含有二氢哒嗪结构的7‑氮杂吲哚类化合物及其应用的制作方法

本发明涉及新的吲哚类化合物，具体地指一种含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物及其应用。

背景技术：

恶性肿瘤是一种严重危害人类健康和生命的疾病。人类恶性肿瘤引起的死亡率仅次于心血管，排列在第二位。目前全世界每年约诊断出1000万肿瘤患者，700万人死于由肿瘤引起的相关疾病，中国每年约有180万人死于癌症，占全球1/4。

c-Met激酶是肝细胞生长因子受体，是酪氨酸激酶受体家族成员之一，人的c-Met基因位于第7号染色体长臂(7q31)，约110kb，含21个外显子。成熟的c-Met由5.0×10⁴的α亚基和1.4×10⁵的β亚基组成异二聚体，胞外区为α链，胞内区为β链，两条链通过二硫键相连。活化区的Tyr1234和Tyr1235的磷酸化能激活c-Met激酶。

c-Met激酶广泛存在于上皮组织中，在胚胎发育和创伤愈合中发挥着重要的作用。最近研究表明，c-Met激酶在肺癌、结肠癌、肝癌、直肠癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤组织中呈现异常的高表达、突变或活性改变。c-Met激酶能够促进肿瘤细胞的增殖，调节肿瘤细胞的迁移，增强肿瘤细胞的侵袭能力并诱发肿瘤新生血管的生成。

目前，c-Met激酶已经成为抗肿瘤药物研究的一个重要靶点。Discovery of orally active pyrrolopyridine-and aminopyridine-based Met kinase inhibitors.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2008,18,3224–3229；Discovery of Pyrrolopyridine-Pyridone Based Inhibitors of Met Kinase:Synthesis,X-ray Crystallographic Analysis,and Biological Activities.J.Med.Chem.2008,51, 5330–5341等文献报道了如式1中所示的一系列7-氮杂吲哚类化合物的合成及其药理活性研究，表明含7-氮杂吲哚结构的c-Met激酶抑制剂对恶性肿瘤具有明显的抑制作用。

为了研制出新型高效的抗肿瘤药物，本发明人对7-氮杂吲哚类化合物进行了广泛研究，对多个结构位点进行修饰和改造，合成了一系列结构新颖的含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类衍生物。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物及其应用。

本发明提供如通式I所示的含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物、其几何异构体及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，通式I如下：

其中：

R₁为氢、甲基、乙基或氰基；

R₂选自1～4个相同或不同的氢或氟；

X为O或S；

R₃、R₄为1～2个选自氢、卤素、(C₁～C₆)烷基、(C₁～C₆)烷氧基、被卤代的(C₁～C₄)烷基或(C₁～C₄)烷氧基、(C₁～C₆)烷基硫基、被单或双(C₁～C₆烷基)取代的氨基、(C₁～C₆)烷基酰氨基、(C₁～C₆)烷基亚磺酰基、(C₁～C₆)烷基酰基、被单或双(C₁～C₆烷基)取代的氨基甲酰基、(C₁～C₃)亚烷基二氧基。

本发明优选涉及如上述通式I的化合物、其几何异构体、或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药，其中：

R₁为氢或甲基；

R₂为F，其取代位为苯环上与X所连碳原子的邻位；

X为O；

R₃为CH₃或CF₃，

R₄为1～2个选自氟、氯、甲基、甲氧基、三氟甲基或三氟甲氧基。

本发明中，所述通式I的含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物特别优选下列化合物中的一种，但这些化合物并不意味着对本发明的任何限制：

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(2,4-二氯苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

1-(2,5-二甲基苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

1-(4-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

1-(3,4-二氟苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

1-(3-溴苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(2-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(4-甲氧基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(2,5-二甲基苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(2-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(3,4-二氟苯基)-4- 甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(3-氯-4-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(3-溴苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(4-(甲氧基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(2-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

1-(3-氯-4-氟苯基)-N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

1-(2,4-二氯苯基)-N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺、

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺。

而且，按照本发明所属领域的一些通常方法，本发明通式I的含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物可以与酸生成它的药学上可接受的盐。酸可以包括无机酸或有机酸，与下列酸形成的盐是特别优选的：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、马来酸、柠檬酸、富马酸、洒石酸、苯磺酸、苯 甲酸或对甲苯磺酸等。

