一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的方法与流程

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种基于格氏嗜盐碱杆菌argonaute(ngago)靶向激活基因转录的方法。

背景技术：

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定dna片段的敲除、加入等。在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。因此，基因组编辑工具具有极大的理论和临床应用价值。

目前，基于zfn和cas9基因编辑工具的针对艾滋病和肿瘤的治疗新手段已经进入临床实验。并且，初期临床实验结果证明了其有效性。相对于zfn的基于蛋白与dna识别的基因组编辑工具，cas9作为基于rna与dna碱基配对识别机制，具有易于操作、利于大批量构建等优点。但由于cas9需要rna具有特定二级结构并且识别dna位点必须具有pam结构，因此对识别位点具有一定选择性，在一定程度上限制了其应用的范围。

另外，基于dna与dna识别的、无二级结构需求的格氏嗜盐碱杆菌(natronobacteriumgregoryi)argonaute(ngago)基因组编辑工具，具有更加广泛的应用前景。但是，目前对于ngago的基因组编辑功能，大家仍持有怀疑态度，因为国内国际上的众多科学家都无法重复这个发现。鉴于基于ngago的基因组编辑工具具有更加广泛的潜在应用前景，国内国际上众多科学家都试图开发这款工具，但都以失败告终。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有ngago基因组编辑工具技术和应用的缺陷及不足，我们的研究发现，格氏嗜盐碱杆菌(natronobacteriumgregoryi)argonaute(ngago)具有结合导向dna的能力，并具有识别靶点dna的能力，但缺乏dna切割能力。因此，本发明将ngago与vp64构建成融合蛋白，该蛋白在细胞内具有激活内源基因的能力。本发明解决了近期大家对ngago应用的问题，并为后期开发为靶向基因组编辑工具和其它工具提供了支撑。

本发明的目的是提供一种ngago-vp64融合蛋白及其在基因编辑或在制备ngago基因组编辑工具方面的应用。

本发明另一目的是提供一种基于格氏嗜盐碱杆菌argonaute(ngago)靶向激活基因转录的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种ngago-vp64融合蛋白，是由vp64与ngago融合表达获得。具体是将vp64融合到ngago的c末端(记为ngc)或n末端(记为ngn)，并进行人源化密码子优化所得。

所述融合蛋白的序列如seqidno.1或seqidno.2所示。

基于所述ngago-vp64融合蛋白的结构进行的类似蛋白序列改变且具有相同功能的蛋白，也应在本发明范围之内。

一种表达ngago-vp64融合蛋白的质粒，是将ngago-vp64融合蛋白基因克隆到表达载体获得。

所述表达载体包括，但不局限于瞬时表达载体、病毒载体，真核表达载体和原核表达载体，具体如表达载体pcdna3.1。

一种导向dna(gdna)，为seqidno.3～12所示序列片段中的任一种或几种的混合物。

优选地，所述导向dna为seqidno.4、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.12任一所示序列片段，或seqidno.3～7所示序列片段的混合物，或seqidno.8～12所示序列片段的混合物。

上述ngago-vp64融合蛋白、质粒或导向dna在基因编辑方面的应用，以及在制备ngago基因编辑工具方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。

具体地，所述基因编辑是指激活内源基因的表达。其应用物种，不仅仅限制于人类细胞，还包括其他物种。

一种基于格氏嗜盐碱杆菌argonaute靶向激活基因转录的ngago基因编辑工具，包括上述ngago-vp64融合蛋白或质粒，还包括上述导向dna(gdna)。

一种基于格氏嗜盐碱杆菌argonaute靶向激活内源基因转录的方法，是上述ngago基因编辑工具与转染试剂共转染细胞。

具体地，该方法包括如下步骤：

s1.细胞传代培养至指数增长期，转染前0.5～2小时(优选1小时)，将细胞培养基换为无血清培养基，孵育0.5～2小时(优选1小时)；

s2.将ngago-vp64融合蛋白质粒和导向dna稀释到无血清培养基中，转染试剂稀释到无血清培养基中，然后将两者混合，室温静置20～30分钟(优选25分钟)后，加入细胞中，2～4小时(优选3小时)后加入血清至终浓度为8～15％(优选10％)；

s3.第二天重复转染，但只需转染导向dna(gdna)。

其中，步骤s2所述ngago-vp64融合蛋白的序列如seqidno.1或seqidno.2所示。

优选地，步骤s2所述导向dna为seqidno.4、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.12任一所示序列片段，或seqidno.3～7所示序列片段的混合物，或seqidno.8～12所示序列片段的混合物。

优选地，步骤s2中ngago-vp64融合蛋白：导向dna：无血清培养基＝0.5～2μg：0.5～2μl：100μl。

更优选地，步骤s2中ngago-vp64融合蛋白：导向dna：无血清培养基＝1μg：1μl：100μl。

基于现有技术的研究结果以及我们自己前期的探索研究，我们推测目前无法将细菌ago开发为基因组编辑工具的可能原因为两点：(1)ngago在哺乳动物细胞内不具有结合导向dna并具有识别靶点基因组dna的能力；(2)ngago在哺乳动物细胞内具有结合导向dna并具有识别靶点基因组dna的能力，但不具有dna切割活性。

为了验证原因(2)，我们将ngago与转录激活蛋白vp64进行融合表达，并在哺乳细胞内表达。研究结果发现，ngago与vp64的融合蛋白可以激活细胞内基因nanog，进而证实ngago在哺乳动物细胞内具有结合导向dna并具有识别靶点基因组dna的能力，但不具有dna切割活性。

