一种携带分子开关的抗HER2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用的制作方法

本发明涉及生物基因领域，更具体的说，是一种携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用。

背景技术：

在肿瘤治疗方法中，除了常规的手术、放疗、化疗外，嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)t细胞治疗因具有众多的优点成为研究热点。car-t细胞治疗的原理是对t细胞加以修饰，修饰后的t细胞能够获得特异性识别肿瘤相关抗原和攻击杀伤肿瘤细胞的能力，既可以靶向杀伤肿瘤细胞，又不会伤及正常细胞，达到清除肿瘤的目的。相对于放、化疗法对患者造成的免疫系统功能下降、病情易复发以及药物治疗产生的耐药性等缺点，该方法毒副作用较小。car-t细胞疗法已经用于临床治疗恶性肿瘤，并取得了一些临床疗效，以cd19-car-t和cd20-car-t细胞治疗淋巴细胞瘤和白血病最为突出，有些已经进入ⅱ期临床试验。因此，car-t细胞作为一种全新的生物免疫治疗方法，在肿瘤的靶向治疗方面具有良好的应用前景。

car-t细胞过继性免疫治疗对大多数癌症有效，但会产生一些严重的不良反应，car-t细胞可能产生针对正常组织细胞的误攻击(脱靶效应)，或释放大量的细胞因子引起细胞因子风暴，严重时可导致患者死亡等毒副作用。目前已有报道的因注射car-t而导致患者死亡的案例(针对her2引起的肺部积水导致患者死亡和针对cd19特异性识别caix抗原引起的肝中毒现象)。为了解决这一安全性隐患，目前最常用方法是引入一个自杀机制，使car-t细胞共同表达car和自杀基因，既保证对肿瘤的杀伤效果，又提高治疗的安全性。

原癌基因人上皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,her-2)又称her2或c-erbb-2基因，编码跨膜受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性。单克隆抗体可通过her2下调来抑制肿瘤生长，her2基因过度表达可导致细胞过度增殖和表型恶性转化，因此，her2是肿瘤复发和生存期长短的独立预后因子。her2基因是与乳腺癌的生长、侵袭、转移有关的重要癌基因，研究表明侵袭性乳腺癌患者高度表达her2基因，导致这些癌细胞表面的her2蛋白增多，也称为her2蛋白过表达。her2蛋白的过表达，就会刺激癌细胞疯狂增长，侵袭性增加，进而导致癌症的形成。相关研究发现her2蛋白过表达与乳腺癌患者的无病生存总和的生存期有一定关系。乳腺癌发病率已居女性各种恶性肿瘤前列，且其发生率及病死率有逐年上升的趋势。在中国，30％的乳腺癌患者为her2阳性乳腺癌患者，这类患者肿瘤细胞恶性程度更快，疾病进展速度更快、更易发生转移和复发、且预后不佳。研究还发现，除了在乳腺癌中her2过表达发生外，其过表达还在胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌等多种形式的恶性癌症中发生，值得重视。

技术实现要素：

为了弥补以上不足，本发明提供了一种携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用。

本发明的方案是：

一种携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞中含抗her2安全型嵌合抗原受体基因，所述抗her2安全型嵌合抗原受体基因包括her2的单链抗体并链接了一个分子开关，所述her2的单链抗体包括cd8leader、her2结合区、cd8的铰链区、跨膜-刺激结构域、cd3ζ刺激信号传导区。

作为优选的技术方案，所述跨膜-刺激结构域选自cd8、cd27、cd28、cd137/4-1bb、cd134/ox40、icos分子的全部或部分片段。

作为优选的技术方案，所述分子开关是基于fas基因的fkbp12-f36v自杀开关元件。

作为优选的技术方案，所述分子开关包括fk506结合蛋白12-二聚化化学诱导子系统(fk506bindingprotein12-chemicalinducersofdimerizations，fkbp12-cid)，fkbp配体二聚体ap1903(对内源性蛋白质具有特异性)，以及fas基因(肿瘤坏死-神经生长因子受体超家族的成员)，所述分子开关位于在所述her2的单链抗体的n端或c端；fkbp12-f36v包含一个fkbp12结构域，在第36个氨基酸残基位点上phe替代了val，它具有高选择性和亚纳摩尔亲和力。二聚体ap1903能激活fas蛋白交联形成诱导死亡的复合物，从而介导靶细胞凋亡。其工作原理见图1。

作为优选的技术方案，所述免疫细胞为自体的或转基因的t细胞、nk细胞、中粒细胞、单核细胞、细胞毒性t淋巴细胞、调节t细胞、记忆性t细胞、双特异性t细胞、cik细胞其中的一种。