此外，本发明还包括本发明化合物的前药。依据本发明，前药是通式I化合物的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

除非另外指出，本发明所用的术语“卤代”是指氟代、氯代、溴代或碘代；“烷基”是指直链或支链的烷基；“环烷基”是指取代或未取代的环烷基；“烯基”是指直链或支链的烯基；“炔基”是指直链或支链的炔基；“芳基”是指除去芳烃中的一个氢原子而得的有机基团，如苯基、萘基；5-10元杂芳基包括含有一个或多个选自N、O和S的杂原子，其中每个杂芳基的环状体系可以是单环或多环的，环状体系是芳香性的，一共含有5-10个原子，可以举出例如咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、(1，2，3)和(1，2，4)-三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、吡唑基、吡咯基、噻唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、吲哚基、喹啉基等；5-10元杂环基包括含有一个或多个选自N、O和S的杂原子，其中每个杂芳基的环状体系可以是单环或多环的，但是是非芳香性的，环状体系一共含有5-10个原子，可以任选包括1或2个碳碳双键或碳碳叁键，可以举出例如吡咯烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、噻唑啉基等。

下面合成路线1～3描述了本发明的通式I化合物的制备，所有的原料都是通过这些化学式中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终化合物都是通过这些化学式中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些化学式中应用的全部可变因数如下文的定义或如前述内容中的定义。

按照本发明的通式I化合物，X、R₁、R₂、R₃和R₄如前述内容部分所定义，均可按在路线1的方法由中间体A和中间体B通过取代反应制得。

按照本发明的式I化合物，X为O，其他取代基如前述内容所定义，中间体A的制备方法如路线2所示：

当X为S时，化合物A的制备可由路线2的中间体a与R₂取代的4-硝基苯硫酚经取代、还原两步反应制得。

按照本发明的式Ⅰ化合物，中间体B的制备方法如路线3，其他取代基如前述内容所定义。

以上三条路线中所有中间体的取代基R₁、R₂、R₃、R₄如前述内容中所定义。

本发明可以含有上述通式I含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物，及其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物作为活性成份，与药学上可接受的载体或赋型剂混合制备成组合物，并制备成临床上可接受的剂型，上述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本发明的衍生物可以与其他活性成份组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。

本发明上述通式I含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物用于患者的临床剂量可以根据：活性成分在体内的治疗功效和生物利用度、它们的代谢和排泄速率和患者的年龄、性别、疾病期来进行适当调整，不过成人的每日剂量一般应当为10～500mg，优选为50～300mg。因此，当本发明的药物组合物被制成单位剂型时，考虑到上述有效剂量，每单位制剂应当含有10～500mg上述通式I含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物，优选为50～300mg。按照医生或药师的指导，这些制剂可以以一定间隔分若干次给 药(优选为一至六次)。

本发明的药用组合物可配制成若干种剂型，其中含有药物领域中一些常用的赋形剂。如上所述的若干种剂型可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物。

用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂、防腐剂、加溶剂和基质等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。

本发明还涉及通式I的化合物具有强的抑制c-Met激酶的作用，并且还涉及该类化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或前药在制备治疗由于c-Met激酶异常高表达所引起疾病的药物中的用途，特别是在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。

本发明的活性化合物或其可药用盐及其溶剂化物可作为唯一的抗增生性药物单独使用，或者可以与现已上市的抗增生性药物联合使用，用于治疗和/或预防增生性疾病，如牛皮癣、良性前列腺肥大、动脉粥样硬化和再狭窄。

本发明还发现上述含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。本发明化合物体外具有抑制肿瘤细胞生长活性，因此，它可以用作制备治疗和/或预防癌症的药物，如乳腺、肺、肝脏、肾脏、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、子宫、胰腺、骨髓、睾丸、卵巢、淋巴、软组织、头颈、甲状腺、食道的癌和白血病、成神经细胞瘤等。

通过对c-Met激酶活性测试发现，本发明化合物具有显著的抑制c-Met激酶活性，对c-Met高表达的肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌等有较强的抑制作用，特别用于制备治疗和/或预防肺癌的药物。

