一种两性羧酸三维金属配位聚合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种两性羧酸三维铜金属配位聚合物的制备方法及应用。

背景技术：

近年来根据荧光光谱学原理应用荧光探针检测核酸分子已成为科学研究者关注的一大热点，这种方法具有灵敏、快速、简便以及低成本等优点。据文献报道，碳纳米材料、纳米金属、部分金属配位聚合物可作为核酸检测荧光探针。但碳纳米材料和纳米金属等材料因为合成复杂繁琐、生产成本高、难溶于水等缺点，限制了这些材料在核酸检测方面的应用研究。

金属配位聚合物是一类由金属离子与有机配体通过配位共价键结合，并通过自组装的方式得到的新型多孔聚合物材料。金属配位聚合物具有比表面积大，孔密度高、孔洞大小可调节、易于功能化等优点，人们已经将其应用到生物医药相关的领域，如载药、生物造影、对生物小分子和大分子的检测等。金属配位聚合物具有一维，二维和三维的结构，其中具有三维孔洞结构的金属配位聚合物因其较大的孔隙率，对探针核酸分子具有更好的吸附作用，从而更有望成为优良的病毒核酸分子探针。

具有三维孔洞结构的金属配位聚合物虽然具有很多优点，但部分刚性配体构筑的金属配位聚合物水溶性差，遇水后容易发生孔洞结构坍塌，严重阻碍了其核酸分子检测功能的实际应用研究。因此，设计合成对水稳定的金属配位聚合物材料是进一步深入研究其核酸分子探针功能的关键。季铵盐两性羧酸是一类极性较大的配体，研究发现以该类配体与金属离子自组装构建的金属配位聚合物不仅具有丰富的骨架结构，亦具有良好的水稳定性，因此可通过设计合成季铵盐两性羧酸配体来构建具有良好水稳定性的三维金属配位聚合物应用于核酸分子的检测。

技术实现要素：

本发明的技术任务之一是为了弥补现有技术的不足，提供一种两性羧酸三维铜金属配位聚合物的制备方法，即[Cu(Dcbcp)(bpe)]金属配位聚合物材料的制备方法，该方法所用原料来源广泛、容易获得、合成工艺简单、反应条件温和、重复性好。

本发明的技术任务之二是提供该两性羧酸三维铜金属配位聚合物的用途，该材料具有良好水溶性和水稳定性，可作为核酸检测荧光探针成功用于相关核酸序列的有效检测，并且具有快速简便、高效灵敏的优点，在与疾病相关的核酸系列检测中具有良好应用前景。

本发明解决上述问题的技术方案如下：

1、一种两性羧酸三维铜金属配位聚合物的制备

该两性羧酸三维铜金属配位聚合物为两性三羧酸配体与联吡啶辅助配体共同构筑而得，其特征在于主配体为N-(3,5-二羧基苄基)-(3-羧基)-溴化吡啶(H₃DcbcpBr)，辅助配体为1,2-二(4-吡啶基)乙烯(bpe)，其配体分子结构如图1所示。该铜配位聚合物的元素分析式为C₂₇H₁₉N₃O₆Cu·H₂O，计算值为C 57.54,H 3.73,N 7.46；实验值为C 57.42,H3.76,N,7.28；红外光谱数据(KBr)为：3546(s),3038(m),1604(s),1436(s),1162(m),1067(m),983(m),816(m),746(m),718(m),671(m),559(m),457(m)。

所述两性羧酸三维铜金属配位聚合物的单晶衍射使用Bruker APEX II衍射仪进行数据收集，经晶体解析得出的晶胞参数分别为：α＝90°，β＝121.969(4)°，γ＝90°。其它相关的结晶学参数列于附表1，重要键长键角见附表2。

表1[Cu(Dcbcp)(bpe)_n]的晶体学参数

^a R＝||F_o|-|F_c|/|F_o|.^b wR＝{w(F_o²-F_c²)²/w(F_o²)²}^1/2.^c GOF＝{w((F_o²-F_c²)²)/(n-p)}^1/2,where n＝number of reflections and p＝total numbers of parameters refined

表2[Cu(Dcbcp)(bpe)_n]的部分键长与键角[°]

Symmetrytransformations used to generate equivalent atoms:#1:x,-y,z-1/2；#2:

x+1/2,-y+1/2,z+1/2；

#3:-x+1/2,y+1/2,-z+1/2；#4:x,-y,z+1/2；#5:-x+1/2,y-1/2,-z+1/2；#6:x-1/2,-y+1/2,z-1/2

