本发明涉及有机化合物合成领域，具体涉及一种4-苯基喹啉类化合物、其制备方法及应用。
背景技术：
：结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可以侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。近年来随着迁移人口的增加，结核病特别是耐药结核病再次成为危害人类健康的头号杀手。耐药结核病主要细分为以下4类：(1)单耐药结核病(monoresistance-tuberculosis,mr-tb)，是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外dst证实对1种一线抗结核药物耐药的结核病；(2)多耐药结核病(polydrugresistance-tuberculosis,pdr-tb)，是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外dst证实对1种以上一线抗结核药物耐药(但不包括同时对异烟肼和利福平耐药)的结核病；(3)耐多药结核病(multidrugresistance-tuberculosis,mdr-tb)，是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外dst证实至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核病；(4)广泛耐药结核病(extensivedrugresistance-tuberculosis,xdr-tb)，是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外dst证实除至少同时对异烟肼和利福平耐药外，还对任何氟喹诺酮类抗菌药物产生耐药，以及3种二线注射类药物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1种耐药的结核病。据《2016年全球结核病报告》统计，2015年世界范围内估计有1040万新发病例，其中男性590万(56％)，女性350万(34％)，儿童100万。全球估计有48万新发的mdr-tb病例和10万耐利福平结核病(rr-tb)病例。现有抗结核一线药物均研发于上世纪70年代，分别为利福平(rfp)、异烟肼(inh)、链霉素(sm)和乙胺丁醇(emb)。严峻的耐药结核发展形式，要求加速新型抗结核药物的研发。喹啉类化合物是一种氮杂环化合物，在医药领域可以通过对喹啉环在不同的位点引入活性基团来改变或增强其抗肿瘤、抗疟疾、抗病菌等作用。2012年由杨森制药所研发的sirturo打开了喹啉类药物在抗结核领域的新局面。sirturo的主要活性成分为贝达喹啉(tmc-207)。贝达喹啉是一种二芳基喹啉类药物，其具有较高的口服利用率，不良反应发生率低，且与异烟肼、利福平、链霉素、莫西沙星交叉耐药性小，能最大限度的减少与现有的抗结核药物的交叉耐受。因此开发喹啉类抗结核药物具有较好的应用前景。然而，以往的制备喹啉类化合物的反应大多采用交叉脱氢偶联反应，其缺点在于该反应中必须使用过量的氧化剂，在反应过程中会产生如含硫化合物等有机或无机副产物，造成环境污染。技术实现要素：为解决上述现有技术中存在的问题，本发明人等进行了深入研究，提供了一种4-苯基喹啉类化合物，改化合物的制备产生的副产物不会对环境造成污染，是一种环保的制备方法。并同时发现了该化合物的对耐药结核菌株也有较好的杀菌和抑菌效果，本发明所述的化合物可应用在制备抗结核杆菌药物中，特别是可应用在制备抗耐药结核杆菌药物中。具体地，本发明提供一种4-苯基喹啉类化合物，其特征在于，所述4-苯基喹啉类化合物的结构如下述式(ⅰ)所示：其中，r1为–oh、–cl、–och3或–ch3；r2为–h、–ch2co2ch2ch3。本发明还提供一种如上所述的4-苯基喹啉类化合物的制备方法，其反应路线如下述式(ⅱ)所示，其中，r及r1为–oh、–cl、–och3或–ch3；r2为–h、–ch2co2ch2ch3。如上所述的制备方法，其具体步骤如下所示：(1)将溴乙酰溴溶于二氯甲烷中制得第一溶液，将化合物a和碳酸钾溶于二氯甲烷中制得第二溶液，将第一溶液滴加入第二溶液中，0℃搅拌4～7h，反应结束后用二氯甲烷萃取3～5次，干燥，过滤，旋转干燥二氯甲烷溶剂，得到中间产物b；(2)向中间产物b中加入原料c和乙酸钠，20～30℃缓慢加入乙醇，逐步升温至40～50℃回流搅拌3～6h，待固体溶解，再升温至微沸，回流搅拌，反应结束后，将盐过滤出来，在热乙醇中结晶、抽滤，得中间产物d；(3)将中间产物d、苯乙烯和三氯化铟在乙腈中溶解，控温于30～40℃，缓慢加入用乙腈溶解的催化剂tbpa·+，将反应液置于氧气气氛中，搅拌至反应完全，反应结束后，三乙胺溶液淬灭，以石油醚/丙酮体系进行柱色谱分离，得到目标产物e。