一种重组融合蛋白V12‑CD137L的制备方法及应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，特别是用于重组蛋白促进淋巴细胞体外培养的一种重组融合蛋白v12-cd137l的制备方法及应用。

背景技术：

cd137l蛋白属肿瘤坏死因子超家族成员(tnfsf9)，其一级结构有254个氨基酸残基,其中0-25位氨基酸残基为胞质区,26-48位氨基酸残基为连接段,是疏水区域，可形成跨膜区,其余部分为胞外段的功能区，cd137l主要表达于活化的t细胞和b细胞，为淋巴细胞协同刺激因子，与其受体4-1bb结合，可启动双向信号转导：正向信号可刺激t细胞活化和增殖；反向信号可刺激b细胞增殖。因此，cd137l可以有效促进淋巴细胞的活化、增殖、分化，进而增强体内淋巴细胞免疫应答。许多研究表明，cd137l可以作为肿瘤相关抗原（taa）的免疫增强剂。

为了大量获得cd137l，重组蛋白表达系统（原核/真核）是一种有效、可行的技术手段。但是，天然的4-1bbl蛋白在体内以三聚体的形式存在，呈三叶螺旋桨结构，而通过表达系统表达获得的蛋白，受蛋白结构以及与细胞表面分子的亲和力等因素的影响，往往使得表达的cd137l蛋白生物活性较低、甚至不具有生物活性，从而给cd137l蛋白的人工制备带来了极大的挑战。因此，研究一种有效方法来提高cd137l的生物学功能，具有极大的医学意义和应用价值。通过改造cd137l蛋白结构，提高其与淋巴细胞的亲和力，有可能提高cd137l体外表达重组蛋白的生物活性。

技术实现要素：

本发明的目的是通过基因工程技术人工设计一种重组融合蛋白v12-cd137l，并提供其制备方法及应用。该重组蛋白可以有效提高淋巴细胞在体外的增殖，分化水平，同时还可以增强机体的细胞免疫水平，并通过大肠杆菌表达，提高制备效率，有利于工业化生产。

本发明是将艾滋病病毒gp120蛋白中的与淋巴细胞具有亲和功能的v1v2区与cd137l的功能区结合，形成一种新的重组融合蛋白,命名为v12-cd137l，v12-cd137l蛋白的氨基酸序列为seqidno.1，其中第1-76位为艾滋病病毒gp120中的v1v2区，第77-283位为cd137l的功能区。v12-cd137l重组融合蛋白可以将cd137l蛋白的功能区靶向定位到淋巴细胞上，有效提高cd137l的生物活性，促进淋巴细胞的体外增殖，增强细胞免疫水平。

本发明为人工设计一种重组融合蛋白v12-cd137l，该蛋白由艾滋病病毒gp120中的v1v2区与cd137l的功能区结合而成，兼具靶向定位淋巴细胞的功能和cd137l蛋白功能。v12-cd137l通过大肠杆菌表达，层析柱分离、纯化，最终得到高纯度、高活性的重组蛋白。该重组蛋白促进淋巴细胞在体外培养的增殖水平，且效果优于单纯的cd137l重组蛋白，同时该重组融合蛋白还能增强体内的细胞免疫水平。

本发明所述重组融合蛋白v12-cd137l的制备方法为：以seqidno.1所述氨基酸序列为模板，设计经过密码子优化的能够表达v12-cd137l蛋白的基因序列并在基因的5’端引入组氨酸标签序列，最终得到表达基因seqidno.2，所得seqidno.2基因序列插入表达系统中，通过表达得到重组的v12-cd137l融合蛋白。

本发明涉及一种重组融合蛋白v12-cd137l的制备方法及应用，所述重组融合蛋白v12-cd137l是由艾滋病病毒gp120蛋白中的与淋巴细胞具有亲和功能的v1v2区与cd137l的功能区结合而成，其氨基酸序列为seqidno.1所示，表达重组融合蛋白v12-cd137l的核苷酸序列为seqidno.2所示；seqidno.2基因序列通过以下步骤得到v12-cd137l重组融合蛋白；

本发明所述重组融合蛋白v12-cd137l具体步骤如下：

(1)人工合成seqidno.2基因，将融合基因插入大肠杆菌表达系统，获得表达v12-cd137l重组蛋白的重组大肠杆菌；

(2)将步骤(1)所得重组大肠杆菌进行37℃培养，20-25℃诱导其表达重组蛋白v12-cd137l，获得诱导后的重组大肠杆菌；

(3)将步骤(2)所得诱导后的重组大肠杆菌进行细胞破碎，通过离心获得重组大肠杆菌破碎上清液；

(4)将步骤(3)所得重组大肠杆菌破碎上清液通过层析柱进行分离纯化，得到v12-cd137l重组蛋白纯化液；

(5)将步骤(4)所得v12-cd137l重组蛋白纯化液置于透析袋中，用透析液进行透析，获得稳定的v12-cd137l重组蛋白。

本发明所述seqidno.1氨基酸序列为：

mctdlntnnttnttelsiivvweqrgkgemrncsfnittsirdkvqreyalfykldvepiddnknttnntkyrlinclacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse

