，E11-54，E155-122，E1123-199，E21-62、E263-218和E2219-344)免疫鼠的抗体滴度示意图。(A)示出了Core1-92和Core93-190免疫鼠的抗体滴度；(B)示出了E11-54，E155-122和E1123-199免疫鼠的抗体滴度；(C)示出了E21-62，E263-218和E2219-344免疫鼠的抗体滴度。图2为融合抗原HCVles的制备及其免疫特性示意图。(A)为PVX-HCVles载体示意图；(B)示出了PVX-HCVles；的CIaⅠ/SaII酶切鉴定图谱；(C)示出了HCVles在烟草中的表达鉴定，使用6×HisTag抗体,Westernblot检测HCVles表达。(D)示出了融合抗原HCVles诱导中和抗体能力测定，HCVles，Core，Core1-92，E1,E155-122,E2和E263-218免疫鼠血清1:400稀释，与丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子(携带荧光素酶基因)37℃孵育2小时，0.5mg/mlCD81抗体孵育的假病毒粒子作为病毒感染抑制对照。病毒粒子感染Huh7细胞三天后，收获病毒感染细胞，测定细胞内荧光素活性(病毒感染指示剂)。PBS免疫鼠血清孵育的病毒粒子感染性视为100％。图3为融合抗原HCVles与丙型肝炎病毒感染病人血清反应的示意图。ELISA测定抗原蛋白与100个1型丙型肝炎病毒感染者血清反应性，临床丙型肝炎病毒阴性血清作为阴性对照。丙型肝炎病毒阳性血清的OD值大于阴性对照OD值(20个丙型肝炎病毒阴性血清的平均值)2倍的条件下，判定抗原蛋白与该阳性血清有反应性。图4为融合抗原HCVles体外抑制丙型肝炎病毒感染示意图。烟草表达的蛋白(HCVles，Core，Core1-92，E1,E155-122,E2或E263-21)孵育Huh7细胞，未用蛋白孵育的Huh7细胞作为对照，丙型肝炎病毒(基因型1)假病毒粒子感染上述细胞，3天后，收获细胞，测定荧光素酶活性(病毒感染指示剂)。未用蛋白孵育组感染性视为100％。具体实施方式为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的各个实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。实施例1烟草表达的重组丙型肝炎病毒Core,E1和E2蛋白的强免疫原性区域获得1.1人工合成Core,E1和E2的全长及截短突变体基因基于丙型肝炎病毒基因型1b(核酸序列见GenBank登录号HQ639947.1，蛋白质序列见GenBank登录号AEJ86549.1)序列和抗原表位分析软件IEDB(http://www.iedb.org/home_v3.php)预测，设计包含不同抗原表位的Core,E1和E2截短突变体：Core1-92(编码Core蛋白1-92氨基酸)，Core93-190(编码Core蛋白93-190氨基酸)，E11-54(编码E1蛋白1-54氨基酸)，E155-122(编码E1蛋白55-122氨基酸)，E1123-199(编码E1蛋白123-199氨基酸)，E21-62(编码E2蛋白1-62氨基酸)、E263-218(编码E2蛋白63-218氨基酸)和E2219-344(编码E2蛋白219-344氨基酸)。通过重叠PCR合成Core,E1和E2的全长及截短突变体基因：Core(编码全长Core蛋白)，Core1-92，Core93-190，E1(编码全长E1蛋白)，E11-54，E155-122，E1123-199，E2(编码全长E2蛋白)，E21-62、E263-218和E2219-344。基于各截短突变体的编码氨基酸序列和丙型肝炎病毒基因型1b序列(GenBank登录号HQ639947.1和AEJ86549.1)，确定各截短突变体的编码核酸序列，基于每个截短突变体的编码核酸序列，使用软件http://helixweb.nih.gov/dnaworks/设计合成每个基因的PCR引物。为了便于合成基因的克隆，蛋白的表达纯化，在各合成基因的5’端引入ClaI酶切位点，烟草偏爱Kozak序列和组氨酸标签(6His)；在各基因的3’端引入终止密码子和SalI酶切位点。1.2Core,E1和E2的全长及截短突变体基因表达载体构建PCR合成的基因(Core，Core1-92，Core93-190，E1，E11-54，E155-122，E1123-199，E2，E21-62、E263-218和E2219-344)和马铃薯X病毒载体PVX201(Baulcombeetal.,1995)，使用ClaI和SalI双酶切，连接，获得Core,E1和E2的全长及截短突变体基因的植物表达载体，对表达载体进行ClaI/SalI酶切和测序鉴定。使用经鉴定序列正确的重组载体进行表达。