X-射线单晶衍射结果表明，该铜金属配位聚合物属于单斜晶系，空间群为C2/c，每个不对称单元含有一个[Cu(Dcbcp)(bpe)]分子，金属Cu(II)的中心与来自两个bpe分子的N原子和三个Dcbcp配体上的三个羧基上的四个O原子配位。其中两个羧基属于单齿配位模式，还有一个羧基属于螯合配位模式，由此形成八面体的配位构型。每两个Cu原子由一对μ–COO连接，Cu原子进一步与一个羧基螯合配位形成[Cu₂(Dcbcp)₄]次级结构，一个[Cu₂(Dcbcp)₄]次级结构与周围六个相同的结构连接，在bc轴面上形成二维的平面结构。Cu原子进一步与两个bpe分子在a轴方向上配位结合，最终形成三维的结构，见图2。

本发明所述的两性羧酸铜金属配位聚合物采用本领域常用的制备方法，如，将N-(3,5-二羧基苄基)-(3-羧基)-溴化吡啶、1,2-二(4-吡啶基)乙烯与铜盐反应得到。本发明人推荐的方法，由以下步骤组成：

(1)将N-(3,5-二羧基苄基)-(3-羧基)-溴化吡啶分散于蒸馏水中，用0.1M NaOH溶液调pH至7.0，得到主配体溶液

(2)将与N-(3,5-二羧基苄基)-(3-羧基)-溴化吡啶等摩尔量的硫酸铜溶解于水中，得到铜盐溶液；

(3)将与N-(3,5-二羧基苄基)-(3-羧基)-溴化吡啶等摩尔量的1,2-二(4-吡啶基)乙烯溶解于DMF中，得到辅助配体溶液；

(4)将步骤(2)得到的铜盐溶液加入到步骤(1)得到主配体溶液中，室温搅拌反应0.5h后过滤，滤液中加入步骤(3)得到的辅助配体溶液，搅拌0.5h后过滤，滤液分装于欣维尔瓶中程序升温至100℃反应72h，之后再程序降温至30℃析出绿色块状结晶，收集晶体，乙醚冲洗后真空干燥，得到所述的两性羧酸铜金属配位聚合物[Cu(Dcbcp)(bpe)]。

将所合成的两性羧酸铜金属配位聚合物[Cu(Dcbcp)(bpe)]浸泡于水中48h，取出后通过粉末衍射测试，与未浸泡的作对比，XRD图基本一致，其结果见附图3，说明该铜金属配位聚合物骨架未坍塌，对水具有良好的稳定性。在25℃条件下，该铜金属配位聚合物在水中的溶解度可达0.6mg/mL。

2、如上所述方法制备的两性羧酸三维铜金属配位聚合物，用于荧光探针检测核酸分子

检测原理如下：铜金属配位聚合物首先通过静电、π-π堆积和(或)氢键作用与P-DNA(带有荧光标记物质的DNA)结合形成复合体系并产生荧光淬灭现象。在体系中加入与P-DNA碱基互补关系的靶向DNA/RNA(Target DNA/RNA)，因Target DNA/RNA与P-DNA之间很强的互补配对作用，使P-DNA脱离淬灭材料与Target DNA/RNA结合形成双链或杂化双链DNA，因双链或杂化双链DNA与MOF的相互作用较弱，从而从铜金属配位聚合物材料表面脱离导致荧光复苏，通过荧光光谱表征荧光淬灭与复苏程度达到检测DNA/RNA的目的。

具体检测步骤如下：

(1)化合物对荧光标记P-DNA的荧光淬灭

用100μM Tris-HCl缓冲溶液将100μM的P-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；将化合物溶解在100μM Tris-HCl缓冲溶液配成500μM(含50nM P-DNA)的溶液为滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度的变化(λ_ex＝480nm)直到荧光淬灭达到饱和，计算荧光淬灭效率Q_E％。

Q_E％＝(1－F_M/F₀)×100％(F₀：P-DNA初始荧光强度；F_M：淬灭达到饱和时的荧光强度)

(2)复合体系在对Target DNA/RNA序列的识别检测

反应时间的确定：在上述实验基础上，将稀释后的待检Target DNA/RNA溶液最小体积(10μL)加入到荧光淬灭达到饱和的复合体系中，使Target DNA/RNA在体系中达到最小浓度25nM，监测荧光强度随时间的变化，确定体系荧光复苏达到最大值的时间作为检测Target DNA/RNA的反应时间R_T。

荧光复苏率的测定：以复合体系检测最小浓度Target DNA/RNA的反应时间为标准，记录复合体系荧光强度随Target DNA/RNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和，计算荧光复苏效率R_E。