其中，催化剂tbpa·+不参与反应，其用量无特殊限定，可发挥有效催化作用即可。可以优选中间产物d与催化剂的摩尔比为1:0.05～0.15。如上所述的制备方法，在步骤(1)中，溴乙酰溴与二氯甲烷的摩尔比为1:10～20；化合物a与碳酸钾的摩尔比为1:1～3，溶解后二氯甲烷的质量分数为70-80％；在步骤(2)中，所述中间产物b与原料c及乙酸钠的摩尔比为1:1～1.5:05～2；在步骤(3)中，所述中间产物d、苯乙烯及三氯化铟的摩尔比为1:4～6:1～3。本发明还提供一种如权利要求1所述的4-苯基喹啉类化合物在制备抗结核杆菌药物中的应用。在如上所述的应用中，所述抗结核杆菌为抗单耐药结核杆菌、或抗耐多药结核杆菌。在如上所述的应用中，所述抗单耐药结核杆菌为单耐链霉素、或单耐异烟肼。在如上所述的应用中，所述抗耐多药结核杆菌同时耐异烟肼、利福平、乙胺丁醇。在如上所述的应用中，所述抗耐多药结核杆菌同时耐链霉素、异烟肼。本发明的4-苯基喹啉类化合物、其制备方法及应用，具有如下有益效果：1.本发明4-苯基喹啉类化合物的制备采用交叉脱氢偶联(crossdehydrogenativecoupling，cdc)反应，其直接利用底物中的c-h键，在催化量的氧化剂存在下，进行脱氢偶联反应形成c-c键。但以往制备喹啉类化合物的cdc反应的一个缺点在于此反应中使用过量的氧化剂，这使得反应产生一定量的有机或无机副产物如含硫化合物等，这些副产物将造成环境污染。本发明的4-苯基喹啉类化合物采用空气中的氧气作为cdc反应的氧化剂，可以避免以上问题，因为使用氧气作为氧化剂，副产物是水，不会造成环境污染。本发明创新性的以少量的tbpa·+为催化剂，以空气中的氧气为氧化剂，建立一种全新的c-h键催化氧化反应，合成5个目标产物h1-h5，克服了以往cdc反应需大量使用tbpa·+和氧化剂，从而造成各类污染。2.在标准结核杆菌(h37rv)上，通过比例法和绝对浓度法，均显示目标产物(如上述结构式(ⅰ)所示的4-苯基喹啉类化合物)具有抑制标准结核分枝杆菌生长的作用，其中高浓度的h1、h3、h4、h5对结核分支杆菌生长具有抑制作用，而h2无论高低浓度都对结核分枝杆菌均具有杀灭作用。h2对标准菌株的最小抑菌浓度(mic)应为0.1μg/ml，最小杀菌浓度(mbc)在0.1～0.25μg/ml范围。与一线药物(rfp、inh、sm和emb)对比，h2与inh的mic和mbc相近；而与其他一线受试药相比，则h2的mic和mbc更低。提示h2具有较有较好的杀菌、抑菌效果。3.在耐药结核杆菌上即耐单药菌株(标本编号为8155为单耐sm；标本编号为7204为单耐inh)、耐多药菌株(标本编号为7975对inh、rfp、emb耐药)、多耐药菌株(标本编号为7821对sm、inh耐药)，目标产物h1、h3、h5对8155菌株和7204菌株有抑制作用；h4仅对7975菌株有抑制作用。而h2对上述耐药菌株均有抑菌和杀菌作用，且mic、mbc均不大于现有一线药物。具体实施方式下面对本发明的技术方案进行详细解说，但本发明并不受实施例限定，对本发明中本领域常规手段的替代均包含在本发明范围内。一、药物制备1.催化剂tbpa·+的制备将三苯胺(3g)溶于20ml氯仿与二氯甲烷混合溶液中，温度控制在-6℃以下(冰盐浴)，缓慢滴加含有液溴(2ml)的氯仿溶液(10ml)。搅拌40min，溶液逐渐变为黄绿色，把反应液倒入25ml热的无水乙醇中，有少量晶体出现。冷却至0℃，抽滤，得到白色针状晶体。再用乙酸乙酯重结晶，得到白色块状晶体对溴三苯胺4.7g，产率80％，熔点141-142℃(文献值:143-144℃)。将对溴三苯胺(2.4g)溶解在10ml的无水二氯甲烷中，0℃下缓慢加入含有五氯化锑(1ml)的二氯甲烷溶液10ml，反应立即发生，溶液变为深蓝色。然后将干燥的无水乙醚倒入到反应液中，出现深蓝色的沉淀，将其抽滤，并用干燥的乙醚洗涤后，在室温下真空干燥，得到深蓝色针状晶体(tbpa·+)，产率98％，熔点143-144℃。2.4-苯基喹啉类化合物的制备实施例1(化合物h1的制备)h1：将0.012mol溴乙酰溴(纯度97％)溶于10ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％甲胺水溶液和碳酸钾溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中甲胺0.01mol、碳酸钾0.01mol、溶解后的二氯甲烷的质量分数为75％。