一种抗丙型肝炎病毒抗体的获取以及应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种全人源抗hcv的单克隆中和抗体及该中和抗体的制备方法和用途。
背景技术：
：丙型肝炎病毒((hepatitiscvirus，hcv)目前仍是威胁人类健康的一大疾病，影响世界2.0-3.0％的人口。hcv是一种具有外周衣壳(pericapsid)和单链rna的属于黄病毒家族的病毒。hcv目前根据其基因序列的差异分为7种基因型，每种均以数字标记。每种基因型又进一步分为若干亚型，每种亚型均以字母标记。不同hcv基因型的流行和分布在世界各地不相同。丙型肝炎病毒是嗜肝病毒，感染肝脏细胞，引起肝脏病变，最近也有一些研究表明hcv感染可以引起肝外一些病理改变。由于hcv感染急性期患者未表现出明显的症状，大部分感染者在被确诊时己经发展为慢性化阶段。hcv感染后约一周感染者体内就能检测到hcvrna，而获得性免疫应答反应在数月之后才能检测到。对急性期hcv患者的研究表明，广泛且特异性的t细胞免疫应答在清除病毒的过程中具有重要作用。迄今为止，尚缺乏丙型肝炎病毒有效的疫苗和免疫疗法。尽管被赋予对不同病毒基因型的交叉反应性，hcv抗原结构的高变性至今仍阻碍可中和病毒的抗体的开发。因而迫切需要具有能识别不同基因型病毒特征的并从而在治疗和预防hcv感染中发挥有效作用的抗hcv抗体。越来越多的证据表明早期且特异性的抗体反应能够影响急性期hcv感染的结果，中和抗体在慢性感染的控制中具有很好的作用。如burioni等于1998年发表在《hepatology》第28卷第3期的文章就记载了编码五种特异于hcve2糖蛋白(hcve2)的重组人抗体片段(fab)的序列的克隆和鉴定，所述的抗体片段能够结合不同病毒基因型的糖蛋白(交叉反应性)。随后又发现了能够在体外有效地中和不同hcv基因型的感染的e20抗体片段，但该研究直到现在还没有成功上市。而本发明提供的全人源抗hcv的单克隆中和抗体，且中和能力很强，由其针对病毒株s52(3a)和hk6a，ic50值仅为4.6nm和6.6nm。trn1007抗体优异的中和活性显示其在疫苗中的良好应用前景。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能够结合来自多种不同基因型的hcv病毒的全人源单克隆中和抗体或其抗原结合片段，其作为治疗或预防hcv感染的药剂，其特征在于所述抗体结合hcv表面包膜糖蛋白e2。进一步，所述重链可变区的互补性决定区域cdr1、cdr2、cdr3和/或轻链可变区的互补性决定区域cdr1、cdr2、cdr3；重链cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示；轻链cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8所示。其中所述重链可变区的互补性决定区域和/或轻链可变区的互补性决定区域经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其片段具有相同或相似活性，或者分别与seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示的序列至少具有80％同源性；轻链cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8所示，或者分别与seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8所示的序列至少具有80％同源性。进一步，所述抗体或其抗原结合片段包含至少一个包含氨基酸序列seqidno：1或与seqidno：1具有至少80％同一性的序列的重链可变区，以及至少一个包含氨基酸序列seqidno：2或与seqidno：5具有至少80％同一性的序列的轻链可变区。进一步优选的序列同一性百分比是至少81％、83％、85％、87％、89％、90％、91％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，其中所述表述“至少”是指对于所列的每个百分比。包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的全人源抗hcv的单克隆中和抗体结合性质和中和性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。本发明的抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与trn1007抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。进一步，所述抗体的抗原结合片段包括fab、fab′、f(ab′)2、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(例如，scfv)、嵌合抗体、双抗体和这样的多肽，或同时包含重链与轻链可变区或cdrs的单链抗体，或包含来源于免疫球蛋白重链可变区与轻链可变区的cdr片段的一个或更多个拷贝的骨架，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。术语“抗体”意指任意种类的全长免疫球蛋白及其包含轻链可变区与重链可变区的任意片段，例如fab、f(ab’)2、cdr(互补决定区)，或同时包含重链与轻链可变区或cdrs的单链抗体，或包含来源于免疫球蛋白重链可变区与轻链可变区的cdr片段的一个或更多个拷贝的骨架。