R_E＝F_T/F_M－1(F_T：复苏达到饱和时的荧光强度；F_M：淬灭达到饱和时的荧光强度)

检测限的计算：用下式计算复合体系对Target DNA/RNA测定的检测限(LOD)。

LOD＝3σ/S(σ：为未加入Target DNA/RNA前的荧光强度标准偏差，S为校正荧光复苏曲线斜率)

(3)本发明所述铜金属配位聚合物材料对病毒相关核酸序列的识别检测

将本发明所述的铜金属配位聚合物材料用于艾滋病毒、苏丹病毒、登革病毒相关核酸的检测，具有良好的检测作用，与文献报道的其它金属配位聚合物材料检测核酸相比，本发明所述铜金属配位聚合物用于HIV-1ds-DNA、SUDV RNA和DENV-2RNA检测具有检测时间较短、检测限低的优点，其结果见表3。

表3本发明所述铜金属配位聚合物及部分文献发表金属配位聚合物检测性能

有益效果

1)本发明产物原料来源广泛、容易获得。

2)本发明产物合成工艺简单、反应条件温和，可在水溶液中重结晶获得，无毒无害，无需惰性气体保护，做到了绿色化学合成，产率可达75％以上。

3)本发明产品对HIV-1ds-DNA、SUDV RNA和DENV-2RNA具有检测效果；检测快速简便、高效灵敏，在病毒引起的相关疾病的核酸系列检测中具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1为本发明所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物的配体结构；

图2为本发明两性羧酸三维铜金属配位聚合物的晶体结构；

图3为本发明所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物的粉末衍射图；

图4为本发明所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物对P₁-DNA荧光淬灭曲线；

图5为复合体系中T₁-DNA荧光复苏强度随浓度变化曲线(a)和随时间变化曲线(b)；

图6为本发明所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物对P₂-DNA荧光淬灭曲线；

图7为复合体系中T₂-RNA荧光复苏强度随浓度变化曲线(a)和随时间变化曲线(b)；

图8为本发明所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物对P₃-DNA荧光淬灭曲线；

图9为复合体系中T₃-RNA荧光复苏强度随浓度变化曲线(a)和随时间变化曲线(b)。

具体实施方式

实施例1制备金属配位聚合物

1、两性羧酸三维铜金属配位聚合物的制备

(1)将N-(3,5-二羧基苄基)-(3-羧基)-溴化吡啶(0.764g,2mmol)分散于蒸馏水(70mL)中，用0.1M NaOH溶液调pH至7.0，得到主配体溶液；

(2)将CuSO₄·5H₂O(0.391g,2mmol)溶解于蒸馏水(20mL)中，得到铜盐溶液；

(3)将1,2-二(4-吡啶基)乙烯(0.360g,2mmol)溶解于DMF溶液(5mL)中，得到辅助配体溶液；

(4)将步骤2得到的铜盐溶液逐滴加入到步骤1得到的主配体溶液中，室温搅拌反应0.5h后过滤，得到澄清溶液；

(5)将步骤3得到的辅助配体溶液加入到步骤4得到的澄清溶液中，搅拌0.5h后过滤得到蓝色澄清溶液。将滤液分装于欣维尔瓶中进行程序升温(1h,25℃到100℃)，于100℃反应72h，之后再进行程序降温(48h,100℃到30℃)析出绿色块状结晶，收集晶体，乙醚冲洗后真空干燥，得到所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物[Cu(Dcbcp)(bpe)](经测算产率为85％)。

2、两性羧酸三维铜金属配位聚合物[Cu(Dcbcp)(bpe)]的鉴定

所述两性羧酸三维铜金属配位聚合物常温下为绿色块状晶体，分子式为[Cu(Dcbcp)(bpe)]，式中的Dcbcp为N-(3,5-二羧基苄基)-(3-羧基)-溴化吡啶，bpe为1,2-二(4-吡啶基)乙烯。通过元素分析、IR光谱和X-射线单晶衍射分析鉴定，结果如下。

(1)元素分析C₂₇H₁₉N₃O₆Cu·H₂O，计算值:C 57.54,H 3.73,N 7.46；实验值:C 57.42,H3.76,N,7.28。

(2)红外光谱(KBr disc,cm^-1)ν3546(s),3038(m),1604(s),1436(s),1162(m),1067(m),983(m),816(m),746(m),718(m),671(m),559(m),457(m)。