作为优选的技术方案，所述抗her2安全型嵌合抗原受体基因将fkbp12-linker-fas-t2a-leader-scfv(her2)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ的核酸序列连接在一起，形成重组基因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的特异性嵌合抗原受体基因dna。

作为优选的技术方案，所述fkbp12-linker-fas-t2a-leader-scfv(her2)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ重组基因为序列表seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明还公开了一种治疗癌症的药物，含有所述携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。

所述的携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞用于制备治疗恶性癌症的药物的用途。

优选的技术方案，所述恶性癌症为乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌等。

由于采用了上述技术方案，一种携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞中含抗her2安全型嵌合抗原受体基因，所述抗her2安全型嵌合抗原受体基因包括her2的单链抗体并链接了一个分子开关，所述her2的单链抗体包括cd8leader、her2结合区、cd8的铰链区、跨膜-刺激结构域、cd3ζ刺激信号传导区。

该发明优点：

本发明在第三代car-t受体技术的基础上，制备了一种共同含有her2作为抗原受体和基于人的fas基因的fkbp新型自杀基因系统的car-t细胞，该细胞既增强了对乳腺癌细胞的杀伤效果，又可及时中止因脱靶效应或细胞因子风暴为患者带来的安全隐患。

本发明所述的是基于人的fas基因的fkbp12-f36v新型自杀基因系统，与其它自杀基因系统相比，其基因组结构较稳定，在fkbp的配体二聚体ap1903作用下，能够快速有效的杀死靶细胞，防止因脱靶效应或免疫因子释放综合征对患者造成的致病伤害，安全性较高。

本发明所述的基于人的fas基因的fkbp12-f36v新型自杀基因系统添加了自裂解多肽t2a与car结构相连接，t2a通过自剪切功能使得car进入细胞后既高度表达该特异性嵌合抗原受体基因，又表达分子开关，两者功能相互独立，互不干扰。

附图说明

图1基于fas基因的fkbp12-f36v分子开关原理图。

图2含有分子开关的anti-her2的car模块图。

图3流式细胞术检测具有分子开关的her2-car载体在t细胞表面的表达情况。图4鼠模型t淋巴细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线图。

图5为本发明所述的fkbp12-linker-fas-t2a-leader-scfv(her2)-cd8α-cd28-cd137-cd3ζ重组基因设计图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可从商业途径获得。

实施例1：携带分子开关的her2特异性car表达载体的构建

含有分子开关的anti-her2的car模块示意见图2(完整核酸序列见附录seqidno.1)。

携带分子开关的anti-her2的car各模块核酸序列

(1)fkbp-f36v核酸人工序列(seqidno.2)

(2)linker核酸人工序列(seqidno.3)

(3)fas核酸人工序列(seqidno.4)

(4)自裂解多肽t2a核酸人工序列(seqidno.5)

(5)导引子leader核酸人工序列(seqidno.6)

(6)anti-her2singlechainantibodyfragment(scfv)核酸人工序列(seqidno.7)

(7)cd8hinge区核酸人工序列(seqidno.8)

(8)cd28跨膜区核酸人工序列(seqidno.9)

(9)cd137胞内区核酸人工序列(seqidno.10)

(10)cd3ζ胞内区核酸人工序列(seqidno.11)

分别按seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11的核酸编码序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入到慢病毒表达载体plent-c-gfp(invitrogen)noti-asisi位点(见图2)，转化到e.coli(dh5α)，经测序正确后，使用invitrogen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。

实施例2：慢病毒包装及滴度检测

将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs10cm培养皿中，37℃，5％的co2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。将实施例1中的重组质粒(约10μg)和空载质粒(约10μg)分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293t细胞，轻轻混匀，置于37℃、5％co2培养箱中培养12h，加入含10％fbs的dmem液体培养基8ml，继续培养至48小时。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，除去细胞碎片，收获病毒后进行浓缩，获得浓缩过的携带分子开关的her2-car病毒液，-70℃低温冰箱中保存备用。根据lenti-x^tmgostix^tm试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度3.26×10⁶pfu/ml。

实施例3：具有分子开关的her2car-t细胞的制备及对肿瘤细胞的杀伤检测

病毒浓缩后进行t细胞的转染，用tbd样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)从外周血中分离得到pbmc。t细胞经活化后，取出1×10⁶个细胞，加入浓缩过的携带分子开关的her2-car病毒液，混匀，moi＝8。一周后对转染的t细胞进行相关目的蛋白的检测。