用恒压漏斗将溶液1逐滴滴加到装有溶液2的圆底烧瓶中，冰浴下搅拌6h。反应后，反应溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸钠干燥有机层0.5h，滤出硫酸钠，旋转干燥二氯甲烷溶剂，得到反应中间产物b(r2＝-h)。在0.010mol反应中间产物b(r2＝h)中加入0.010mol对氨基苯酚(原料c、r1＝-oh)和0.010mol乙酸钠，控温于20℃以下缓慢加入5ml乙醇，逐步升温至40℃回流搅拌，待固体溶解，再升温至微沸，回流搅拌6h，用tlc检测反应完全后，将盐过滤出来，在热乙醇中结晶、抽滤得反应中间产物d(r2＝-h、r1＝-oh)。将0.005mol反应中间产物d(r2＝-h、r1＝-oh)、0.025mol苯乙烯和0.010mol三氯化铟在乙腈中溶解。控温于40℃，缓慢加入用乙腈溶解的催化剂溴三苯胺自由基正离子六氯锑酸盐(tbpa·+)，将反应液置于氧气气氛中，搅拌至反应完全。用tlc检测其反应完全后，1ml三乙胺溶液淬灭，以石油醚/丙酮体系进行柱色谱分离，得到目标产物e(r2＝-h、r1＝-oh)，结构如下述h1所示。h1：目标产物e(h1)的结构表征：6-hydroxy-n-methyl-4-phenylquinoline-2-carboxamide1hnmr(400mhz,dmso)δ10.27(s,oh,1h),8.82(d,nh,j＝4.8hz,1h),8.05(d,j＝9.1hz,1h),7.89(d,j＝1.9hz,1h),7.67–7.49(m,5h),7.42(dd,j＝9.1,2.5hz,1h),7.21–7.15(m,1h),2.89(dd,j＝4.8,1.6hz,3h)；13cnmr(101mhz,dmso)δ164.9,157.3,146.9,146.8,141.9,137.7,131.6,129.2,128.9,128.7,128.5,123.0,118.6,106.2,26.1；ei-msm/z(relativeintensity,％):278(31.0％),249(10.5％),235(9.0％),221(100％),190(12.1％),165(9.1％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc17h14n2o2+h+,279.1134；found,279.1145.实施例2(化合物h2的制备)h2：将0.012mol溴乙酰溴(纯度97％)溶于15.4ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％甲胺水溶液和碳酸钾溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中甲胺0.01mol、碳酸钾0.03mol、溶解后的二氯甲烷的质量分数为80％。用恒压漏斗将溶液1逐滴滴加到装有溶液2的圆底烧瓶中，冰浴下搅拌7h。反应后，反应溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸钠干燥有机层0.5h，滤出硫酸钠，旋转干燥二氯甲烷溶剂，得到反应中间产物b(r2＝h)。在0.010mol反应中间产物b(r2＝h)中加入0.015mol对氯苯胺(原料c、r1＝-cl)和0.005mol乙酸钠，控温于30℃以下缓慢加入5ml乙醇，逐步升温至50℃回流搅拌，待固体溶解，再升温至微沸，回流搅拌4h，用tlc检测反应完全后，将盐过滤出来，在热乙醇中结晶、抽滤得反应中间产物d(r2＝h、r1＝-cl)。将0.005mol反应中间产物d(r2＝h、r1＝-cl)、0.02mol苯乙烯和0.015mol三氯化铟在乙腈中溶解。控温于40℃，缓慢加入用乙腈溶解的催化剂溴三苯胺自由基正离子六氯锑酸盐(tbpa·+)，将反应液置于氧气气氛中，搅拌至反应完全。用tlc检测其反应完全后，1ml三乙胺溶液淬灭，以石油醚/丙酮体系进行柱色谱分离，得到目标产物e(r2＝h、r1＝-cl)，结构如下述h2所示。