(3)相关的结晶学参数：单晶衍射使用Bruker APEX II衍射仪进行数据收集，经晶体解析得出的晶胞参数分别为：α＝90°，＝121.969(4)°，γ＝90°。其它相关的结晶学参数列于附表1，重要键长键角见附表2。X-射线单晶衍射结果表明，所述两性羧酸三维铜金属配位聚合物属于单斜晶系，空间群为C2/c，每个不对称单元含有一个[Cu(Dcbcp)(bpe)]分子，金属Cu(II)的中心与来自两个bpe分子的N原子和三个Dcbcp配体上的三个羧基上的四个O原子配位。其中两个羧基属于单齿配位模式，还有一个羧基属于螯合配位模式，由此形成八面体的配位构型。每两个Cu原子由一对μ–COO连接，Cu原子进一步与一个羧基螯合配位形成[Cu₂(Dcbcp)₄]次级结构，一个[Cu₂(Dcbcp)₄]次级结构与周围六个相同的结构连接，在bc轴面上形成二维的平面结构。Cu原子进一步与两个bpe分子在a轴方向上配位结合，最终形成三维的结构。

(4)水稳定性：将所合成的[Cu(Dcbcp)(bpe)]浸泡于水中48h后进行粉末衍射测试，并与未浸泡的作对比，结果为浸泡前后XRD图基本一致(见附图3)，说明该铜金属配位聚合物骨架未坍塌，对水具有良好的稳定性。

(5)水中溶解度：在25℃条件下，该铜金属配位聚合物在水中的溶解度为0.6mg/mL。

实施例2以实施例1铜金属配位聚合物对艾滋病毒核酸序列检测

(1)艾滋病毒HIV-1待检核酸序列的确定

通过GeneBank和其他相关数据库的联合检索，筛选出艾滋病毒HIV-1保守序列中20-30bp大小、具有100％特异性的ds DNA序列，人工合成作为待检序列，即target DNA，并对其互补链cDNA序列进行荧光标记(P-DNA)，序列如下：

Target₁DNA序列(T₁-DNA)：5'-AGAAAAAAGAAGAA-3'

P₁-DNA序列互补链(P₁-DNA)：5'-FAM-TTCTTCTTTTTTCT-3'

(2)配制铜金属配位聚合物水溶液

将铜金属配位聚合物溶于蒸馏水中配制成浓度为250mM的溶液并用无菌过滤器对溶液进行除菌，密封保存作为贮备液待用。

(3)金属配位聚合物对荧光标记P₁-DNA的荧光淬灭

用100μM Tris-HCl缓冲溶液将100μM的P₁-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；取金属配位聚合物贮备液用100μM Tris-HCl缓冲溶液稀释成500μM(含50nM P₁-DNA)作为滴定液。取P₁-DNA待滴定液2mL于荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度的变化(λ_ex＝480nm)直到荧光淬灭达到饱和，计算荧光淬灭效率Q_E％。该铜金属配位聚合物对荧光标记的P₁-DNA的荧光淬灭率为65.0％。

(4)复合体系在对待检T₁-DNA序列的识别检测

在上述实验基础上，将稀释后的待检T₁-DNA溶液(10μL)加入到荧光淬灭达到饱和的复合体系中，使T₁-DNA在体系中达到最小浓度25nM，监测荧光强度随时间的变化，确定体系荧光复苏达到最大值的时间作为检测T₁-DNA的反应时间R_T。以复合体系检测T₁-DNA的反应时间R_T为标准，记录复合体系荧光强度随T₁-DNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和，计算荧光复苏率R_E和检测限。铜金属配位聚合物与荧光标记的P₁-DNA形成复合体系对艾滋病毒HIV-1保守序列中特异性的ds DNA序列的检测反应时间为23min，荧光复苏率R_E为0.98，检测限为81pM。该结果表明本发明所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物对艾滋病毒HIV-1的核酸序列具有较好的检测作用。

实施例3以实施例1铜金属配位聚合物对苏丹病毒核酸序列检测

(1)苏丹病毒SUDV待检核酸序列的确定

通过GeneBank和其他相关数据库的联合检索，筛选出苏丹病毒SUDV保守序列中20-30bp大小、具有100％特异性的RNA序列，人工合成作为待检序列，即target RNA。考虑到RNA相对的不稳定性，将target RNA的互补链置换成其互补DNA(cDNA)，并对cDNA序列进行荧光标记，即probe DNA，序列如下：

Target₂RNA序列(T₂-RNA)：5'-GAUGAGGACAAACUUUUUAA-3'

P₂-DNA序列互补链(P₂-DNA)：5'-FAM-TTAAAAAGTTTGTCCTCATC-3'