术语“fv”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段；术语“dab”意指由vh结构域组成的抗体片段；术语“fab”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab')2”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段。本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。本发明的抗体可以是游离形式或缀合形式。缀合形式是与能够调节体内持续性、促进或限制体内分布、降低对蛋白水解剂的敏感性、降低抗原性、提高细胞毒能力和/或易于在体液和组织中检测的分子缀合的上述的抗体。适于缀合的分子的非限制例子包括人血清白蛋白，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽-s-转移酶，噬菌体外壳p3或p8蛋白，肽，糖，peg或peg样分子，动物、植物或微生物源毒素，细胞因子，酶，化学发光化合物，生物发光化合物，金属原子，放射性同位素，荧光化合物，标签基团或磷酸化、糖基化、泛素化、苏素化或内肽酶解的底物。为便于缀合，抗体的c末端或n末端可以是修饰的，例如，通过插入额外的氨基酸残基，如一个或更多个可形成二硫桥的半胱氨酸残基。本发明应用的抗体还可以连接人红血球或其它细胞载体，连接特定制剂，或连接缓释系统例如但不限于脂质体、树形聚合物、微粒体、纳米颗粒、微胶囊、病毒载体等等。本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码seqidno:1所示的氨基酸序列或seqidno:5所示的氨基酸序列。本发明的编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子包括具有上述核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内。本发明还提供了一种前面所述的核酸分子的dna片段。所述dna片段可以编码抗体重链或轻链可变区的任何区域，包括重链cdr1、cdr2、或cdr3，或轻链cdr1、cdr2、或cdr3。本发明的另一目标是治疗或预防hcv感染的药物组合物，包含药学有效量的上述定义的单克隆抗体或其片段。所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于已经被美国食品与药品管理局认可的而可用于人类或动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、稀释剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗压剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。本发明的组合物可被施用给被hcv感染的或有感染风险的受试者。可以应用任何合适的施用途径，包括胃肠外的、口服、眼、局部(topical)、局部区域(loco-regional)、灌肠或气溶胶给药。胃肠外给药包括肌内注射、静脉注射、淋巴管内注射、皮下或皮内注射及输注。本发明还提供了一种前面所述的全人源抗hcv的单克隆中和抗体的制备方法，所述制备方法采用的是单个b淋巴细胞抗体制备技术。所述单个b淋巴细胞抗体制备技术是将单细胞分离鉴定技术结合多种pcr技术形成的一种单克隆抗体的体外表达系统，即从人的b细胞中直接获取全人源的单克隆抗体的方法。进一步，所述方法包括如下步骤：(1)检测发现hcv感染患者；(2)分离hcv感染患者静脉血中的单个核细胞，之后利用流式细胞术进行细胞分选，分选出含有cd235a-/igd-/cd20+/cd27all的记忆性b细胞；(3)利用单细胞rt-pcr扩增步骤(2)获得的单个b细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；(4)将步骤(3)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；(5)抗体筛选平台筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的全人源抗hcv的单克隆中和抗体。本发明还提供了前面所述的全人源抗hcv的单克隆中和抗体或其片段在制备hcv检测产品中的应用。所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出hcv的检测产品均包括在本发明的范围之内。本发明还提供了前面所述的全人源抗hcv的单克隆中和抗体或其片段在制备前面所述的药物组合物中的应用。本发明还提供了前面所述的全人源抗hcv的单克隆中和抗体或其片段在制备抑制hcv药物中的应用。本发明还提供了前面所述的全人源抗hcv的单克隆中和抗体或其抗原结合片段在制备检测、预防或治疗由hcv感染引起的疾病的产品中的应用。进一步，所述由hcv感染引起的疾病包括肝病，如肝炎、肝硬化或肝癌和肝外疾病。本发明的肝炎是指急性或慢性丙型肝炎。本发明的抗体trn1007可以用于治疗急性、慢性丙型肝炎患者，所述治疗是通过给予这些患者治疗有效量的能够结合hcve2的抗体。“治疗有效量”是指能够在个体中有效减轻hcv感染症状的剂量，或者是有效降低循环中病毒颗粒的剂量。