本公开涉及产生L-亮氨酸的微生物以及使用该微生物产生L-亮氨酸的方法。
背景技术：
带支链的氨基酸指三种氨基酸(即L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸)，并且已知它们主要在肌肉中被代谢并在身体活动期间用作能量源。随着对这些带支链的氨基酸在身体活动期间维持和增加肌肉质量的重要作用的认识提高，其用途也在增加。特别地，L-亮氨酸是必需氨基酸，其广泛用于医药、食品、饲料添加剂、工业化学品等。
同时，这些带支链的氨基酸主要由埃希氏杆菌(Escherichia)属或棒状杆菌(Corynebacterium)属的微生物产生，并且其已知是从丙酮酸经过几个步骤后由前体2-酮异己酸生物合成的(韩国专利第10-0220018号和第10-0438146号)。然而，参与亮氨酸生物合成的酶具有以下问题：它们受到由终产物即L-亮氨酸或其衍生物引起的反馈抑制，因此难以进行L-亮氨酸的大规模工业化生产。
技术实现要素：
技术问题
本公开的发明人已经致力于开发与常规菌株相比以更高产率产生L-亮氨酸的微生物。结果，发明人发现了使用产生谷氨酸的微生物获得的突变体对正亮氨酸(NL)(即亮氨酸衍生物)具有耐受性，并且L-亮氨酸或其衍生物的反馈抑制在这些突变体中被解除，从而以高产率产生L-亮氨酸，由此完成本公开。
技术方案
本公开的目的是提供具有新的产生L-亮氨酸能力的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变体。
本公开的另一个目的是提供使用谷氨酸棒状杆菌突变体产生L-亮氨酸的方法。
本发明的有益效果
谷氨酸棒状杆菌属微生物是对L-亮氨酸或其衍生物具有耐受性的微生物，因此可以防止反馈抑制并且与其亲株相比具有提高的L-亮氨酸产生能力。因此，使用本公开的微生物产生L-亮氨酸的方法可以高效且高产率地产生L-亮氨酸。
附图说明
图1是说明本公开的终产物L-亮氨酸的生物合成途径的流程图。
最佳实施方式
本公开的方面提供了新的产生L-亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变体(经修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株)，具体地，其是以登记号KCCM11661P保藏的突变体和以登记号KCCM11662P保藏的产生L-亮氨酸的突变体。
如本文所使用的，术语“L-亮氨酸”是必需氨基酸，其指由式HO2CCH(NH2)CH2CH(CH3)2表示的L-氨基酸，L-亮氨酸以及L-缬氨酸和L-异亮氨酸在结构上对应于带支链的氨基酸。
同时，关于微生物中L-亮氨酸的生物合成，已知L-亮氨酸是通过图1所示的生物合成过程从丙酮酸经由乙酰乳酸、二羟基异戊酸、酮异戊酸、2-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸和酮异己酸而生物合成的。此外，L-亮氨酸是通过使用酶催化生物合成过程而生物合成的，所述酶例如乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶、异丙基苹果酸合酶、异丙基苹果酸脱水酶、异丙基苹果酸脱氢酶和转氨酶B。然而，由于在带支链的氨基酸(即L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸)的生物合成过程中，在所述途径中使用的酶是相同的，因此难以在工业上通过发酵仅产生一种类型的带支链的氨基酸。另外，由于终产物(即L-亮氨酸或其衍生物)反馈抑制的发生，在工业上大规模产生L-亮氨酸存在问题。在这点上，本公开的突变体可以对L-亮氨酸或其衍生物具有耐受性。
如本文所使用的，术语“衍生物”可以指已知能够通过诱导与本公开的终产物L-亮氨酸的生物合成相关的反馈抑制来抑制微生物的产生L-亮氨酸能力的化合物。所述化合物的实例可以包括异亮氨酸、叔亮氨酸、正亮氨酸、环亮氨酸等，但不限于此。具体地，突变体可以对选自亮氨酸、异亮氨酸、叔亮氨酸、正亮氨酸和环亮氨酸的至少一种物质具有耐受性，更具体地，对正亮氨酸具有耐受性。一般而言，已知当L-亮氨酸在细胞中累积超过一定水平时，L-亮氨酸生物合成受到抑制。因此，对衍生物具有耐受性的任何菌株都可以解除由L-亮氨酸导致的抑制，并且即使在高L-亮氨酸浓度的情况下也可以产生L-亮氨酸。
本公开的产生L-亮氨酸的微生物的期望突变体可以通过其亲株的诱变而获得。特别地，微生物的诱变可以通过本领域众所周知的各种方法进行，可以使用物理诱变或化学诱变。例如，适用于本公开的化学诱变剂的实例可以包括N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、芥子化合物、肼和亚硝酸盐，但化学诱变剂不限于此。另外，物理诱变剂的实例可以包括紫外线和γ射线，但物理诱变剂不限于此。
当诱导诱变时，亲株受可以留下特定大小的亲株存活群体的浓度的诱变剂的影响。群体大小随着诱变剂的类型而变化，并且取决于以恒定杀灭率在存活群体内诱导的突变量。例如，在NTG的情况下，杀灭率为可以使约10％至50％的初始群体存活。用亚硝酸诱变可以使约0.01％至0.1％的初始群体存活，通过紫外光诱变可以使约1.0％的初始群体存活，但诱变剂不限于此。
本公开的另一个方面提供了产生L-亮氨酸的方法，其包括培养谷氨酸棒状杆菌突变体并从谷氨酸棒状杆菌突变体或其培养物中回收L-亮氨酸。
如本文所使用的，术语“培养”是指微生物在适当的、人工控制的环境条件下生长。本公开的微生物的培养可以使用本领域广泛已知的用于培养谷氨酸棒状杆菌的方法进行。具体地，培养方法的实例可以包括分批培养、连续培养和补料分批培养，但培养方法不限于此。例如在“Biochemical Engineering”(James M.Lee,Prentice-Hall International Editions,第138至176页,1991)等中公开了这些不同的方法。
如本文所使用的，术语“培养物”是指含有培养基的材料，其中微生物在适当的、人为控制的环境条件下正在生长或已经生长。培养物狭义上不包括生长的微生物，但广义上可以包括它。“培养物”包括由微生物在其生长过程中释放到培养基中的各种物质以及构成以培养微生物的培养基成分，特别包括目标物质亮氨酸。