(2)配制铜金属配位聚合物水溶液

将铜金属配位聚合物溶于蒸馏水中配制成浓度为250mM的溶液并用无菌过滤器对溶液进行除菌，密封保存作为贮备液待用。

(3)金属配位聚合物对荧光标记P₂-DNA的荧光淬灭

用100μM Tris-HCl缓冲溶液将100μM的P₂-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；将取金属配位聚合物贮备液用100μM Tris-HCl缓冲溶液稀释成500μM(含50nM P₂-DNA)作为滴定液。取P₂-DNA待滴定液2mL于荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度的变化(λ_ex＝480nm)直到荧光淬灭达到饱和，计算荧光淬灭效率Q_E％。该铜金属配位聚合物对荧光标记的P₁-DNA的荧光淬灭率为83.0％。

(4)复合体系在对待检T₂-RNA序列的识别检测

在上述实验基础上，将稀释后的待检T₂-RNA溶液(10μL)加入到荧光淬灭达到饱和的复合体系中，使T₂-RNA在体系中达到最小浓度25nM，监测荧光强度随时间的变化，确定体系荧光复苏达到最大值的时间作为检测T₂-RNA的反应时间R_T。以复合体系检测T₂-RNA的反应时间R_T为标准，记录复合体系荧光强度随T₂-RNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和，计算荧光复苏率R_E和检测限。铜金属配位聚合物与荧光标记的P₂-DNA形成复合体系对苏丹病毒SUDV RNA序列检测反应时间为23min，荧光复苏率R_E为2.4，检测限为31pM。该结果表明本发明所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物对苏丹病毒核酸序列具有较好的检测作用。

实施例3以实施例1铜金属配位聚合物对登革热2型病毒核酸序列检测

(1)登革热2型病毒DENV-2待检核酸序列的确定

通过GeneBank和其他相关数据库的联合检索，筛选出登革热2型病毒DENV-2保守序列中20-30bp大小、具有100％特异性的RNA序列，人工合成作为待检序列，即target RNA。考虑到RNA相对的不稳定性，将target RNA的互补链置换成其互补DNA(cDNA)，并对cDNA序列进行荧光标记，即probe DNA，序列如下：

Target₃RNA序列(T₃-RNA)：5'-UGGUGCUGUUGAAUCAACAGGUUCU-3'

P₃-DNA序列互补链(P₃-DNA)：5'-FAM-AGAACCTGTTGATTCAACAGCACCA-3'

(2)配制铜金属配位聚合物水溶液

将铜金属配位聚合物溶于蒸馏水中配制成浓度为250mM的溶液并用无菌过滤器对溶液进行除菌，密封保存作为贮备液待用。

(3)金属配位聚合物对荧光标记P₃-DNA的荧光淬灭

用100μM Tris-HCl缓冲溶液将100μM的P₃-DNA溶液稀释成50nM，作为待滴定液；取金属配位聚合物贮备液用100μM Tris-HCl缓冲溶液稀释成500μM(含50nM P₃-DNA)作为滴定液。取P₃-DNA待滴定液2mL于荧光比色皿中，将滴定液按体积梯度加入比色皿中，记录体系荧光强度的变化(λ_ex＝480nm)直到荧光淬灭达到饱和，计算荧光淬灭效率Q_E％。该铜金属配位聚合物对荧光标记的P₃-DNA的荧光淬灭率为91.4％。

(4)复合体系在对待检T₃-RNA序列的识别检测

在上述实验基础上，将稀释后的待检T₃-RNA溶液(10μM)加入到荧光淬灭达到饱和的复合体系中，使T₂-RNA在体系中达到最小浓度25nM，监测荧光强度随时间的变化，确定体系荧光复苏达到最大值的时间作为检测T₃-RNA的反应时间R_T。以复合体系检测T₃-RNA的反应时间R_T为标准，记录复合体系荧光强度随T₃-RNA浓度增加而复苏的程度，直到荧光复苏达到饱和，计算荧光复苏率R_E和检测限。铜金属配位聚合物与荧光标记的P₃-DNA形成复合体系对登革热2型病毒核酸序列检测反应时间为20min，荧光复苏率R_E为3.6，检测限为51pM。该结果表明本发明所述的两性羧酸三维铜金属配位聚合物对登革热2型病毒核酸序列具有较好的检测作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种两性羧酸三维金属配位聚合物及其制备方法和应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agaaaaaaga agaa 14

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<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcttctttt ttct 14

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaugaggaca aacuuuuuaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaaaaagtt tgtcctcatc 20

<210> 5

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

uggugcuguu gaaucaacag guucu 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agaacctgtt gattcaacag cacca 25