所述seqidno.2基因序列为：

atgcatcaccatcatcaccactgtactgacctgaacaccaacaatactactaacaccactgaactgagcattattgttgtatgggagcagcgtggtaagggtgaaatgcgcaattgtagcttcaacattaccacctccattcgcgataaagtacagcgtgaatacgctctgttctacaaactggatgttgaaccaattgacgataacaagaacaccaccaacaacaccaaatatcgtctgattaactgtctggcgtgtccgtgggcagtgtccggtgctcgcgcttctccgggtagcgcagcatctccacgtctgcgtgaaggcccagaactgtctccggacgatccggcaggcctgctggatctgcgtcagggcatgttcgcgcaactggtggcacagaacgttctgctgattgatggcccactgtcctggtacagcgatccgggtctggcaggtgtttctctgactggtggcctgtcttacaaagaggacactaaggagctggtagtggcgaaagctggtgtatactacgtattcttccaactggagctgcgtcgtgtggttgctggcgaaggctctggtagcgtgtccctggcgctgcatctgcaaccgctgcgtagcgcagcgggtgcagcggctctggcgctgaccgtggatctgccaccggcatctagcgaggcacgtaacagcgctttcggtttccagggtcgtctgctgcacctgtctgccggtcagcgtctgggcgttcacctgcacaccgaggcacgtgcacgtcacgcttggcaactgactcagggtgcaactgtactgggcctgttccgtgtaactccggagattccggcaggtctgccgtctccgcgttccgaataactcgag

本发明所述氨基酸序列seqidno.1中，第1-76位为艾滋病病毒gp120中的v1v2区，第77-283位为cd137l的功能区，所得重组融合蛋白兼具靶向定位淋巴细胞的功能和cd137l蛋白功能。

本发明所述透析液配方为：甘氨酸1-3克，二硫苏糖醇0.1-0.3克，吐温200.5-1克加水溶解定容至1升，调节ph值至7.0-9.0。

本发明所述的v12-cd137l重组融合蛋白能促进淋巴细胞在体外培养的增殖水平，且效果优于单纯的cd137l重组蛋白。

本发明所述v12-cd137l重组融合蛋白能有效促进体内的细胞免疫水平。

本发明有益效果为：提供了一种改良的具有活化、促进淋巴细胞功能的

cd137l重组蛋白——v12-cd137l。该蛋白在cd137l蛋白的功能区的n端加上艾滋病病毒gp120蛋白中的v1v2区，使得cd137l蛋白可以靶向定位到淋巴细胞上，从而提高cd137l蛋白的生物活性。该重组蛋白可通过大肠杆菌表达，大大提高

了制备效率，有利于工业化生产。通过本发明所述方法制备的v12-cd137l重组蛋白能有效提高淋巴细胞在体外培养的增殖、分化水平，同时还可以增强机体的细胞免疫水平。

附图说明

图1.为v12-cd137l重组蛋白的表达纯化电泳图谱

m：蛋白分子量marker；

1：诱导表达前；

2：诱导表达后；

3：诱导后破菌液；

4：破菌液上清；

5：柱层析上样；

6：柱层析流穿；

7：柱层析洗脱。

图2.为v12-cd137l重组蛋白纯化样品分析

m：蛋白分子量marker；

1、2：纯化的v12-cd137l重组蛋白样品

图3.v12-cd137l蛋白对小鼠淋巴细胞培养的体外增殖作用

a：v12-cd137l蛋白5ug/ml处理淋巴细胞

b：v12-cd137l蛋白1ug/ml处理淋巴细胞

c:单独cd137l蛋白重组5ug/ml处理淋巴细胞

d:单独cd137l蛋白重组1ug/ml处理淋巴细胞

e:透析缓冲液处理淋巴细胞

f：细胞空白组

图4.v12-cd137l蛋白对艾滋病病毒gp120蛋白小鼠体内免疫的增强作用（酶联斑点免疫法）

a:单独的v12-cd137l蛋白免疫

b:单独的艾滋病病毒gp120蛋白免疫

c:v12-cd137l蛋白和艾滋病病毒gp120蛋白共同免疫。

具体实施方式

以下实施例用来解释说明本发明，但不是限制本发明，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

实施例1v12-cd137l重组蛋白的制备

(1)以seqidno.1所述氨基酸序列为模板，利用密码子兼并原则以及大肠杆菌对密码子的使用频率，设计出表达v12-cd137l重组蛋白的核苷酸序列，并在该核苷酸序列5’端引入组氨酸标签catcaccatcatcaccac，最终设计获得seqidno.2基因序列。通过人工基因合成技术合成seqidno.2基因序列，并通过ndeⅰ和xbaⅰ两个酶切位点将seqidno.2基因插入pet28a大肠杆菌表达质粒，得到重组质粒seqidno.2-pet28a。