h2：目标产物e(h2)的结构表征：6-chloro-n-methyl-4-phenylquinoline-2-carboxamide1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.21(s,1h),8.16(s,nh,1h),8.01(d,j＝9.0hz,1h),7.87(d,j＝2.2hz,1h),7.62(dd,j＝9.0,2.3hz,1h),7.51–7.41(m,5h),3.04(d,j＝5.0hz,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ164.8,149.6,149.3,145.5,137.0,134.0,131.6,130.8,129.4,128.9,128.4,124.8,124.7,119.8,26.2；ei-msm/z(relativeintensity,％):298(8.7％),296(28.6％),269(3.4％),267(9.1％),241(34.0％),239(100％),204(31.3％),203(32.3％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc17h13cln2o+h+,297.0795；found,297.0808.实施例3(化合物h3的制备)h3：将0.012mol溴乙酰溴(纯度97％)溶于8ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％甲胺水溶液和碳酸钾溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中甲胺0.01mol、碳酸钾0.02mol、溶解后的二氯甲烷的质量分数为70％。用恒压漏斗将溶液1逐滴滴加到装有溶液2的圆底烧瓶中，冰浴下搅拌4h。反应后，反应溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸钠干燥有机层0.5h，滤出硫酸钠，旋转干燥二氯甲烷溶剂，得到反应中间产物b(r2＝-h)。在0.010mol反应中间产物b(r2＝h)中加入0.0125mol对甲氧基苯胺(原料c、r1＝-och3)和0.020mol乙酸钠，控温于30℃以下缓慢加入5ml乙醇，逐步升温至50℃回流搅拌，待固体溶解，再升温至微沸，回流搅拌4h，用tlc检测反应完全后，将盐过滤出来，在热乙醇中结晶、抽滤得反应中间产物d(r2＝-h、r1＝-och3)。将0.005mol反应中间产物d(r2＝-h、r1＝-och3)、0.03mol苯乙烯和0.010mol三氯化铟在乙腈中溶解。控温于40℃，缓慢加入用乙腈溶解的催化剂溴三苯胺自由基正离子六氯锑酸盐(tbpa·+)，将反应液置于氧气气氛中，搅拌至反应完全。用tlc检测其反应完全后，1ml三乙胺溶液淬灭，以石油醚/丙酮体系进行柱色谱分离，得到目标产物e(r2＝-h、r1＝-och3)，结构如下述h3所示。h3：目标产物e(h3)的结构表征：6-methoxy-n-methyl-4-phenylquinoline-2-carboxamide1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.30–8.19(m,2h),8.02(dd,j＝9.2,3.0hz,1h),7.59–7.44(m,4h),7.43–7.36(m,1h),7.28–7.20(m,2h),3.79(s,3h),3.10(d,j＝4.8hz,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ165.4,158.9,148.3,147.2,143.1,138.0,131.4,129.3,128.9,128.7,128.5,122.6,119.4,103.5,55.5,26.2；ei-msm/z(relativeintensity,％):292(22.0％),263(6.2％),235(100％),191(18.3％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc18h16n2o2+h+,293.1290；found,293.1289.实施例4(化合物h4的制备)h4：将0.012mol溴乙酰溴(纯度97％)溶于11.5ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％甲胺水溶液和碳酸钾溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中甲胺0.01mol、碳酸钾0.02mol、溶解后的二氯甲烷的质量分数为75％。用恒压漏斗将溶液1逐滴滴加到装有溶液2的圆底烧瓶中，冰浴下搅拌5h。