1.3烟草表达的Core,E1和E2截短突变体蛋白免疫原性测定金刚砂磨损烟叶叶片，在磨损处接种Core,E1和E2的全长及截短突变体蛋白表达载体，空载体马铃薯X病毒PVX201感染烟叶作为阴性对照。每个叶片接种病毒载体量为5μg。病毒感染叶片出现花叶病症状时(8-12天),收获烟叶，液氮研磨，研磨后加入提取液(10％TCA和0.07％的β-巯基乙醇的丙酮)中，在冰上静置(3-4小时)，离心(8000rpm)1小时，上清液既为烟叶蛋白提取物。使用鼠源的6×HisTag抗体(LanPowerTM)，Westernblot鉴定融合蛋白表达。Ni柱纯化表达蛋白。纯化蛋白，多聚-L-精氨酸(上海淘普生物科技有限公司)和CpG寡核苷酸(生工生物工程股份有限公司)等质量混合，皮下多点注射方式免疫四周龄的BALB/c鼠三次(免疫时间为1，14和28天)，每次每只鼠免疫5μg的融合蛋白。实验组及对照组分别免疫三只鼠。不同时间眼静脉取血，系列稀释，ELISA测定不同时期(14天，28天，35天)抗体的滴度。ELISA实验参照文献(Xiangetal.,2006)进行，用纯化的抗原多肽(Core1-92，Core93-190，E11-54，E155-122，E1123-199，E21-62,E263-218和E2219-344)包被96孔板，每孔包被蛋白用量为50ng。鼠血清为一抗，二抗使用鼠源的HRP标记二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)。实验结果显示(表1和图1)：Core1-92免疫原性强于Core93-190，E155-122免疫原性强于E11-54和E1123-199，E263-218免疫原性强于E21-62和E2219-344。因此，由具备强免疫原性的抗原多肽Core1-92，E155-122和E263-218串联组成的融合抗原Core1-92/E155-122/E263-218(HCVles)可能具有增强的抗体诱导能力例如诱导更广泛的高滴度中和抗体。表1Core,E1和E2截短突变体(Core1-92，Core93-190，E11-54，E155-122，E1123-199，E21-62、E263-218和E2219-344)免疫鼠的抗体滴度通过图1和表1可以看出Core1-92的滴度随时间基本上成线性上升，Core93-190的滴度缓慢上升，且Core1-92的滴度值在各时间点均高于Core93-190；E155-122的滴度在各时间点均高于E11-54和E1123-199的滴度；E263-218的滴度在各时间点均高于E21-62和E2219-344的滴度；且在第35天，Core1-92，E155-122和E263-218的滴度均高于其他对应截短蛋白两倍左右到三倍左右。所以，通过实验发现Core1-92，E155-122和E263-218是相应蛋白的主要免疫原性区段。从而预测Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白能够聚集Core、E1和E2的主要免疫原性，将在下面的实验进一步验证与应用该融合蛋白。且上述融合蛋白的表达会比原始Core、E1和E2融合蛋白短，因而降低基因工程操作的难度。同时，截短蛋白组成的融合蛋白不会在体内切割产生HCV活性蛋白和包装进入子代病毒粒子。实施例2融合抗原Core1-92/E155-122/E263-218(HCVles)的制备及免疫特性测定2.1融合抗原HCVles表达载体的构建重叠PCR合成融合抗原HCVles基因，HCVles基因编码316个氨基酸(如SEQIDNO.1所示)，由具备强免疫原性的抗原多肽Core1-92，E155-122和E263-218串联组成。为了便于HCVles的基因克隆，蛋白表达纯化，在HCVles基因5’端引入ClaI酶切位点和烟草偏爱Kozak序列，组氨酸标签(6个组氨酸)，3’端引入终止密码子和SalI酶切位点。设计24条引物(SEQIDNO.2-25)，生工生物工程股份有限公司合成上述24条引物，一步重叠PCR反应合成融合蛋白基因(SEQIDNO.26)。PCR合成的HCVles融合蛋白基因和马铃薯X病毒载体PVX201，使用ClaI和SalI双酶切，连接，获得融合蛋白表达载体PVX-HCVles(图2A)，ClaI/SaII酶切鉴定表明构建载体正确(图2B)，测序进一步证实融合蛋白HCVles的序列与设计序列吻合，这些结果表明丙型肝炎病毒基因工程融合蛋白HCVles的表达载体PVX-HCVles已成功构建。2.2融合抗原HCVles在烟草中表达和鉴定金刚砂磨损烟叶叶片，在磨损处接种融合蛋白表达载体PVX-HCVles，同时以马铃薯X病毒PVX201(阴性对照)每个叶片接种病毒载体量为5μg。病毒感染叶片出现花叶病症状时(8-12天),收获烟叶，液氮研磨，研磨后加入提取液(10％TCA和0.07％的β-巯基乙醇的丙酮)中，在冰上静置(3-4小时)，离心(8000rpm)1小时，上清液既为烟叶蛋白提取物。使用鼠源的6×HisTag抗体(LanPowerTM)，Westernblot检测融合蛋白表达。