(2)取含有大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞50微升的1.5毫升离心管一个，管置于冰上放置5分钟，加入10纳克seqidno.2-pet28a重组质粒，轻轻混匀，并于冰上孵育30分钟；将离心管置于42℃水浴锅中放置90秒，迅速取出置于冰上放置5分钟；向离心管中加入900微升lb液体培养基，37℃震荡培养45分钟，取培养产物200微升涂布于直径10厘米的lb固体培养基平皿中，37℃培养过夜。最终得到表达seqidno.2基因序列的重组大肠杆菌单克隆菌落。

(3)挑取重组大肠杆菌单克隆菌落，置于100毫升lb液体培养基中，37℃培养过夜活化；将活化后的菌液按1：100的比例接种于新鲜的lb液体培养基中，37℃下培养菌体od600至0.6，然后加诱导剂（iptg）至1毫摩尔/毫升进行诱导，诱导温度为20℃，连续诱导18小时，诱导前、诱导后样品取样进行电泳分析（见图1所示）。

(4)8000转/分钟离心15分钟收集诱导表达后的菌落，弃上清，所得沉淀用破菌缓冲液以1：10的质量体积比（g/v）重悬，并用超音仪超声破菌，超声后菌液用离心机10000转/分钟离心30分钟收集沉淀。

(5)将破菌离心后沉淀用平衡液溶解，15000转/分钟离心30分钟收集上清。所得上清液用1毫升柱体积的镍离子亲和层析柱进行层析纯化，层析条件如下：先用10毫升破菌缓冲液平衡层析柱，然后取10毫升破菌离心上清液以1毫升/分钟的流速上样至层析柱中，再用10毫升破菌缓冲液平衡层析柱，最后用洗脱液洗脱得到v12-cd137l重组蛋白纯化液（图1所示）。

(6)将所得v12-cd137l重组蛋白纯化液进行还原性蛋白电泳，结果显示（见图2所示）所得v12-cd137l重组蛋白单体分子量为32千道尔顿（kd）左右。

(7)将所得v12-cd137l重组蛋白纯化液置于8000道尔顿透析袋中，用透析液进行透析，获得透析后的v12-cd137l重组蛋白。

(8)透析后的v12-cd137l重组蛋白用细菌内毒素去除试剂去除内毒素，并用0.22微米过滤器过滤除菌，即得所需的v12-cd137l重组蛋白。

所用溶液如下：

lb液体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，加水溶解定容至1升。

lb固体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，琼脂粉15克，加水定容至1升。

破菌缓冲液：三羟甲基氨基甲烷2.4克,氯化钠29.22克，加水溶解定容至1升，调节ph值至8.0。

平衡液：甘氨酸1.5克,氯化钠29.22克，尿素480g，咪唑3.4克，加水溶解定容至1升，调节ph值至9.0。

洗脱液：甘氨酸1.5克,氯化钠29.22克，尿素480g，咪唑34克，加水溶解定容至1升，调节ph值至9.0。

透析液：甘氨酸1.5克，二硫苏糖醇0.15克，吐温200.6克加水溶解定容至1升，调节ph值至8.0。

实施例2v12-cd137l蛋白对小鼠淋巴细胞的体外增殖作用

（1）取babl/c小鼠处死，在无菌条件下取脾脏轻轻碾压，获得脾脏细胞悬液。

（2）所得脾脏细胞悬液用红细胞裂解液作用5分钟，1000转/分钟离心弃上清，再用无血清rpmi-1640培养基洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于一定量的血清rpmi-1640培养基中，获得小鼠脾淋巴细胞悬液。

（3）将小鼠脾淋巴细胞悬液稀释至5×10⁶个细胞/毫升，接种于96孔细胞培养板中，每孔100微升。

（4）同时cd137l重组蛋白和所得v12-cd137l蛋白细胞培养液分别稀释成系列浓度5毫克/毫升、1毫克/毫升，分别取各个浓度的蛋白1微升加至步骤（3）所述的含有淋巴细胞的孔板中，每个浓度的蛋白做三个细胞复孔，以蛋白的透析缓冲液作为阴性对照，以不做任何处理的细胞作为空白组。