反应后，反应溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸钠干燥有机层0.5h，滤出硫酸钠，旋转干燥二氯甲烷溶剂，得到反应中间产物b(r2＝-h)。在0.010mol反应中间产物b(r2＝h)中加入0.010mol对甲基苯胺(原料c、r1＝-ch3)和0.015mol乙酸钠，控温于20℃以下缓慢加入5ml乙醇，逐步升温至50℃回流搅拌，待固体溶解，再升温至微沸，回流搅拌4h，用tlc检测反应完全后，将盐过滤出来，在热乙醇中结晶、抽滤得反应中间产物d(r2＝-h、r1＝-ch3)。将0.005mol反应中间产物d(r2＝-h、r1＝-ch3)、0.025mol苯乙烯和0.005mol三氯化铟在乙腈中溶解。控温于40℃，缓慢加入用乙腈溶解的催化剂溴三苯胺自由基正离子六氯锑酸盐(tbpa·+)，将反应液置于氧气气氛中，搅拌至反应完全。用tlc检测其反应完全后，1ml三乙胺溶液淬灭，以石油醚/丙酮体系进行柱色谱分离，得到目标产物e(r2＝-h、r1＝-ch3)，结构如下述h4所示。h4：目标产物e(h4)的结构表征：n,6-dimethyl-4-phenylquinoline-2-carboxamide1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.20(s,nh,1h),8.15(s,1h),7.96(d,j＝8.5hz,1h),7.65(s,1h),7.51(d,j＝8.5hz,1h),7.45(s,5h),3.04(d,j＝5.1hz,3h),2.41(s,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ165.3,149.1,148.5,145.7,138.1,137.9,132.2,129.6,129.6,128.6,128.5,127.7,124.6,119.1,26.2,22.0；ei-msm/z(relativeintensity,％):276(20.6％),247(5.4％),219(100％),204(14.0％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc18h16n2o+h+,277.1341；found,277.1351.实施例5(化合物h5的制备)h5:将0.012mol溴乙酰溴(纯度97％)溶于11.5ml二氯甲烷中(溶液1)。另取30％氨基乙酸乙酯水溶液和碳酸钾溶于二氯甲烷中(溶液2)，其中氨基乙酸乙酯0.01mol、碳酸钾0.02mol、溶解后的二氯甲烷的质量分数为75％。用恒压漏斗将溶液1逐滴滴加到装有溶液2的圆底烧瓶中，冰浴下搅拌5h。反应后，反应溶液用二氯甲烷萃取3次，每次5ml，硫酸钠干燥有机层0.5h，滤出硫酸钠，旋转干燥二氯甲烷溶剂，得到反应中间产物b(r2＝-ch2co2ch2ch3)。在0.010mol反应中间产物b(r2＝h)中加入0.0125mol对氨基苯酚(原料c、r1＝-oh)和0.010mol乙酸钠，控温于20℃以下缓慢加入5ml乙醇，逐步升温至50℃回流搅拌，待固体溶解，再升温至微沸，回流搅拌4h，用tlc检测反应完全后，将盐过滤出来，在热乙醇中结晶、抽滤得反应中间产物d(r2＝-ch2co2ch2ch3、r1＝-oh)。将0.005mol反应中间产物d(r2＝-ch2co2ch2ch3、r1＝-oh)、0.020mol苯乙烯和0.015mol三氯化铟在乙腈中溶解。控温于40℃，缓慢加入用乙腈溶解的催化剂溴三苯胺自由基正离子六氯锑酸盐(tbpa·+)，将反应液置于氧气气氛中，搅拌至反应完全。用tlc检测其反应完全后，1ml三乙胺溶液淬灭，以石油醚/丙酮体系进行柱色谱分离，得到目标产物e(r2＝-ch2co2ch2ch3、r1＝-oh)，结构如下述h5所示。h5:目标产物e(h5)的结构表征：ethyln-[(6-methoxy-4-phenylquinolin-2-yl)carbonyl]aminoacetate1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.69(t,j＝5.5hz,nh,1h),8.19(s,1h),8.08(d,j＝9.2hz,1h),7.60–7.46(m,5h),7.42(dd,j＝9.2,2.7hz,1h),7.24(d,j＝2.6hz,1h),4.34(d,j＝5.7hz,2h),4.28(q,j＝7.1hz,2h),3.81(s,3h),1.33(t,j＝7.1hz,