检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光RT‑RPA试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物监测技术领域，尤其涉及一种检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光rt-rpa试剂盒及方法。

背景技术：

猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea，ped）是由猪流行性腹泻病毒（pedv）引起的，以水样腹泻、呕吐、脱水为主要临床症状的急性、高度接触性猪肠道传染病，各年龄段猪均可发生，以哺乳仔猪的发病和死亡最为严重，pedv属于冠状病毒科alpha冠状病毒属，是一种具有囊膜的、单股正链rna病毒，ped于1971年在英国猪群中首次报道，然后迅速传播至欧洲和亚洲多个国家，1973年，ped在我国首次发生，并在2010年以前在我国猪群中呈散发性存在，2010年冬季以来，一种高致病性pedv在我国猪群中开始流行并造成了严重的经济损失，猪群感染高致病性pedv后，发病率可达100%；在10日龄以下仔猪死亡率可到80-100%，从而对我国养猪业造成了严重的打击，2013年4月底，美国首次爆发ped疫情并迅速蔓延至美国各州，2014年1月底，加拿大首次发生ped，目前，ped对全球养猪业造成了严重的威胁和经济损失。

对pedv的早期、快速和有效检测是预防和控制ped疫情传播的重要手段之一，目前，已经建立了多种pedv检测方法，主要包括病毒分离鉴定、间接免疫荧光方法、免疫电镜法和elisa等传统方法，但是，这些传统方法费时费力、灵敏性较低，随着分子生物学的发展，一系列pcr方法也建立起来，如rt-pcr、纳米颗粒rt-pcr、实时荧光rt-pcr等，但是rt-pcr方法需要精确度高、操作复杂和价格昂贵的pcr仪，并且需要良好的实验室个和熟练的技术人员，因此，rt-pcr系列方法不适合在贫困落后地区装备较差的实验室，更不适合现场检测，目前也建立了多种用于pedv检测的等温检测方法，主要包括绝缘等温pcr（iipcr）、rt-lamp和交叉引物扩增方法（rt-cpa）等，上述等温方法一般需要45-60min才能完成检测，并且rt-lamp方法需要6条引物，rt-cpa则需要3条引物和2条探针。这些都使得这些方法难以设计，并且需要较长时间才能完成检测。

技术实现要素：

针对现有技术存在的对设备及实验条件要求高，检测时间长，所需引物数量多等问题，本发明提供一种检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光rt-rpa试剂盒及方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种检测猪流行性腹泻病毒的核酸，包括检测猪流行性腹泻病毒的上游引物、下游引物和exo探针，其中，所述上游引物的序列如seqidno.1所示，所述下游引物的序列如seqidno.2所示，所述exo探针的序列如seqidno.3所示，其中，所述exo探针的第30位t碱基标记荧光基团，第33位t碱基标记荧光淬灭基团，第32位为脱碱基位点，且原t碱基替换为四氢呋喃，序列信息如表1所示。

表1

进一步地，本发明还提供了所述检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光rt-rpa试剂盒，该实时荧光rt-rpa试剂盒，包括检测猪流行性腹泻病毒的核酸，trizol试剂、冻干酶制剂、醋酸镁溶液。

相对于现有技术，本发明提供的检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光rt-rpa试剂盒，操作简单，使用方便，省时省力，该实时荧光rt-rpa试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒，检测效果好，特异性强，灵敏度高，适用性强。

相应地，本发明提供了检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光rt-rpa方法，该实时荧光rt-rpa方法至少包括以下步骤：

（1）从样品中提取rna；

（2）将步骤（1）中所得的rna进行等温扩增，将反应体系加入到装有冻干酶制剂的反应管中，补加醋酸镁溶液，于40℃恒温反应20min；

（3）待测样品中有明显的扩增曲线，则判定为阳性；若无明显的扩增曲线，则判定为阴性。

相对于现有技术，本发明的实时荧光rt-rpa方法，操作简便，特异性强，灵敏性高，并且不需要复杂的仪器设备，能够在4-15min内实现对pedv阳性样品的快速检测，对于欠发达地区和设备较差实验室的pedv检测，以及现场pedv的检测具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例pedv实时荧光rt-rpa方法的特异性分析结果；