转染融合蛋白表达载体PVX-HCVles的烟草蛋白提取物检测到了与预期融合蛋白分子量大小一致的蛋白带，但是接种空载体PVX201的烟叶，没有融合蛋白蛋白带出现(图2C)，表明重组表达载体PVX-HCVles接种的烟草成功表达了丙肝融合蛋白HCVles。2.3融合抗原HCVles的纯化预平衡4mLNi-NTA层析柱,PVX-HCVles感染烟叶的蛋白提取物挂柱,用5倍柱床体积的80mmol/LIMAC缓冲液洗脱杂蛋白,再用5倍柱床体积的150mmol/LIMAC缓冲液洗脱融合抗原蛋白HCVles。收集样品装入透析袋,浸入透析缓冲液(bufferA,10％甘油,0.1％2-巯基乙醇),4℃透析16h。透析后,聚乙二醇浓缩样品融合抗原蛋白HCVles,分装,保存于-70℃。2.4动物实验测定融合抗原HCVles的免疫特性和安全性纯化HCVles，多聚-L-精氨酸和CpG寡核苷酸等质量混合，皮下多点注射方式免疫四周龄的BALB/c鼠三次(免疫时间为1，14和28天)，每只鼠每次免疫5μg的融合蛋白蛋白。Core，Core1-92，E1,E155-122,E2，E263-218免疫鼠和PBS免疫鼠作为对照，每组样品分别免疫三只鼠。初次免疫35天后，眼静脉采血，1:400稀释，与丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子(携带荧光素酶基因)37℃孵育2小时，未用上述烟草表达蛋白免疫鼠血清孵育的假病毒粒子作为阴性对照，0.5mg/ml的CD81抗体孵育的假病毒粒子作为阳性对照。病毒粒子感染细胞，三天后，收获病毒感染的细胞。参考(Kongetal.,2016)，使用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天公司)，荧光素活性(病毒滴度的指示剂)实验测定每种细胞内的病毒滴度，实验结果表明：与Core，Core1-92，E1,E155-122,E2和E263-218相比，融合抗原Core1-92/E155-122/E263-218(HCVles)诱导了更强的中和性抗体(表2和图2D)。而且HCVles免疫小鼠前后，监测鼠体温和饮食，发现HCVles免疫后对鼠的体温和饮食没有造成影响(表3)，说明HCVles免疫没有对鼠造成明显毒性。表2荧光素酶报告基因实验分析重组丙型肝炎病毒抗原蛋白免疫鼠诱导中和抗体的能力孵育病毒血清病毒感染性(相对荧光素酶活性)Control(PBS免疫鼠血清)100±10Core免疫鼠血清99±7Core1-92免疫鼠血清98±6E1免疫鼠血清58±2E155-122免疫鼠血清45±2E2免疫鼠血清35±5E263-218免疫鼠血清40±2HCVles免疫鼠血清15±1.5CD81抗体19±1病毒感染性值代表平均值±S.D(n＝3)。表3HCVles免疫鼠前后进食量和体温测定表进食量和体温的数值代表平均值±S.D(n＝3)。对照表2和图2D的实验结果可以看出，Core与Core1-92之间、E1与E155-122之间、E2与E263-218之间在诱导抑制病毒感染的中和抗体方面差别不大，这与图1和表1中的诱导抗体滴度实验结果是一致的，这说明用上述三个截短蛋白代替相应原始蛋白可以起到差不多的免疫效果。进一步地，如果按照测试蛋白抗血清处理组与对照样品之间感染性的比值来代表病毒感染率，所有数值使用平均值来计算，则Core1-92抗血清处理组的病毒感染率为0.98，E155-122抗血清处理组的病毒感染率为0.45，E263-218抗血清处理组的病毒感染率为0.40，HCVles抗血清处理组的病毒感染率为0.15。0.98×0.45×0.40＝0.1764＞0.15，这表明Core1-92，E155-122和E263-218抗血清处理组的病毒感染率的叠加大于Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白免疫鼠后抗血清的的感染率。这可以说明Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白不是简单地叠加了Core1-92，E155-122和E263-218的免疫原性，而是Core1-92，E155-122和E263-218之间发生了协同/增效的效果。另一方面，Core抗血清处理组的病毒感染率为0.99，E1抗血清处理组的病毒感染率为0.58，E2抗血清处理组的病毒感染率为0.35,0.99×0.58×0.35＝0.2＞0.15。这表明Core，E1和E2抗血清处理组的病毒感染率的叠加大于Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白抗血清处理组的感染率。这说明Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白抗血清处理组的病毒感染性低于野生型Core，E1和E2抗血清处理组的病毒感染性，HCVles相对于野生型Core，E1和E2也起到了协同增效作用，起到了意料不到的技术效果。