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ169.9,165.0,159.0,148.2,146.4,143.2,138.0,131.7,129.3,129.0,128.7,128.5,122.7,119.4,103.4,61.5,55.5,41.5,14.2；ei-msm/z(relativeintensity,％):364(29.0％),318(18.3％),291(25.4％),235(100％),234(81.1％),191(22.8％),190(13.2％)；hrms(esi,iontrap):calc’dforc21h20n2o4+na+,387.1321；found,387.1310.二、本发明的4-苯基喹啉类化合物抗结核杆菌活性评价1.材料与方法1.1材料链霉素(sm，生物效价为0.771，批号：806120)、异烟肼(inh，批号：7013252)、利福平(rfp，批号：80201401041)、乙胺丁醇(emb，批号：n3072474)生产厂家：沈阳红旗制药有限公司。1.2菌株标准菌株(h37rv)为甘肃传染病医院分枝杆菌菌株库保存菌株。耐药菌株即耐单药菌株(标本编号为8155为单耐sm；标本编号为7204为单耐inh)、耐多药菌株(标本编号为7975对inh、rfp、emb耐药)、多耐药菌株(标本编号为7821对sm、inh耐药)为甘肃传染病医院临床病例标本分离培养菌株。1.3仪器设备隔水式培养箱(gh-600,北京科伟永兴仪器有限公司)；压力蒸汽灭菌器(yxqg,山东新华医疗器械股份有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(dhg-9245a,上海一恒科技有限公司)；蒸汽恒温箱(xz-1,北京新中大业仪表有限公司)；电子天平(fa2004n,上海箐海仪器有限公司)；生物安全柜(hfsafe-1800b2，healforce)1.4方法1.4.1受试药的配制和稀释。异烟肼(inh)、利福平(rfp)、乙胺丁醇(emb)、4-苯基喹啉类化合物的生物效价为1000μg/mg,链霉素硫酸盐(sm-so4)的生物效价为771μg/mg。rfp、4-苯基喹啉类药物用二甲基甲酰胺溶解，再用灭菌蒸馏水稀释，emb、inh、sm直接用灭菌蒸馏水溶解、稀释。1.4.2培养基制备改良罗氏培养基：基础液：制备方法按照《结核病诊断实验室检验规程》[12]进行。将表2中的无机盐于蒸馏水，加热溶解，121℃30min高压蒸汽灭菌，冷却至室温后加入马铃薯淀粉，再次加热溶解，并煮沸1min。冷却后于4℃冰箱保存。表2.基础培养基的主要成分谷氨酸钠(纯度99％以上)7.2g磷酸二氢钾(kh2po4)2.4g硫酸镁(mgso4·7h2o)0.24g柠檬酸镁0.6g马铃薯淀粉10g丙三醇12ml蒸馏水600ml称取2g孔雀绿染料，用100ml蒸馏水溶解，放于温箱中助溶解2h，于当周使用。选取不超过7d的新鲜鸡蛋20个左右，用普通的碱性肥皂液将彻底刷洗，并在肥皂液中浸泡30min，彻底冲洗鸡蛋后在75％乙醇中浸泡15min，晾干后使用。含药培养基:将表2.所示成分充分混均，空白对照组不加抗结核药液，溶液静置30～60min后，进行无菌分装，每支加量7ml，培养基斜面高度为试管的2/3，且需底部充满培养基为佳。培养基分装结束后要尽快开始凝固过程，以防沉淀发生。斜面放置于培养基蒸汽凝固灭菌箱内,85℃凝固50min。表3.含药培养基基础液600ml孔雀绿溶液20ml匀质全卵液1000ml受试药药液1ml/100ml基础培养基培养基质量控制：冷却后的整批培养基或抽取其中一部分置37℃、24h进行无菌试验。检查无污染情况后,4℃避光保存,1个月内使用。1.4.3接种方法(1)菌悬液制备:刮取临床分离菌龄2～3周的结核分枝杆菌菌落，放玻璃磨菌器底部，研磨使之呈乳酪样，以0.5％吐温-80生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管比浊，配成1mg/ml的菌悬液。(2)绝对浓度法:将1mg/ml的菌悬液10倍稀释至10-2mg/ml，以灭菌吸管准确吸取菌液0.1ml分别接种于含药培养基和对照培养基斜面上，每管接种菌量为10-3mg。斜面向上置于37℃温箱，四周后观察结果。(3)比例法:用22swg标准接种环将1mg/ml的菌液上清逐步稀释至10-2mg/ml和10-4mg/ml后。分别沾取1环(即0.01ml)10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。