图2是本发明实施例pedv实时荧光rt-rpa方法的灵敏性分析结果；

图3是本发明实施例pedv实时荧光rt-rpa方法的灵敏性分析结果的probit回归分析；

图中：1、pedvcv777；2、pedvjscz1601；3、tegv；4、pdcov；5、porv；6、csfv；7、ppv；8、l.intracellularis。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种检测猪流行性腹泻病毒的核酸，该核酸，包括检测猪流行性腹泻病毒的上游引物、下游引物和exo探针，其中，所述上游引物的序列如seqidno.1所示，所述下游引物的序列如seqidno.2所示，所述exo探针的序列如seqidno.3所示，其中，所述exo探针的第30位t碱基标记荧光基团，第33位t碱基标记荧光淬灭基团，第32位为脱碱基位点，且原t碱基替换为四氢呋喃，序列信息如表2所示。

表2

优选地，荧光基团为fam；荧光淬灭基团为bhq1。

本发明实施例还提供了所述检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光rt-rpa试剂盒，该实时荧光rt-rpa试剂盒，包括检测猪流行性腹泻病毒的核酸，trizol试剂、冻干酶制剂、醋酸镁溶液。

优选地，冻干酶制剂包括dntp、单链结合蛋白、reca重组酶、bsudna聚合酶、exo核酸外切酶、三（羟甲基）甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇、肌酸激酶，与实时荧光rpa方法的反应体系共同作用，完成检测反应。

进一步优选地，dntp的浓度为1mmol/l。

进一步优选地，单链结合蛋白浓度为90ng/μl。

进一步优选地，reca重组酶浓度为120ng/μl。

进一步优选地，bsudna聚合酶浓度为30ng/μl。

进一步优选地，exo核酸外切酶浓度为30ng/μl。

进一步优选地，三（羟甲基）甲基甘氨酸浓度为100mmol/l。

进一步优选地，聚乙二醇浓度为20%。

进一步优选地，二硫苏糖醇浓度为5mmol/l。

进一步优选地，肌酸激酶浓度为100ng/μl。

进一步优选地，m-mlv反转录酶浓度为4u/μl。

进一步优选地，rna酶抑制剂浓度为0.4u/μl。

本发明实施例提供的检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光rt-rpa试剂盒，操作简单，使用方便，省时省力，该实时荧光rt-rpa试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒，检测效果好，特异性强，灵敏度高，适用性强。

本发明在提供检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光rt-rpa试剂盒的前提下，还进一步提供了检测猪流行性腹泻病毒的实时荧光rt-rpa方法。

在一实施例中，该实时荧光rt-rpa方法至少包括以下步骤：

（1）从样品中提取rna；

（2）将步骤（1）中所得的rna进行等温扩增，将反应体系加入到装有冻干酶制剂的反应管中，补加醋酸镁溶液，于40℃恒温反应20min；

（3）待测样品中有明显的扩增曲线，则判定为阳性；若无明显的扩增曲线，则判定为阴性。

下面对上述制备方法做进一步的解释说明：

优选地，步骤（2）中，等温扩增的反应体系为：

反应体系为50μl：10μmol/l的检测猪流行性腹泻病毒的上游引物和下游引物各2.1μl、10μmol/l的exo探针0.6μl、反应缓冲液12.5μl、模板1μl、ddh2o29.4μl，所述反应体系在最后加入2.5μl浓度为280mmol/l的醋酸镁溶液。

进一步优选地，反应缓冲液为浓度为20%的聚乙二醇溶液。

由于本发明提供的实时荧光rt-rpa方法，操作简便，特异性强，灵敏性高，并且不需要复杂的仪器设备，能够在4-15min内实现对pedv阳性样品的快速检测，对于欠发达地区和设备较差实验室的pedv检测，以及现场pedv的检测具有重要意义。