（5）将用v12-cd137l蛋白刺激的淋巴细胞在细胞培养箱中培养24小时。

（6）在每个细胞培养孔中加入10微升cck-8细胞增殖检测试剂，细胞培养箱中继续培养3小时，取出细胞培养板，在酶标仪中用以630纳米为参比波长读取各孔的od450（450纳米波长下的吸光度值），结果见图3所示。

（7）加入v12-cd137l蛋白的淋巴细胞其od450要明显高于加入单纯cd137l重组蛋白，说明加入v12-cd137l蛋白的淋巴细胞其体外增殖水平要明显高于单独cd137l重组蛋白。

实施例3酶联斑点免疫法检测v12-cd137l蛋白对艾滋病病毒gp120蛋白的体内免疫增强作用

（1）实验动物每组设三只babl/c小鼠，分为三个组：v12-cd137l蛋白组、艾滋病病毒gp120蛋白组以及艾滋病病毒gp120蛋白和v12-cd137l蛋白共同免疫组。其中，艾滋病病毒gp120蛋白组接种量为10微克，v12-cd137l蛋白接种量为5微克，每只小鼠间隔两天加强免疫，共接种三次。

（2）在初次免疫第7天处死小鼠，在无菌条件下取脾脏轻轻碾压，获得脾脏细胞悬液。

（3）所得脾脏细胞悬液用红细胞裂解液作用5分钟，1000转/分钟离心弃上清，再用无血清rpmi-1640培养基洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于一定量的血清rpmi-1640培养基中，获得小鼠脾淋巴细胞悬液。

（4）将小鼠脾淋巴细胞悬液稀释至1×10⁶个细胞/毫升，按照酶联斑点免疫检测说明书进行操作。

（5）结果显示：v12-cd137l蛋白自身不会引起小鼠产生特异性γ干扰素表达水平，但是v12-cd137l蛋白与艾滋病病毒gp120蛋白联合免疫可以有效提高小鼠特异性γ干扰素的表达水平（见图4所示）。

sequencelisting

<110>浙江省医学科学院

<120>一种v12-cd137l重组蛋白及其制备和应用

<130>一种v12-cd137l重组蛋白及其制备和应用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>283

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

metcysthraspleuasnthrasnasnthrthrasnthrthrgluleu

151015

serileilevalvaltrpgluglnargglylysglyglumetargasn

202530

cysserpheasnilethrthrserileargasplysvalglnargglu

354045

tyralaleuphetyrlysleuaspvalgluproileaspaspasnlys

505560

asnthrthrasnasnthrlystyrargleuileasncysleualacys

65707580

protrpalavalserglyalaargalaserproglyseralaalaser

859095

proargleuarggluglyprogluleuserproaspaspproalagly

100105110

leuleuaspleuargglnglymetphealaglnleuvalalaglnasn

115120125

valleuleuileaspglyproleusertrptyrseraspproglyleu

130135140

alaglyvalserleuthrglyglyleusertyrlysgluaspthrlys

145150155160

gluleuvalvalalalysalaglyvaltyrtyrvalphepheglnleu

165170175

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180185190

alaleuhisleuglnproleuargseralaalaglyalaalaalaleu

195200205

alaleuthrvalaspleuproproalaserserglualaargasnser

210215220

alapheglypheglnglyargleuleuhisleuseralaglyglnarg

225230235240

leuglyvalhisleuhisthrglualaargalaarghisalatrpgln

245250255

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260265270

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ttcaacattaccacctccattcgcgataaagtacagcgtgaatacgctctgttctacaaa180

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gcatctccacgtctgcgtgaaggcccagaactgtctccggacgatccggcaggcctgctg360

gatctgcgtcagggcatgttcgcgcaactggtggcacagaacgttctgctgattgatggc420

ccactgtcctggtacagcgatccgggtctggcaggtgtttctctgactggtggcctgtct480

tacaaagaggacactaaggagctggtagtggcgaaagctggtgtatactacgtattcttc540

caactggagctgcgtcgtgtggttgctggcgaaggctctggtagcgtgtccctggcgctg600

catctgcaaccgctgcgtagcgcagcgggtgcagcggctctggcgctgaccgtggatctg660

ccaccggcatctagcgaggcacgtaacagcgctttcggtttccagggtcgtctgctgcac720

ctgtctgccggtcagcgtctgggcgttcacctgcacaccgaggcacgtgcacgtcacgct780

tggcaactgactcagggtgcaactgtactgggcctgttccgtgtaactccggagattccg840

gcaggtctgccgtctccgcgttccgaataactcgag876