本发明的活性化合物或其可药用盐及其溶剂化物可作为唯一的抗肿瘤药物单独使用，或者可以与现已上市的抗肿瘤药物(如铂类药物顺铂、喜 树碱类药物伊立替康、长春花碱类药物诺维本、脱氧胞昔类药物吉西他滨、足叶乙甙、紫杉醇等)联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明构成限定。

实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。化合物的核磁共振氢谱用BrukerARX-300测定，质谱用Agilent1100LC/MSD测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。

通式I含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物：

本发明按照制备通式I的方法，分别制得实施例1～30化合物，结构式如下表1所示。

表1实施例1～30的结构式

实施例1

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

步骤一：4-(4-硝基苯氧基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶(b)

在250mL的三颈瓶中，将二苯醚(51.843g，0.3mol)预热至全部溶解，然后依次加入4-氯-7-氮杂吲哚(9.996g，0.066mol)和4-硝基苯酚(16.862g，0.107mol)，升温至190℃反应约1h，期间会有大量固体无法搅拌，温度升至130℃左右时固体溶解，溶液呈现淡黄色，随温度升高，溶液颜色加深，外观为深褐色，取样点板时仍为淡黄色。反应液冷却后，缓慢滴加到400mL乙酸乙酯中搅拌2h，析出的固体抽滤，滤饼干燥，得土黄色粉末8.285g，即4-(4-硝基苯氧基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(b)，收率为46.3％。

步骤二：4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基氧基)苯胺(A)

将步骤一制得的4-(4-硝基苯氧基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶(b)(5.102g，0.0187mol)加至乙醇(100mL)，搅拌条件下依次加入三氯化铁(2.687g，0.00994mol)和活性炭(8.440g,0.703mol)，升温至50℃左右时逐滴加入水合肼(9.445g，0.1887mol)。滴加完成后升温至80℃回流约10min。反应液冷却，抽滤，滤液旋蒸，蒸干后加75mL水超声，析出大量黄色固体，抽滤，滤饼干燥后得黄色粉末2.432g，即4-((1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-基氧基)苯胺(A)，产率为53.6％。

步骤三：顺乙基-3-氧代-2-(苯基亚肼基)丁酸乙酯(e)

在500mL的三口瓶中加入50mL水和200mL的乙醇混合溶液，加入无水乙酸钠搅拌至溶解后加入乙酰乙酸乙酯，室温搅拌2h，备用。在另一250mL三口瓶中加入苯胺和50mL水，室温下滴加浓盐酸，滴毕后降温至-5℃时滴加亚硝酸钠的水溶液，保持溶液温度低于0℃，滴毕后在0℃下反应30min，若溶液内有固体则补加少量的水，使得重氮盐溶液保持澄清。将乙酰乙酸乙酯的混合溶液降温至溶液温度在0℃以下，装上机械搅拌，将上述所得的重氮盐溶液缓慢滴入，保持溶液温度在0℃以下，随着重氮盐溶液的滴入，反应液内会有大量的黄色固体产生，滴毕后补加100mL水，后在0℃以下反应2h。将上述反应液中所得的黄色固体抽滤，滤饼用水洗涤，干燥，得到17g产品，即顺乙基-3-氧代-2-(苯基亚肼基)丁酸乙酯(e)，收率约95％以上。

步骤四：乙基-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-羧酸乙酯(f)

将步骤三制得的中间体e(5g，0.033mol)、乙氧羰基亚甲基三苯基磷(9.39g，0.027mol)和Et₂NH(0.28mL，0.0027mol)在室温下加入到DMSO中，升温至85℃反应4h。中间体e反应不完。将反应液冷却到室温后倒入水中，用DCM萃取，有机层再次用饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥。抽滤，蒸干DCM得到棕色油状物，得到乙基-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-羧酸乙酯(f)，收率85％。

步骤五：乙基-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-羧酸(g)

将中间体f溶于50mL乙醇中，室温下滴加10％NaOH使得溶液的PH值至12后，升温至60℃反应4h。将反应液蒸除大部分以后加入大量的水，水溶液用乙酸乙酯萃取，分出水层，水层用6M的稀盐酸调节PH值至2～3后，用DCM萃取水层，DCM溶液用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得到黄色固体，即乙基-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-羧酸(g)，收率70％。

