一种格菲罗霉素类化合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种格菲罗霉素类化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，其在中国乃至全世界范围内的死亡人数中列第二位，仅次于心脑血管疾病。因此寻找到新型、高效、低毒的抗肿瘤药物是当今世界的一大难题。

从天然资源中寻找新的抗肿瘤药物成为研究的趋势，其中微生物由于特殊的生存环境，有可能产生结构新颖、作用机制独特的活性次级代谢产物。因此从微生物中寻找活性成分来预防和治疗肿瘤，越来越引起人们的重视。

放线菌作为一类重要的微生物，以产生种类繁多的生物活性物质而广泛受到重视。目前，放线菌仍是抗生素的主要微生物来源，临床使用的抗生素有70％是由放线菌产生的。现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4000多种，其中，有50多种抗生素已经得到广泛的应用，如链霉素、红霉素、多氧霉素、金霉素、卡那霉素、氯霉素和庆大霉素等用于临床治疗人的多种疾病。随着病原微生物对抗生素抗性的提高，寻找具有新型作用机制的抗生素显得十分必要。

放线菌是因菌丝呈放射状而得名，自从1877年cohn从牛的颈肿病中发现放线菌以后，直到本世纪40年代初期，放线菌还是未被人们所熟知的一类微不足道的微生物，当时仅报道了含义不很明确的四五个属，比较知名的是对人和动物有致病性的放线菌属(actinomycetes)、诺卡氏菌属(nocardia)和被认为是细菌的分枝杆菌(mycobacterium)。随着认识的深入，到60年代放线菌被确认是原核生物，与细菌的关系极为密切，甚至可以包括在广义的细菌中。目前，在《伯杰氏系统细菌学手册》第四卷中，放线菌属于原核生物界，厚壁菌门、放线菌纲、放线菌目(actinomycetales)。

放线菌目及其相关的微生物是革兰氏阳性菌中形态发生最为多样化的组群。放线菌是一类高(g+c)mol％的革兰氏阳性细菌。现在已发现的数万种微生物来源的生物活性物质中，约有70％是由放线菌所合成的。

链霉菌属，是放线菌中最大的一个属，因它们能产生丰富的且具有一定生物活性作用的次级代谢物而受到广泛关注。

技术实现要素：

本发明通过对放线菌进行研究提供了一种格菲罗霉素(gephyromycin)类化合物及其制备方法和应用。

一种化合物，结构式如式i：

本发明又提供了所述的化合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

所述癌症为前列腺癌或肺癌。

本发明还提供了所述化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)发酵培养放线菌获得发酵产物；

(2)发酵产物过滤去除菌丝体获得粗提物；

(3)粗提物分离纯化获得所述化合物，

其中，所述放线菌保藏号为ciccno.11030。链霉菌(streptomycessp.)，保藏号为ciccno.11030，购买自位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)。

所述的制备方法，发酵使用培养基为大米培养基，所述大米培养基按以下组分制成：大米∶浓度为25％的海盐水质量体积比为40g∶60ml。

步骤(3)中分离纯化的方法如下：

(a)粗提物用乙酸乙酯萃取；

(b)萃取液浓缩后，使用反向柱色谱纯化，并用甲醇-水体系洗脱；

(c)将包含目的化合物的洗脱产物合并后，使用反相高效液相色谱分离获得所述化合物。

步骤(a)中萃取方法为：用与粗提物等体积的乙酸乙酯萃取3次。

步骤(b)中洗脱方法为使用体积比为10∶90～100∶0的甲醇-水体系梯度洗脱。

步骤(c)中反相高效液相色谱分离使用的填料为十八烷基键合硅胶，流动相为体积比为48∶52甲醇-水体系以10ml/min等度洗脱，收集35-37min的色谱峰。

本发明化合物为从一种放线菌中分离纯化得到，经鉴定为一种格菲罗霉素类化合物，经实验检测发现该化合物对人前列腺癌细胞(pc3)和非小细胞肺癌细胞(h1975)均具有较高的活性，特别是对人前列腺癌细胞(pc3)其活性比顺铂还要高出许多，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明具有抗肿瘤活性化合物的结构式。