HCVles抗血清处理组的感染性还低于CD81抗体处理组。这些结果说明HCVles可望用于制备疫苗。实施例3融合抗原Core1-92/E155-122/E263-218(HCVles)与丙肝病人血清的反应性测定ELISA实验测定HCVles，Core，Core1-92，E1，E155-122，E2和E263-218与丙型肝炎病毒病人血清的反应性。用纯化的抗原多肽(HCVles，Core，Core1-92，E1，E155-122，E2和E263-218)包被96孔板，每孔包被蛋白用量为50ng。人血清为一抗，二抗使用人源的HRP标记二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)。丙型肝炎病毒阴性血清作为阴性对照。HCVles与100个随机选取的1型丙型肝炎病毒感染者血清(来自武汉大学人民医院，宁波市人民医院和南昌市肝病医院)中的98个发生反应，反应率为98％，明显高于Core，Core1-92，E1，E155-122，E2，和E263-218的病人血清反应性(图3和表4)。这些结果表明烟草表达的融合抗原HCVles在人体内具有很好的抗原性，也说明烟草表达的HCVles可应用于临床1型丙型肝炎病毒感染者的诊断，其准确率很高。表4ELISA实验分析重组丙型肝炎病毒抗原蛋白与1型丙型肝炎病毒感染病人血清的反应性抗原蛋白病人血清反应数量Core55Core1-9250E160E155-12255E275E263-21855HCVles98一共测试100份样品，所以Core1-92病人血清不反应的数量为50，不反应比例为50％，E155-122病人血清不反应的数量为45，不反应比例为45％，E263-218病人血清不反应的数量为45，不反应比例为45％，HCVles病人血清不反应的数量为2，不反应比例为2％。0.5×0.45×0.45＝0.10＞0.02。这说明，如果样本足够大的HCV阳性血清，对于Core1-92、E155-122和E263-218中的一种进行检测，再用第二种检测经第一种检测显示阴性的样本，再用第三种检测经第二种检测显示阴性的样本，最终还有约10％的样本没有检测出来，而HCVles只有约2％的样品没有检测出来。对比表2和图2D的结果，这进一步说明了Core1-92、E155-122和E263-218的融合具有协同增效效果。而在临床应用中，该融合蛋白的血清检测效果优于分别用Core1-92、E155-122和E263-218来检测的效果，且2％和10％漏检率之间的差异极其显著。Core病人血清不反应的数量为45，不反应比例为45％，E1病人血清不反应的数量为40，不反应比例为40％，E2病人血清不反应的数量为25，不反应比例为25％。0.45×0.4×0.25＝0.045＞0.02。基于上述相同的算法，用Core、E1和E2分别检测阳性血清的漏检率也高于用Core1-92、E155-122和E263-218融合蛋白。这说明Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白检测HCV阳性血清方面要优于野生型明Core，E1和E2分别检测的综合检出率，HCVles相对于野生型Core，E1和E2也起到了协同增效作用，起到了意料不到的技术效果。实施例4融合抗原Core1-92/E155-122/E263-218(HCVles)对病毒感染的抑制效果为测定HCVles对丙型肝炎病毒粒子进入细胞的竞争性抑制效果，Huh7细胞用0.5mg/ml的烟草表达蛋白(HCVles，Core，Core1-92，E1,E155-122,E2或E263-218)37℃孵育2小时，未用上述烟草表达蛋白孵育的Huh7作为阴性对照。然后使用丙型肝炎病毒基因1型假病毒粒子(携带荧光素酶基因)感染Huh7细胞。三天后，收获病毒感染的细胞，荧光素活性(病毒滴度的指示剂)实验测定每种细胞内的病毒滴度，实验结果表明：与Core，Core1-92，E1,E155-122,E2或E263-218相比，融合抗原HCVles抑制病毒感染的能力最强，使病毒感染性降低了93％(表5和图4)。这些结果表明：烟草表达的融合抗原HCVles在体外具备抑制丙型肝炎病毒感染的能力。表5荧光素酶报告基因实验分析重组丙型肝炎病毒抗原蛋白竞争性抑制病毒感染的效果孵育细胞蛋白病毒感染性(相对荧光素酶活性)Control(无蛋白)100±8Core98±13Core1-9295±10E141±3E155-12250±2.5E228±1E263-21830±5HCVles7±1病毒感染性值代表平均值±S.D(n＝3)。因为对照为100，表5中某蛋白处理组的病毒感染性值相当于该蛋白未能有效保护细胞受到HCV感染的比例，可简称未保护率。0.95×0.50×0.30＝0.1425＞0.07。