该抗体也可以用于例如hcv阳性携带者分娩的新生儿的被动免疫，还可以用于肝移植的被动免疫以防止这些患者可能出现的反复hcv感染。特别地，对于预计没有来自干扰素治疗的治疗效果的、感染基因型的丙型肝炎患者，可以减轻不良反应，并且可以提供选择新的治疗方法的机会。附图说明图1为抗体trn1007的sds-page和western-blot检测图；左侧为sds-page图，1为非还原样品，m为marker，2为还原样品；右侧为western-blot图，1为非还原样品，m为marker，2为还原样品；图2是抗体与不同亚型的hcv病毒中和活性测定图；图3是抗体与hcv7种不同基因型的抗原结合检测图；图4是biacore检测抗体trn1007与4种不同基因型抗原的亲和力结果图；a为e2-core-2a、b为e2-core-4a、c为e2-core-6a、d为e2-core-7a。具体实施方式下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1、记忆性b细胞分选策略流式细胞术(flowcytometry，fcm)是高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术，代表了一种用于选择高亲和力人单克隆抗体的高度有效工具。实际上，基于流式技术的分选步骤非常灵活，并且可被优化用以选择交叉反应的抗体。特别地，hcv-i002血液样本源于已确认的hcv感染患者，淋巴细胞分离管分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)后利用bdfacsria流式细胞仪(bdbiosciences,sanjose，ca)进行细胞分选，获得特异性标记荧光素的抗原得到e2双荧光标记的靶细胞。简要地，用这种方法可以获得在自然感染过程中产生的抗体，但其仍然能够结合从未被所选择研究患者的免疫系统遇到过的不同糖蛋白。2、重链和轻链序列获取将含有单个b淋巴细胞进行逆转录pcr条件，产物cdna采用巢式pcr方法扩增重链和轻链的可变区目的基因。使用2％琼脂糖凝胶进行电泳实验进行鉴定，凝胶成像系统检测pcr产物大小。鉴定获得的重链和轻链序列均为全人源化序列。3、鉴别目的抗体在大肠杆菌dh5α中大量扩增表达阳性抗体重链和轻链基因的质粒，抽提后用转染试剂polyetherimide共转染cho细胞，培养、收集细胞上清进行elisa筛选检测。将筛选到的有结合活性的抗体进行中和实验，中和效率最好的抗体即为目的抗体trn1007。4、抗体大量表达与纯化将中和实验鉴定出的有中和活性的编号为hcv的抗体重链与轻链的表达载体(其中，重链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示；抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示)转染cho细胞，37℃、5％co2培养箱培养96小时。然后收集转染上清，亲和层析法进行纯化。通过sds-page和western-blot检验hcv抗体的表达及纯化结果，结果如图1所示，得到较纯蛋白，并可清晰观察到解链后的抗体轻、重链。实施例2trn1007抗体与不同的hcv真病毒株的中和活性评估简要地，铺huh7细胞于96孔板中，过夜培养，感染时细胞约30％铺满。hcv真病毒株(h77、con1、jfh1、s52、ed43、sa13、hk6a)与不同浓度的抗体混合，起始浓度25μg/ml，3倍稀释，室温放置30min。加入hcv真病毒株(h77、con1、jfh1、s52、ed43、sa13、hk6a)与抗体混合液于96孔板，感染huh7细胞。对照组仅加入hcv病毒株2g9，感染24h后换液，继续培养1-2天。感染后2-3天后测定活性，读取荧光值。比较抗体与对照组，计算中和效率。结果如表1和图2所示。trn1007抗体对hcv真病毒株jfh1(2a)、s52(3a)、ed43(4a)、hk6a的中和能力均很强，特别是病毒株s52(3a)和hk6a，ic50值仅为4.6nm和6.6nm。中和活性是抗体抗病毒免疫的主要指标之一，trn1007抗体优异的中和活性显示其在免疫治疗和预防的良好应用前景。表1trn1007抗体与不同的hcv病毒株的中和效率病毒株/mab(ug/ml)trn10072g9h77(1a)0.3096>50con1(1b)41.00>50jfh1(2a)0.02666>50s52(3a)0.004595>50ed43(4a)0.07398>50sa13(5a)1.633>50hk6a0.006617>50实施例3trn1007抗体与不同基因型来源的hcv抗原的结合活性评估以不同的hcv病毒株(1a、1b、2、3、4、5、6、7)膜蛋白e2为抗原，并用包被液将抗原稀释浓度为100ng/ml，包被于elisa96孔板，每孔100μl，4℃过夜。封闭液37℃封闭2个小时。封闭后加一抗，起始浓度为25μg/ml，3倍梯度稀释，每孔体积为100μl，37℃孵育1个小时，同时用hcv阳性病人血清作为阳性对照，狂犬抗体为阴性对照。用hrp标记的羊抗人igg(1:2000稀释)作为二抗37℃孵育1个小时。加入底物显色液(tmb)100μl/孔，37℃避光放置5min后，用2m硫酸中止反应，用450nm波长进行比色。结果如图3所示，表明trn1007抗体能够结合所有不同的hcv病毒株(1a、1b、2、3、4、5、6、7)的膜蛋白e2，即显示trn1007抗体具有识别所有不同的hcv病毒；其相对于用对照hcv阳性病人血清具有更高的od值，而且低浓度trn1007抗体和不同抗原的结合活性依然很强。