本发明具有以下有益效果：

本发明证明了ngago具有结合导向dna，并具有识别靶点基因组dna的能力。首次发现ngago与vp64构建成的融合蛋白，在细胞内具有激活内源基因的能力。在基于该发明的基础上，可以进一步将ngago与dna切割酶融合(例如iseci和foki)并开发为靶向基因组编辑工具或其它工具。

本发明解决了近期大家对ngago应用的怀疑观望问题，并为后期开发为靶向基因组编辑工具和其它工具提供了支撑。

附图说明

图1为ngc和ngn的基因结构示意图。

图2为ngago-vp64(ngc)的序列组成；黑色非加粗部分为ngago蛋白序列，加粗且下划线部分为核定位信号，灰色阴影部分为vp64序列。

图3为vp64-ngago(ngn)的序列组成；黑色非加粗部分为ngago蛋白序列；加粗且下划线部分为核定位信号，灰色阴影部分为vp64序列。

图4为ngago与vp64融合蛋白可激活细胞内nanog基因转录；(a)qpcr分析ngc激活细胞内nanog基因转录水平，(b)qpcr分析ngn激活细胞内nanog基因转录水平；ngc代表vp64融合到ngago的c端；ngn代表vp64融合到ngago的n端；n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、n10代表针对nanog的不同导向dna。n1-5代表n1、n2、n3、n4和n5的等体积混合物；n6-10代表n6、n7、n8、n9和n10的等体积混合物；blank代表转染时不加入ngc、ngn或者导向dna。*代表显著性差异p值小于0.01。

图5为ngc和ngn都可以激活细胞nanog基因转录；ngc代表vp64融合到ngago的c端；ngn代表vp64融合到ngago的n端；n10代表针对nanog的导向dna；ng代表没有融合vp64的ngago基因；blank代表转染时不加入ngc、ngn或者导向dna。*代表显著性差异p值小于0.01。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例以nanog基因为例，进行利用ngc(将vp64融合到ngago的c末端)和ngn(将vp64融合到ngago的n末端)激活细胞内基因研究。实施例1构建ngago-vp64融合蛋白

1、将vp64与ngago融合表达

为了防止蛋白相对位置对蛋白活性的影响，分别将vp64融合到ngago的c末端(ngc)和n末端(ngn)，蛋白序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示(基因结构示意图如图1所示，序列组成分别如图2和图3所示)。

2、将该蛋白序列进行人源化密码子优化后，分别克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.1上。质粒经测序验证正确后，质粒大提后用于后续实验。

实施例2导向dna合成与磷酸化

1、设计导向dna序列，如表1所示：

表1

导向dna(gdna)长度为24bp，合成后用1xt4pnk缓冲液(neb)溶解至100μm。每1nmolgdna用5单位t4pnk进行磷酸化，37℃孵育过夜。然后储存至-20℃，备用。

实施例3由ngago-vp64融合蛋白和导向dna构成的ngago基因组编辑工具及其应用

1、一种基于格氏嗜盐碱杆菌argonaute靶向激活基因转录的ngago基因组编辑工具，包括实施例1所述的ngago-vp64融合蛋白和实施例2所述的导向dna。

2、ngago基因组编辑工具激活基因转录实验

(1)细胞培养与转染

转染前一天，对细胞进行传代培养，使转染时细胞为指数增长期。以细胞hela为例，12孔板中每孔可铺细胞10万。转染前一小时，将细胞培养基换为无血清培养基孵育1小时。利用lipofactamine2000转染试剂进行转染。

以12孔板中每孔的量为例，将1μg融合蛋白质粒与1μlgdna稀释到100μlopti-mem中；将2μllipofactamine2000稀释到100μlopti-mem中，室温静置5分钟。然后将两者混合，室温静置25分钟后，加入细胞中，3小时后加入血清至终浓度为10％。

第二天重复转染过程，但只需转染gdna即可。转染后48小时，细胞用于后续分析。

(2)rna提取、cdna反转录以及实时定量pcr检测

转染48小时后，细胞用trizol(thermoscientific)进行裂解，经氯仿进一步裂解后，12000rpm离心15分钟，取上清并于等体积异丙醇混合。12000rpm离心15分钟，去上清，并用75％乙醇清洗沉淀，得rna沉淀。rna沉淀用depc水溶解后定量。

取2μgrna进行cdna反转录，反应体系为mmlv逆转录酶和随机引物(thermoscientific)，共20μl。反转录完成后，将cdna稀释4倍，用于实时定量pcr分析。所用试剂为takarasybg试剂盒，仪器为bioradcfx96。基因表达分析利用2^-δδct方法。

其中，用于qpcr的引物如表2所示：

表2qpcr引物

(3)实验结果

图4中a图所示结果显示，位点n2、n5、n7、n10、n1-5、n6-10可以显著激活nanog基因转录；b图所示结果显示，位点n9、n10可以显著激活nanog基因转录。图5所示结果显示，ngc和ngn都可以激活细胞nanog基因转录。

sequencelisting

<110>深圳大学

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<400>13

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<210>14

<211>20

<212>dna

<213>基因nanog反向引物

<400>14

tggtggtaggaagagtaaag20

<210>15

<211>17

<212>dna

<213>内参β-actin正向引物

<400>15

gttgtcgacgacgagcg17

<210>16

<211>17

<212>dna

<213>内参β-actin反向引物

<400>16

gcacagagcctcgcctt17