接种后的培养基置于37℃培养，至四周后报告结果，并计算耐药百分比。2.药物敏感试验2.1抗结核活性筛选分别将本发明的5种4-苯基喹啉类化合物通过绝对浓度法、比例法接种标准结核菌株，经过四周培养后，从5个目标产物中筛选出对标准结核菌株具有杀菌效果的药物。采用绝对浓度法时，需空白组培养基分枝杆菌生长旺盛，才报告含药培养基上菌落生长情况，低浓度含药培养基菌落生长1+以上者即为耐药。而比例法则是通过计算耐药比来判断结核杆菌对该药物是否耐药，含药培养基上生长的菌落数与空白培养基上生长的菌落数的比值，即为耐药比，耐药百分比大于1％，则认为受试菌对该抗结核药耐药，反之，对该抗结核药敏感。当比例法接种菌量10-4mg/ml与10-6mg/ml培养结果不一致时，本实验采取“就高不就低”原则，即该药有一个接种菌量培养结果为耐药即是耐药。表4.含药培养基药物终浓度(μg/ml)2.2目标化合物的mic和mbc测定第一次筛选余下的4-苯基喹啉类，和作为阳性对照的链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇4种一线药物，设置十个浓度阶梯，采用比例法接种标准菌株，经过四周培养后，记录各药物的最小抑菌浓度(mic)、最小杀菌浓度(mbc)。将目标化合物与四种一线受试药的mic、mbc进行比较，从中选出比一线受试药作用效果更好的抗结核化合物。其中含药培养基内药物浓度分别为40、20、10、5、2、1、0.5、0.25、0.1、0.05μg/ml。2.3目标化合物对耐药菌株的作用效果研究耐药菌株的选择：从临床病人标本中随机选择，采用比例法进行培养，培养基中药物终浓度按《结核病诊断实验室检验规程》：inh0.2μg/ml，sm4μg/ml，rfp40μg/ml，emb2μg/ml。四周之后，选择至少在一种含药培养基上生长的菌株。与第一次筛选采用相同的方法，但接种耐药菌株，经过四周培养，从中选出比一线受试药作用效果更好的4-苯基喹啉类的抗结核化合物。3.抗菌活性结果3.14-苯基喹啉化合物对标准结核杆菌的作用表5、表6结果显示在5个目标产物中，h1、h3、h4和h5仅在高浓度时对结核分支杆菌的生长具有抑制作用，提示h1、h3、h4和h5具有一定的抑菌作用。其中h2具有抑制标准结核分枝杆菌生长的作用，且无论高低浓度都对结核分枝杆菌均具有杀灭作用。h2对标准菌株的最小抑菌浓度(mic)应为0.1μg/ml，最小杀菌浓度(mbc)在0.1～0.25μg/ml范围内。与一线药物(rfp、inh、sm和emb)对比，h2与异烟肼的mic和mbc相近，而与其他一线受试药相比，则h2的mic和mbc更低。表54-苯基喹啉类化合物对标准结核分枝杆菌耐作用效果(比例法)注：菌落数能数清楚的用数字表示，“0”表示无菌生长，“1+”表示菌落生长占斜面面积的1/4，“2+”表示菌落生长占斜面面积的1/2，“3+”表示菌落生长占斜面面积的3/4，“4+”表示菌落生长布满整个斜面。下面各表均同。表6.4-苯基喹啉类化合物对标准结核分枝杆菌的作用效果(绝对浓度法)3.2对耐药结核杆菌的作用对耐药结核杆菌的作用以h2的结果为主要说明，h1、h3、h4和h5的试验方法及结果表示参照h2。其中h1、h3、h5对8155菌株和7204菌株有抑制作用；h4仅对7975菌株有抑制作用。表7结果显示：目标产物h2对8155菌株在0.1μg/ml的耐药比小于1％，故其的mic为0.1μg/ml，mbc在0.1～0.25μg/ml范围内。而一线药物inh对8155菌株mic、mbc在0.1～0.25μg/ml范围内，rfp的mic、mbc在10～20μg/ml范围内，emb的mic、mbc在0.5～1μg/ml范围内。表7.不同浓度的h2对8155菌株的作用效果表8结果显示：目标产物h2对7204菌株的mic为0.1μg/ml，mbc在0.1～0.25μg/ml范围内。而sm对7204菌株的mic、mbc在2.5～5μg/ml范围内，rfp的mic、mbc在20μg/ml左右，emb的mic、mbc在0.5～1μg/ml范围内。表8.不同浓度的h2对7204菌株的作用效果表9.结果显示h2对7975菌株的mic为0.1μg/ml，mbc在0.1～0.25μg/ml范围内；而sm对7975菌株mic、mbc在2.5～5μg/ml范围内。表9.不同浓度的h2对7975菌株的作用效果表10结果显示h2对7821菌株的mic为0.1μg/ml，rfp的mic、mbc在20μg/ml左右，emb的mic、mbc在1μg/ml左右。表13.不同浓度的h2对7821菌株的作用效果当前第1页12