这说明，如果不考虑蛋白之间的协同或拮抗等相互作用，Core1-92，E155-122和E263-218分别加入Huh7细胞，还有14.25％的感染率，而用Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白，则仅有7％的感染率。这进一步说明了，在HCVles中所包含Core1-92，E155-122和E263-218的部分之间产生了协同增效作用。0.98×0.41×0.28＝0.1124＞0.07。这说明Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白处理Huh7细胞后病毒的感染性低于野生型Core，E1和E2分别处理Huh7细胞后病毒的感染性，HCVles相对于野生型Core，E1和E2也起到了协同增效作用，起到了意料不到的技术效果。从上述各个实验结果可以看出，本发明所制备的Core1-92，E155-122和E263-218的融合蛋白HCVles相对于Core1-92，E155-122和E263-218与野生型Core，E1和E2均起到了协同增效作用，可以有效地用于HCV诊断制剂的制备，竞争性阻止HCV入侵的制剂的制备，HCV疫苗的制备等方面。以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>江西农业大学<120>一种丙肝病毒基因工程疫苗及其制备方法<130>2016-10-27<160>26<170>PatentInversion3.5<210>1<211>316<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(191)..(191)<223>Xaacanbeanynaturallyoccurringaminoacid<400>1MetSerThrAsnProLysProGlnArgLysThrLysArgAsnThrAsn151015ArgArgProGlnAspValLysPheProGlyGlyGlyGlnIleValGly202530GlyValTyrLeuLeuProArgArgGlyProArgLeuGlyValArgAla354045ThrArgLysThrSerGluArgSerGlnProArgGlyArgArgGlnPro505560IleProLysAlaArgArgProGluGlyArgThrTrpAlaGlnProGly65707580TyrProTrpProLeuTyrGlyAsnGluGlyMetGlyAlaAlaArgAsn859095SerSerValProThrThrThrIleArgArgHisValAspLeuLeuVal100105110GlyValAlaAlaPheCysSerAlaMetTyrValGlyAspLeuCysGly115120125SerValPheLeuValSerGlnLeuPheThrPheSerProArgArgHis130135140GluThrValGlnAspCysAsnCysSerIleTyrProGlyHisValThr145150155160AsnAlaSerGlyCysProGluArgLeuAlaSerCysArgProIleAsp165170175GluPheAspGlnGlyTrpGlyProIleThrTyrThrGlySerXaaSer180185190ProAspGlnArgProTyrCysTrpHisTyrAlaProGlnGlnCysSer195200205IleValProAlaSerThrValCysGlyProValTyrCysPheThrPro210215220SerProValValValGlyThrThrAspArgSerGlyValProThrTyr225230235240AsnTrpGlyGluAsnGluThrAspValLeuLeuLeuAsnAsnThrArg245250255ProProGlnGlyAsnTrpPheGlyCysThrTrpMetAsnThrThrGly260265270PheThrLysThrCysGlyGlyProProCysAsnIleGlyGlyLysGly275280285AsnAsnThrLeuThrCysProThrAspCysPheArgLysHisProGlu290295300AlaThrTyrThrLysCysGlySerGlyProTrpLeu305310315<210>2<211>55<212>DNA<213>人工序列<400>2catatcgatgccatgggacatcatcatcatcatcatatgagcacaaatcctaaac55<210>3<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>3gcggcggttggtgttacgtttggtttttctttgaggtttaggatttgtgctcatatgatg60<