本发明涉及一种产胆盐水解酶的重组毕赤酵母，属于基因工程技术领域。
背景技术：
胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是降解胆汁的主要组成成份——共轭胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共轭胆酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐水解酶的生理作用体现在两个方面：一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和降低胆固醇水平等；二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。
利用基因工程的手段来研究胆盐水解酶的过量表达，可以提高胆盐水解酶的水解活性以及产量。这为研究胆盐水解酶的酶学性质提供了一定的基础。另外，纯化后的胆盐水解酶可应用于研究酶的动力学性质以及酶与底物的作用机制。
技术实现要素：
本发明提供一种产胆盐水解酶的重组毕赤酵母，是以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQ ID NO.1所示胆盐水解酶基因。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母包括pichia pastoris GS115、pichia pastoris KM71、pichia pastoris X-33、pichia pastoris SMD1168。
在本发明的一种实施方式中，所述胆盐水解酶基因前还融合了SEQ ID NO.2所示信号肽。
本发明的第二个目的是提供一种产胆盐水解酶的重组毕赤酵母的构建方法，所述方法是以pPIC9K为载体，在毕赤酵母中表达SEQ ID NO.1所示基因。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：合成SEQ ID NO.1所示基因序列，合成SEQ ID NO.2所示信号肽序列，将上述序列融合并与载体pPIC9K连接形成重组质粒，再转化至毕赤酵母中得到重组毕赤酵母。
本发明的第三个目的提供一种胆盐水解酶胞外分泌表达的方法，是使用上述方法构建的重组毕赤酵母进行发酵，表达胆盐水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以1～5％体积比接种重组毕赤酵母至培养基中，20～28℃，200～220rpm下培养；所述培养基为BMMY培养基，配方为：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
本发明还要求保护所述重组毕赤酵母在食品、医药、保健品领域制备含胆盐水解酶的产品中的应用。
有益效果：本发明采用重组DNA技术将植物乳杆菌来源的胆盐水解酶基因bsh与信号肽α-MF融合并与载体pPIC9K连接，并转化至毕赤酵母GS115中，获得产胆盐水解酶的重组毕赤酵母。将本发明构建的重组毕赤酵母接种至发酵培养基中，20～28℃发酵5～7d，酶活可达到8.17U/mL。这为胆盐水解酶的大规模生产及其作为功能食品来降低血清胆固醇奠定了良好的基础。
附图说明
图1为重组毕赤酵母产胆盐水解酶的酶活。
具体实施方式
LB培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
YPD培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
MD培养基：YNB 13.4g/L、葡萄糖20g/L、生物素4×10-4g/L。
BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
胆盐水解酶酶活测定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为：0.5mL 1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液)，1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的柠檬酸缓冲液。
具体实施方式中选用牛磺脱氧结合胆盐测定酶活。
实施例1重组质粒的构建及鉴定
通过化学合成获得序列如SEQ ID NO.1所示序列，设计引物，通过融合PCR将SEQ ID NO.1所示序列与信号肽α-MF连接，柱回收产物获得融合片段。将融合片段αMF-bsh和pPIC9K质粒16℃过夜连接。连接产物pPIC9K-αMF-bsh化学法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。将转化液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，提取质粒测序验证构建的重组质粒。
实施例2产胆盐水解酶的重组毕赤酵母的构建
将重组质粒pPIC9K-αMF-bsh线性化，电击转化至Pichia pastoris GS115感受态细胞，具体方法如下：
(1)接种YPD平板活化的pichia pastoris GS115于25mL/250mL三角瓶，30℃过夜培养；以1％(按体积比)接种上述培养液于含50mL/500mL培养基的三角瓶，培养菌体浓度OD600为1.3～1.5；
(2)5000r/min，4℃离心10min收集菌体，分别用50mL、25mL无菌水悬浮细胞；
(3)5mL 1M山梨醇重悬上述细胞，5000r/min，4℃离心10min收集菌体；
(4)500μL 1M山梨醇重悬上述细胞，分装80μL/1.5mL EP管用于电转化感受态细胞；5)20μL线性化质粒与上述80μL感受态细胞混合，冰上静置15min；
(5)上述混合物加入预冷的无菌电转化杯(0.2cm)，1500V、25μF、200Ω电击一次，加入1mL1M山梨醇；
(6)取上述混合物150μL涂布MD平板，30℃培养3天；
(7)挑取阳性克隆，分别点种在含1、2、3、4mg/mL遗传霉素的YPD平板中，挑选在4mg/mL遗传霉素平板中的单菌落用于摇瓶发酵。
实施例3重组毕赤酵母的培养和摇瓶发酵
将本发明构建的工程菌作为生产菌株，以未连接信号肽的重组毕赤酵母菌为对照，在YPD平板活化。种子液培养，接种50mL/250mL种子培养基，30℃，220r/min培养24h。离心种子液，按发酵培养基中种子终浓度为OD600＝1接种发酵培养基，20～28℃，220r/min培养7d。每隔24h取样测胆盐水解酶的酶活。结果显示，未连接信号肽的重组毕赤酵母胞外胆盐水解酶分泌量仅为0.02U/mL，本发明构建的含有信号肽α-MF的重组毕赤酵母发酵5d，胆盐水解酶胞外酶活提高至7.92U/mL，发酵168h可达8.17U/mL(图1)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 曹书华
<120> 一种产胆盐水解酶的重组毕赤酵母
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<170> PatentIn version 3.3
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