用于培养的培养基必须满足以适当的方式培养特定菌株的要求。公开了棒状杆菌菌株的培养基的实例(例如，Manual of Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology.美国华盛顿,1981)。要使用的碳源的实例可以包括糖类和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；有机酸，例如乙酸，但碳源不限于此。这些材料可以单独使用或组合使用。要使用的氮源的实例可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素；或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，但氮源不限于此。氮源可以单独使用或组合使用。要使用的磷源的实例可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或其相应的含钠盐，但是磷源不限于此。此外，培养基可以包括生长所需的金属盐，例如硫酸镁和硫酸铁。除上述物质外，还可包括必需的生长物质，例如氨基酸和维生素。适当的前体也可以用于培养基中。上述材料可以在培养过程中以适当的方式通过分批培养或连续培养添加到培养基中。
同时，可以使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，或者酸性化合物例如磷酸和硫酸以适当的方式调节培养物的pH。此外，使用例如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂可以防止气泡的产生。为了保持好氧条件，将氧气或含氧气体(例如空气)注入培养物中。通常，培养基的温度可以为20℃至45℃。继续培养直至L-亮氨酸产量达到其最高水平，这通常在10小时至160小时内达到。L-亮氨酸可以释放到培养基中或包含在细胞内。
从细胞或培养基中回收L-亮氨酸的方法可以通过本领域已知的常规方法进行，所述方法例如离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，但方法不限于此。
具体实施方式
在下文中，将通过示例性实施方案详细描述本公开。然而，提供这些示例性实施方案仅仅是为了说明目的，而不旨在限制本公开的范围。
实施例1：选择通过人工诱变获得的突变体
为了获得产生L-亮氨酸的微生物突变体，通过以下方法诱导微生物的修饰。
具体地，将通过在活化培养基中培养16小时而活化的亲株(即产谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067和谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869)接种到种子培养基中，并在其中培养14小时，所述培养基在121℃下灭菌15分钟。然后，收集5mL培养基并用100mM柠檬酸盐缓冲液洗涤，并向其中加入N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)至最终浓度为200mg/L。处理20分钟后，用100mM磷酸盐缓冲液洗涤培养基。使用NTG处理的菌株在基本培养基上铺展并测量死亡率。结果，确认死亡率为85％。为了选择对正亮氨酸(NL)具有耐受性的修饰菌株，使NTG处理的菌株在含有最终浓度分别为20mM、30mM、40mM和50mM的NL的基本培养基上铺展，正亮氨酸对应于L-亮氨酸的衍生物。然后，将菌株在30℃下培养5天，从而获得对NL具有耐受性的突变体。
由此获得的突变体分别命名为谷氨酸棒状杆菌KCJ-24和谷氨酸棒状杆菌KCJ-28，并于2015年1月22日保藏在根据布达佩斯条约的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，并分别指定登记号KCCM11661P和登记号KCCM11662P。
实施例1和实施例2中使用的培养基的组成如下：
<活化培养基>
牛肉提取物1％，多价蛋白胨1％，氯化钠0.5％，酵母提取物1％，琼脂2％，pH7.2
<种子培养基>
葡萄糖5％，细菌蛋白胨1％，氯化钠0.25％，酵母提取物1％，尿素0.4％，pH7.2
<基本培养基>
葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，硫胺0.001％，生物素200μg/L，琼脂2％，pH7.0
实施例2：检测突变体产生L-亮氨酸的能力
通过以下方法培养实施例1中得到的、并且确认它们对高浓度的NL具有耐受性的谷氨酸棒状杆菌KCJ-24和谷氨酸棒状杆菌KCJ-28，以确认它们产生L-亮氨酸的能力。
将谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067和谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(即亲株)，和这两种突变体各自接种到含有25mL下述种子培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在30℃下培养20小时，同时以200rpm振荡以获得种子培养基。之后，将1mL每一种种子培养基接种到含有24mL下述生产培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养72小时以产生L-亮氨酸。
本实施例2中使用的生产培养基的组成如下。
<生产培养基>
葡萄糖5％，硫酸铵2％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸镁0.05％，玉米浆(CSL)2.0％，生物素200μg/L，pH7.2
培养结束后，立即通过高效液相色谱法(HPLC)测定L-亮氨酸产生量。下表1总结了用于实验的每种菌株的培养基中L-亮氨酸的浓度。
[表1]
谷氨酸棒状杆菌KCJ-24与谷氨酸棒状杆菌KCJ-28之间的L-亮氨酸产生能力的比较
结果，如表1所示，亲株(即谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067和谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869)分别产生0.1g/L和0.3g/L的L-亮氨酸，但根据本公开的突变体(即谷氨酸棒状杆菌KCJ-24和谷氨酸棒状杆菌KCJ-28)分别产生2.7g/L和3.1g/L的L-亮氨酸，这证实了与亲株的L-亮氨酸产生能力相比，突变体的L-亮氨酸产生能力提高至少约10倍。
上述结果表明对L-亮氨酸和正亮氨酸具有耐受性的突变体不受亮氨酸或其衍生物的反馈抑制影响，因此可以高效且高产率地产生L-亮氨酸。