步骤六：乙基-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰氯(B)

将中间体g(0.01mol)加入到30mL的甲苯中，加入SOCl₂(6mL)和吡啶(5d)升温至85℃反应6h。将反应液冷却到室温以后，减压蒸除甲苯和SOCl₂，得到油状液体酰氯，即乙基-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰氯(B)，收率50％

步骤七：N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

将中间体A(0.05g，0.00021mol)和N,N-二异丙基乙胺(0.5mL，0.003mol)加至10mL二氯甲烷中，将中间体B(0.2g，0.00073mol)溶于5mL二氯甲烷中，0℃下滴加至上述二氯甲烷溶液中，滴加完毕，缓慢升至室温，反应1～2小时。反应完毕后，加入5mL5％的氢氧化钠水水溶液，搅拌半小时，转移至250mL分液漏斗中，再加入25mL二氯甲烷，用饱和碳酸钠水溶液洗三次(50mL*3)，饱和食盐水洗一次，减压蒸去二氯甲烷，得淡黄色固体粉末0.05g，收率46.14％。

ESI-MS m/z:532.1；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.22(s,1H),11.56(s,1H),9.04(s,1H),8.26(s,1H),7.79(d,J＝6.8Hz,2H),7.63(d,J＝7.8Hz,1H),7.56(d,J＝7.0Hz,2H),7.40(s,2H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),6.94(s,1H),6.66(s,1H),6.61(s,1H),2.68(s,3H).

按照实施例1的方法，首先以R₁取代的4-氯-7-氮杂吲哚与R₂取代的4-硝基苯酚，经步骤一取代、步骤二还原反应得到中间体A；R₄取代的苯胺先重氮化再与R₃取代的乙酰乙酸乙酯经步骤三偶和、步骤四环加成、步骤五水解、步骤六酰氯化反应得到中间体B；之后由中间体A和中间体B通过步骤七取代反应，分别制得实施例2～30化合物。

实施例2

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:451.2；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.20(s,1H),11.64(s,1H),8.23(d,J＝6.3Hz,1H),7.71(d,J＝6.7Hz,2H),7.48–7.37(m,3H),7.32(d,J＝6.7Hz,2H),7.14(s,1H),6.99(s,1H),6.95(s,1H),6.71(d,J＝4.6Hz,1H),6.61(s,1H),2.70(s,1H),2.22(s,1H).

实施例3

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:455.1.

实施例4

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:455.1.

实施例5

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(2,4-二氯苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:505.1；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.64(s,1H),11.64(s,1H),8.25(s,1H),7.78(d,J＝7.5Hz,2H),7.63(s,1H),7.46–7.38(m,2H),7.21(d,J＝7.2Hz,2H),7.17(s,1H),6.95(s,1H),6.65(d,J＝6.7Hz,1H),6.61(s,1H),2.70(s,3H).

实施例6

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:533.1.

实施例7

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:505.1.

实施例8

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:521.1；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.70(s,1H),12.04(s,1H),8.18(d,J＝9.5Hz,1H),7.99(d,J＝6.5Hz,1H),,7.70(d,J＝7.7Hz,1H),7.61(d,J＝6.5Hz,2H),7.54(d,J＝6.6Hz,1H),7.49(d,J＝8.3Hz,2H),7.37(s,1H),7.23(d,J＝7.5Hz,2H),6.73(d,J＝5.2Hz,1H),6.52(s,1H),2.28(s,3H).

实施例9

4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(邻甲苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:465.2.

实施例10

1-(2,5-二甲基苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:480.2

实施例11

1-(4-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:469.2；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.07(s,1H),8.97(s,1H),7.82(d,J＝10.4Hz,2H),7.63(d,J＝7.6Hz,2H),7.54(d,J＝6.1Hz,2H),7.08(t,J＝8.3Hz,2H),6.94(s,1H),6.87(s,1H),6.67(s,1H),6.62(s,1H),4.34(s,3H),2.51(s,3H).

实施例12

1-(3,4-二氟苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:487.1.