为了更好的说明本发明实施例提供的检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光rt-rpa试剂盒及方法，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

病毒dna/rna提取

pedv（jscz1601株，变异株）、传染性胃肠炎病毒（tgev，减毒h株）、猪轮状病毒（porv，hb-bd/2016株）、胞内劳森氏菌（lintracellularis，lx5株）均保存于本实验室。pedv(cv777株，经典株)、猪瘟病毒（csfv，av1412株）、猪细小病毒（ppv，bj-2株）均来自商业化弱毒疫苗；猪delta冠状病毒（pdcov）rna来自经实时荧光rt-pcr检测为pedv阴性而pdcov阳性的猪小肠样品。

76份猪小肠样品均来自具有水样腹泻和脱水症状的7至14日龄仔猪，来自于2016年4月到2017年2月间的河北省11个猪场，使用ph值7.4的pbs将上述猪小肠样品进行均质化处理，制成10%(w/v)匀浆液，4℃条件下3000g离心10min，取200µl用于病毒rna提取。

根据trizol试剂使用说明，使用trizol试剂(invitrogen，waltham，usa)提取pedv、tegv、porv、csfv病毒rna；根据tianamp病毒dna提取试剂盒(tiangen，beijing，china)使用说明，提取ppv和l.intracellularisdna；使用trizol试剂提取上述200μl猪小肠匀浆液上清的病毒rna，并将提取病毒rna溶解于20µl无rnase的ddh2o中，使用nd-2000c核酸浓度测定仪(nanodrop，wilmington，usa)进行病毒rna、dna浓度测定，所有的病毒rna和dna均保存于-80℃。

实施例2

体外转录pedvrna

以n-f和n-r作为引物，如表3所示，以pedvcv777株病毒基因组rna作为模板进行rt-pcr，获得pedv核衣壳基因（n基因），全长1326bp，rt-pcr的反应体系为50μl，包括2×一步法buffer25μl，一步法酶混合物(takara，dalian，china)2μl，n-f(20μmol/l)0.5μl，n-r(20μmol/l)0.5μl，pedvrna5μl，ddh2o17μl，rt-pcr反应条件为：50℃，30min，1个循环；94℃，2min，1个循环；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，32个循环。

使用天根dna纯化试剂盒对rt-pcr产物进行纯化，然后连接到pgem-teasy载体(promega，madison，usa)并转化到大肠杆菌感受态细胞dh5α中，挑取转化的阳性克隆，提取质粒并测序，通过测序方法确认转化的阳性克隆，获得重组质粒pgem-t-pedv-n，使用宝生物限制性内切酶ndei对重组质粒进行线性化，并使用wizardsv胶及pcr纯化试剂盒(promega，madison，usa)进行纯化，然后使用ribomax大量rna生产体系-t7试剂盒(promega，madison，usa)进行体外转录，以获得体外转录的pedvrna，使用无rnase的rq1dnase对体外转录的pedvrna进行消化，并通过rna琼脂糖凝胶电泳确定获得体外转录rna的大小及完整性，使用nd-2000c核酸浓度测定仪测定体外转录rna的浓度，并通过下列公式计算体外转录rna的拷贝数：rna浓度（拷贝/μl）=[rna浓度(g/μl)/(体外转录rna长度×340)×6.02×10²³。

表3

实施例3

检测猪流行性腹泻病毒上、下游引物和exo探针的设计

pedvn基因高度保守，并且在病毒复制过程中能够复制，因此将pedvn基因作为实时荧光rt-rpa的靶基因。根据genbank中pedv不同参考序列(登录号：jn173295；kx168410；jq743654；kf840555；kj646621；kt323979；kt800000)，根据pedvn基因设计上、下游引物和exo探针，具体信息见表1，上、下游引物和exo探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