图2为本发明具有抗肿瘤活性化合物的结构标注图，其中，箭头表示碳-氢相关，加粗化学键表示氢-氢相关。

图3为本发明具有抗肿瘤活性的化合物的¹hnmr图谱。

图4为本发明具有抗肿瘤活性的化合物的¹³cnmr图谱。

图5为本发明具有抗肿瘤活性的化合物的hsqc图谱。

图6为本发明具有抗肿瘤活性的化合物的hmbc图谱。

图7为本发明具有抗肿瘤活性的化合物的¹h-¹hcosy图谱。

具体实施方式

菌种来源

链霉菌(streptomycessp.)，保藏号为ciccno.11030，购买自位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)。

培养基

高氏一号液体培养基：以发酵培养基1l计，可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，加水至1l，调ph7.2。

高氏一号固体培养基：以发酵培养基1l计，可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，12g琼脂，加水至1l，调ph7.2。

大米培养基：大米和海盐水按以下质量体积比：大米40g，25％的海盐水60ml，即大米∶25％的海盐水＝40g∶60ml。

实施例1

1、活化

从原保存斜面或甘油管取真菌适量，接种到平板培养基上，于28℃培养箱中静置，活化培养5天。

2、种子液

将己经活化的上述链霉菌接种于高氏一号固体培养基，在培养皿中进行链霉菌的培养，于室温下倒置培养5-7天。接着挑取单菌落接种于含有250ml液体培养基的500ml锥形瓶中，每瓶含250ml高氏一号液体培养基，在摇床中28℃下以180rpm振荡培养5天，获得种子液。

3、发酵

以每瓶接种8ml的量将上述种子液接种到300瓶大米发酵培养基(由以下重量组分制成：大米40g，25％的海盐水60ml)中，28℃静置培养30天后终止发酵。

4、粗提

每瓶固体发酵物用ea(乙酸乙酯)约200ml浸泡过夜，三层纱布过滤除去菌丝体，收集滤液，减压浓缩得粗提物(油状浸膏)共计40g(300瓶总共)。

5、化合物分离

将上述粗提物用等体积乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液浓缩。将所得乙酸乙酯部分进行反相柱色谱纯化，用体积比为10∶90至100∶0的甲醇-水体系梯度洗脱，使用薄层色谱分析含有新化合物的馏分，合并。

所得馏分用反相高效液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm，21.2×250mm)色谱柱，检测波长254nm)，采用的流动相为体积比为48∶52甲醇-水体系以10ml/min等度洗脱，收集35-37min的色谱峰，旋转蒸发仪上回收溶剂，即得本发明化合物，外观为黄色粉末状固体。

实施例2

将纯化所得化合物进行鉴定。根据高分辨质谱hr-esi-ms推测分子式为c19h20o7([m+na]⁺383.1107)。红外光谱吸收为：3390cm^-1(羟基)，2927cm^-1，2858cm^-1(饱和烷基氢)，1734cm^-1，1636cm^-1(羰基)。核磁共振数据及信号归属如表1所示(¹hnmr400mhz，¹³cnmr100mhz，溶剂dmso-d6)。其标注如图2所示。

表1

本发明具有抗肿瘤活性的化合物的¹hnmr(核磁共振氢谱)图如图3所示，本发明具有抗肿瘤活性的化合物的¹³cnmr(核磁共振碳谱)图如图4所示，本发明具有抗肿瘤活性的化合物的hsqc(异核单量子关系)图谱如图5所示，本发明具有抗肿瘤活性的化合物的hmbc(多键碳氢关系)图谱如图6所示，本发明具有抗菌活性的化合物的¹h-¹hcosy(氢-氢相关谱)图谱如图7所示。结合上述鉴定结果分析，该化合物结构如图1所示，为格菲罗霉素(gephyromycin)的一种类似物，命名为格菲罗霉素c(gephyromycinc)。

实施例3

化合物的抗肿瘤活性检测，使用mtt法进行检测，检测方法如下：

1、接种细胞：将人前列腺癌细胞(pc3)和非小细胞肺癌细胞(h1975)分别用含10％胎牛血清的培养液(dmem或者rmpi1640)配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，贴壁细胞提前12小时接种培养。

2、加入式i化合物和阳性对照药顺铂溶液(固定浓度40μm初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50％附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200μl，每种处理均设3个复孔。

3、显色：37摄氏度培养48小时后，每孔加mtt溶液20μl。继续孵育4小时，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加200μl的sds溶液(10％)，过夜孵育(温度37℃)，使结晶物充分融解。

4、比色：选择595m波长，酶联免疫检测仪(bio-radimark)读取各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(reedandmuench法)计算化合物的ic50值。结果如表2所示，gephyromycinc具有显著的抑制前列腺癌细胞和非小细胞肺癌细胞增殖的作用。

表2