实施例13

1-(4-溴-2-氟苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:547.1；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.64(s,1H),8.13(d,J＝5.4Hz,1H),7.85(d,J＝9.7Hz,1H),7.78(d,J＝8.8Hz,2H), 7.71-7.63(m,2H),7.41(d,J＝3.3Hz,1H),7.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.10(s,1H),6.45(d,J＝5.4Hz,1H),6.18(d,J＝3.4Hz,1H),3.80(s,3H),2.40(s,3H).

实施例14

1-(3-溴苯基)-4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:529.1.

实施例15

4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(2-(三氟甲氧基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:535.1.

实施例16

4-甲基-N-(4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-6-氧代-1-(4-甲氧基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:481.2.

实施例17

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(2,5-二甲基苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:483.2.

实施例18

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(2-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:473.1；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.39(s,1H),10.90 (s,1H),8.21(d,J＝5.7Hz,1H),8.11(d,J＝3.6Hz,1H),8.00(d,J＝12.8Hz,1H),7.75(d,J＝11.7Hz,1H),7.57-7.43(m,3H),7.34(d,J＝8.2Hz,2H),7.15(s,1H),6.91(d,J＝4.2Hz,1H),6.70(d,J＝5.4Hz,1H),2.47(s,3H).

实施例19

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(3,4-二氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:491.1；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.34(s,1H),11.76(s,1H),9.17(s,1H),8.21(d,J＝12.6Hz,1H),7.94(d,J＝13.4Hz,1H),7.56(d,J＝8.2Hz,1H),7.43(d,J＝7.9Hz,2H),7.32(d,J＝7.9Hz,2H),6.87(s,1H),6.68(d,J＝13.3Hz,1H),6.55(s,1H),2.55(s,3H).

实施例20

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(3-氯-4-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:507.1.

实施例21

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(3-溴苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:533.1.

实施例22

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:523.2；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.83(s,1H),12.16(s,1H),8.12-8.04(m,3H),7.89(d,J＝7.6Hz,1H),7.80(s,1H),7.75(d,J＝7.5Hz,1H),7.63(d,J＝10.6Hz,1H),7.54(d,J＝9.4Hz,1H),7.40(s,1H), 7.31(d,J＝8.3Hz,1H),6.72(d,J＝5.7Hz,1H),6.57(s,1H),2.26(s,3H).

实施例23

N-(4-((1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)-3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(4-(甲氧基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:485.2.

实施例24

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-苯基-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:469.2.

实施例25

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(2-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:487.1.

实施例26

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-1-(3-氟苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:487.1.

实施例27

1-(3-氯-4-氟苯基)-N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:521.1.

实施例28

1-(2,4-二氯苯基)-N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:537.1.

实施例29

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(2-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:537.1.

实施例30

N-(3-氟-4-((1-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)氧基)苯基)-4-甲基-6-氧代-1-(3-(三氟甲基)苯基)-1,6-二氢哒嗪-3-甲酰胺

ESI-MS m/z:537.1；¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆))δ12.82(s,1H),8.29(d,J＝5.0Hz,1H),8.08(d,J＝12.1Hz,2H),7.89(d,J＝7.6Hz,1H),7.84-7.72(m,2H),7.63(d,J＝7.8Hz,1H),7.54(d,J＝7.0Hz,1H),7.30(s,1H),7.20(d,J＝1.7Hz,1H),6.71(d,J＝6.1Hz,1H),6.65(s,1H),4.31(s,3H),2.26(s,3H).

本发明产物的药理研究

体外抗肿瘤细胞活性

对按照本发明的通式Ⅰ的含有二氢哒嗪结构的7-氮杂吲哚类化合物进行了体外抑制肺癌细胞H460、结肠癌细胞HT-29、人胃癌细胞MKN-45、肺腺癌细胞A549和膀胱癌细胞U-87MG活性筛选。

(1)细胞复苏并传代2～3次稳定后，用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其从培养瓶底部消化下来。将细胞消化液倒入离心管中后，之后加入培养液以终止消化。将离心管在800r/min下离心10min，弃去上清液后加入5mL培养液，吹打混匀细胞，吸取10μL细胞混悬液加入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为10⁴个/孔。96孔板中除A1孔为空白孔不加细胞外，其余皆加入100μL 细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。