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>4gtaacaccaaccgccgcccacaggacgttaagttcccgggcggtggtcagatcgttggtg60<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>5cacacccaacctggggcccctgcgcggcaacaggtaaactccaccaacgatctgaccacc60<210>6<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>6ccccaggttgggtgtgcgcgcgactaggaagacttccgagcggtcacaacctcgtgggag60<210>7<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>7gtcctgccctcgggtcggcgagccttggggataggttgtcgcctcccacgaggttgtgac60<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>8gacccgagggcaggacctgggctcagcccgggtatccttggcccctctacggtaacgagg60<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>9tgtcgtagtggggacgctgctgttcctggccgcccccatgccctcgttaccgtagagggg60<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>10gcgtccccactacgacaatacggcgccacgtggatttgctcgttggggtggctgcttttt60<210>11<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>11ggaagacagatccgcagagatcccccacgtacatagcggagcaaaaagcagccaccccaa60<210>12<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>12ctctgcggatctgtcttcctcgtctctcagctgttcaccttctcgcctcgtcggcatgag60<210>13<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>13gttacgtggccgggatagattgagcagttgcagtcctgaactgtctcatgccgacgaggc60<210>14<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>14tctatcccggccacgtaacaaacgcgtccgggtgcccagaacgcctggccagctgccgcc60<210>15<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>15ccagtataagtgatggggccccatccctgatcgaactcgtcaatggggcggcagctggcc60<210>16<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>16ggccccatcacttatactgggtctratagcccggaccagaggccttactgctggcactac60<210>17<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>17cacaccatccacgcgggcacaatactacactgctgaggtgcgtagtgccagcagtaaggc60<210>18<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>18ccgcgtggatggtgtgtggtccagtgtactgtttcactccaagccctgttgtggtgggga60<210>19<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>19ttctccccccagttatacgtagggacaccggaacgatcggtcgtccccaccacaacaggg60<210>20<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>20tacgtataactggggggagaatgagacagacgtgctgctccttaacaacacgcgg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