实施例4

实时荧光rt-rpa反应

使用twist公司的twistamp^tmrtexokit(twistdx，cambridge，uk)建立实时荧光rpa方法，反应体系为50μl，其中10μmol/l的pedv-rpa-f和pedv-rpa-r各2.1μl（终浓度0.42μmol/l），10μmol/lpedv-rpa-p0.6μl（终浓度0.12μmol/l），反应buffer（20%聚乙二醇）12.5μl，模板1μl，ddh2o29.4μl；将上述47.5μl体系混匀后加入到装有冻干酶制剂（1mmol/l的dntp、90ng/μl的单链结合蛋白、120ng/μl的reca重组酶、30ng/μl的bsudna聚合酶、30ng/μl的exo核酸外切酶，100mmol/l的三（羟甲基）甲基甘氨酸、20%的聚乙二醇、5mmol/l的二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶、4u/μl的m-mlv反转录酶、0.4u/μlrna酶抑制剂）的反应管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反应管中加入2.5μl醋酸镁（280mmol/l），瞬时离心并涡旋后放入genieiii中40°c反应20min。

实施例5

特异性和灵敏性分析

特异性分析

使用10ng病毒rna或dna作为模板，进行所建立的pedv实时荧光rt-rpa方法的特异性分析。特异性实验中包括能够引起猪腹泻的重要病原，主要是pedv，tgev，pdcov，porv，csfv，ppv和l.intracellularis。特异性分析进行5次重复。

实时荧光rt-rpa方法的特异性试验结果如图1所示，所建立的实时荧光rt-rpa方法对pedv经典株cv777和变异株jscz1601均呈现特异性扩增，而对其他常见的猪重要病原，tgev、pdcov、porv、csfv、ppv和l.intracellularis没有任何扩增，5次试验结果一致，说明所建立的实时荧光rt-rpa方法具有良好的特异性。

灵敏性分析

对体外转录rna进行10倍系列稀释，使rna浓度在10⁶至10⁰拷贝/μl之间，并以之作为pedvrt-rpa灵敏性分析的模板。在rt-rpa反应体系中，加入1μl不同浓度的体外转录rna作为模板进行扩增，以确定所建立方法的检出限。同时，使用上述不同浓度的rna作为模板，进行8次独立分析，并使用spss软件对检测结果进行probit回归分析，以确定所建立方法在95%置信区间下的灵敏性。

灵敏性试验结果如图2、3所示，所建立的实时荧光rt-rpa方法的检出限为10¹拷贝，在8次独立的灵敏性试验中，对于浓度在10⁶到10²之间的pedvrna，rt-rpa均可检出；浓度为10¹的pedvrna，rt-rpa检出4次；浓度为10⁰的pedvrna，rt-rpa均未检出，probit回归分析表明，所建立的pedv实时荧光rt-rpa方法在95%置信区间下的灵敏性为23拷贝。

实施例6

临床样品的检测

通过建立的实时荧光rt-rpa方法，对76份临床猪小肠样品进行pedv检测，结果在42份样品中检出pedv，阳性率为55.3%，进一步分析表明该方法在4-15min内即可实现对全部阳性临床样品的检测。

由以上实施例可得，本发明所提供的实时荧光rt-rpa方法特异性强，灵敏性高，操作简便，并且不需要复杂的仪器设备，对于欠发达地区和装备较差实验室的pedv检测，以及现场pedv的检测具有重要意义，有效的预防和控制pedv在猪群的传播。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河北省检验检疫科学技术研究院

<120>检测猪流行性腹泻病毒的核酸、实时荧光rt-rpa试剂盒及方法

<130>2017-08-18

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>31

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gtagttgagattgttgaacctaacacacctc31

<210>2

<211>33

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

gctccacgaccctggttatttccacgattctgt33

<210>3

<211>50

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

gcttcacgtacaaattcgcgtagcaggagtctggcaatggcaacaacag49

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

atggcttctgtcagctttcagg22

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

ttaatttcctgtgtcgaa18