实施例4trn1007抗体与hcv的包膜糖蛋白的亲和活性评估利用捕获法将羊抗人igg抗体作为捕获分子固定在cm5传感器芯片上，按照偶联试剂盒的操作将其偶联到cm5芯片金薄膜表面上，然后活化活化芯片的葡聚糖表面、确定偶联量，乙醇胺封闭表面残留的活化基团；cm5芯片上捕获分子捕获配体：将制备的trn1007抗体作为配体。trn1007与抗原即不同基因型的hcv的包膜糖蛋白(hcv-e2-core)结合的亲和力和动力学分析：hcv-e2-core蛋白用hbs-ep缓冲液稀释作为分析物，分析物以逐渐增高的浓度(20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/ml)依次流过芯片，分别得到信号曲线(见图4)。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用3mol/l的氯化镁再生芯片以回复到原始未结合抗原的状态。用biacorex-100system软件进行分析，进而得到亲和力和动力学参数，具体见表2，trn1007抗体与抗原e2-core-2a、e2-core-4a、e2-core-6a和e2-core-7a的kd值分别为1.07e-12m、1.59e-12m、1.79e-10m、1.78e-11m，显示抗体与不同的抗原亲和力都较高。表2biacorex-100测定亲和力和动力学结果参数表ligandka(1/ms)kd(1/s)kd(m)e2-core-2a8.05e+048.63e-081.07e-12e2-core-4a4.51e+047.17e-081.59e-12e2-core-6a29945.36e-071.79e-10e2-core-7a9.44e+041.68e-061.78e-11虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。sequencelisting<110>广州泰诺迪生物科技有限公司珠海泰诺麦博生物技术有限公司暨南大学<120>一种抗丙型肝炎病毒抗体的获取以及应用<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>128<212>prt<213>人工序列<400>1gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser151015servallysvalsercyslysalaserglyglyserpheargsertyr202530glyphesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyargileileproalaalaasnphealaasptyralaprolysphe505560glnaspargvalthrileseralaasplysserthrserthralatyr65707580metgluleulysserleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys859095alaargaspglnaspleuserglygluleuthralaleutyrtyrtyr100105110hisglyleuaspvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalserser115120125<210>2<211>8<212>prt<213>人工序列<400>2glyglyserpheargsertyrgly15<210>3<211>8<212>prt<213>人工序列<400>3ileileproalaalaasnpheala15<210>4<211>21<212>prt<213>人工序列<400>4alaargaspglnaspleuserglygluleuthralaleutyrtyrtyr151015hisglyleuaspval20<210>5<211>108<212>prt<213>人工序列<400>5gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015glnargvalthrleusercysargalaserglnservalserasnasn202530tyrilealatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045ileserglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser505560glythrglyserglythraspphethrleualaileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglyaspserphe859095trpthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>6<211>7<212>prt<213>人工序列<400>6glnservalserasnasntyr15<210>7<211>3<212>prt<213>人工序列<400>7glyalaser1<210>8<211>9<212>prt<213>人工序列<400>8glnglntyrglyaspserphetrpthr15当前第1页12