(2)用50μL二甲基亚砜溶解受试样品，然后加入适量培养液，使样品溶解成2mg/mL药液，然后在24孔板中将样品稀释为20、4、0.8、0.16、0.032μg/mL。

每个浓度加入3孔，其中周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只和为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中培养72h。

(3)将96孔板中带药培养液弃去，用磷酸缓冲溶液(PBS)将细胞冲洗两遍，在每孔中加入MTT(四氮唑)(0.5mg/mL)100μL放入培养箱中4h后，弃去MTT溶液，加入二甲基亚砜100μL。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与MTT反应产物甲充分溶解，放入酶标仪中测定结果。通过Bliss法可求出药物IC₅₀值。

化合物的抑制肺癌细胞H460、结肠癌细胞HT-29、人胃癌细胞MKN-45、肺腺癌细胞A549和膀胱癌细胞U-87MG活性结果如表2所示。

c-Met酶活性试验

用于测量c-Met激酶活性的试验基于酶联免疫吸附试验(ELISA)。具体操作是：

室温下，在0.25mg/mL PGT包被的板上，将实施例化合物、50pM c-Met(His-标记的重组人Met(氨基酸974-末端)，通过杆状病毒表达和5μM ATP在试验缓冲液中(25mM MOPS,pH 7.4,5mM MgCl₂,0.5raM MnCl₂,100μM原钒酸钠，0.01％Triton X-100，1mM DTT，最后DMSO浓度1％(v/v))温育20分钟。通过冲洗除去反应混合物并用0.2μg/mL缀合辣根过氧化物酶(HRP)的磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体(PY20)检测磷酸化聚合物底物。加入1M磷酸终止显色后，于450nm处通过分光光度法定量显色的底物(TMB)的颜色。实施例化合物对c-Met激酶的抑制数据如表2所示。

表2：

从上述试验结果可以清楚地看出，本发明所要保护的通式Ⅰ的化合物， 具有良好的体外抗肿瘤活性，相当或优于已上市的抗肿瘤药物顺铂。

本发明中通式Ⅰ的化合物可单独施用，但通常是和药用载体混合物给予，所述药用载体的选择要根据所需用药途径和标准药物实践，下面分别用该类化合物的各种药物剂型，例如片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂和软膏剂的制备方法，说明其在制药领域中的新应用。

应用例1：片剂

以实施例1化合物10g，按照药剂学一般压片法加辅料20g混匀后，压制成100片，每片重300mg。

应用例2：胶囊剂

以实施例10化合物10g，按照药剂学胶囊剂的要求将辅料20g混匀后，装入空心胶囊，每个胶囊重300mg。

应用例3：注射剂

以实施例13化合物10g，按照药剂学常规方法，进行活性炭吸附，经0.65μm微孔滤膜过滤后，填入氮气罐制成水针制剂，每只装2mL，共灌装100瓶。

应用例4：气雾剂

以实施例20化合物10g，用适量丙二醇溶解后，加入蒸馏水及其他辐料后，制成500mL的澄清溶液即得。

应用例5：栓剂

以实施例19化合物10g，将之研细加入甘油适量，研匀后加入已熔化的甘油明胶，研磨均匀，倾入已涂润滑剂的模型中，制得栓剂50颗。

应用例6：膜剂

以实施例28化合物10g，将聚乙烯醇、药用甘油、水等搅拌膨胀后加热溶解，80目筛网过滤，再将实施例18化合物加入到滤液中搅拌溶解，涂膜机制膜100片。

应用例7：滴丸剂

以实施例17化合物10g，与明胶等基质50g加热熔化混匀后，滴入低温液体石蜡中，共制得滴丸1000丸。

应用例8：外用搽剂

以实施例21化合物10g，按照常规药剂学方法与乳化剂等辅料2.5g混合研磨，再加蒸馏水至200mL制得。

应用例9：软膏剂

以实施例26化合物10g，研细后与凡士林等油性基质500g研匀制得。

尽管已经通过特定实施方案描述了本发明，但修改和等价变化对于精通此领域的技术人员而言是显见的，且它们都包含在本发明范围之内。