图3为流式细胞术检测的利用本发明构建的携带分子开关的her2-car载体在t细胞表面上的表达情况。结果表明有29.2％的细胞是gfp(慢病毒载体本身表达gfp蛋白)阳性，说明利用本发明构建的携带分子开关的her2-car能够在t细胞表面表达，且转染效率为29.2％。

实施例4：具有分子开关的her2car-t细胞控制有效性分析

将具有分子开关的her2car-t(以下简称car(her2)-t)细胞按照密度1×10⁵个/ml接种96孔板中，每孔100ul，置于5％co2、37℃培养箱培养24h；加入10nmap1903(美国apexbio产品)，12h后每孔加入20μlcck-8(mce公司产品)，继续孵育2h后上酶标仪检测，于450nm波长处读取od值。设置未加ap1903的car(her2)-t细胞对照组和只加ap1903无细胞的空白对照组。t细胞的死亡率＝[1-(加ap1903组od值-空白对照组od值)/(未加ap1903组od值-空白对照组od值)]×100％。t细胞的死亡率为29.4％，ap1903对car-t细胞活性的控制率＝死亡率/重组慢病毒感染t细胞的阳性率＝99.36％；结果说明本发明设计的具有分子开关的her2car-t细胞活性受ap1903的控制，极大的提高car技术的临床有效性及安全性。

实施例5：具有分子开关的her2car-t细胞对体外杀伤实验

将接种100μl本发明制备car-t细胞和空载慢病毒感染t细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定，靶细胞为her2表达阳性的乳腺癌细胞系t47d。按照效应细胞与靶细胞数量比例为5:1加入96孔培养板中置于5％co2、37℃培养箱培养24h后每孔加入20μlcck-8，继续孵育2h后，酶标仪检测450nm波长，读取od值，杀伤率＝[1-(实验组od值-效应细胞对照组od值)/靶细胞对照组od值]×100％。以空载慢病毒感染t作为对照组。car-t细胞对her2表达阳性的乳腺癌细胞系t47d细胞的杀伤效率为93.06％-96.18％。本发明实验组所制备的car-t细胞对her2表达阳性的乳腺癌细胞t47d的特异性杀伤活性显著高于对照组。说明本发明制备的her2car-t细胞具有杀伤her2阳性细胞的功能。

实施例6：具有分子开关的her2car-t细胞对体内杀伤实验

选取裸鼠模型(购自广州中医药大学)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集对数期的乳腺癌细胞系t47d细胞，磷酸盐缓冲液(pbs)稀释至2×10⁵个/ml。无菌条件下，在小鼠左腋下接种0.2mlt47d细胞悬浮液，观察20d，待腋下出现10cm(直径)大小较硬的结节作为建模成功的标准，分为4组。a组为实施例3制备的具有分子开关的her2car-t细胞治疗组；b组为实施例3制备的未转染的t淋巴细胞治疗组；c组为实施例3制备的具有分子开关的her2car-t细胞和注射ap1903治疗组；d组为生理盐水对照组。a组在her2car-t细胞培养到第14天和第16天，尾静脉注射2×10⁶细胞，b组未转染的t淋巴细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2×10⁶细胞，c组在her2car-t细胞培养到第14天和第16天，尾静脉注射2×10⁶细胞，且每次治疗注射2h后，注射ap1903，d组与a组、b组和c组的治疗时间相同，尾静脉注射同体积的生理盐水。治疗后分别于7d、14d、21d和28d拉颈处死，取乳腺癌鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型肿瘤大小。

图4鼠模型t淋巴细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线，生理盐水组d和具有分子开关的her2car-t细胞治疗组a、t淋巴细胞治疗组b相比，治疗组a和b中肿瘤大小缩少，但治疗组a与治疗组b相比肿瘤大小缩少明显，her2car-t细胞对乳腺癌细胞可以引发了强大的杀瘤作用；治疗组c和生理盐水组d治疗组、a相比，注射具有分子开关的her2car-t细胞后再注射ap1903，肿瘤逐渐变大，肿瘤生长趋势与生理盐水组d一致，说明该分子开关在ap1903的作用下，在体内发挥了作用，通过fkbp-f36v诱导的fas自杀途径将her2car-t细胞清除，及时中止了car-t细胞对肿瘤的杀伤活性。

因此，本发明提供的携带分子开关的her2car-t细胞既对肿瘤具有较强的杀伤能力，在ap1903的作用下又可及时终止car-t的杀伤作用。

实施例5：car-t细胞临床应用方法

用于her2肿瘤病人的治疗，治疗方法是局部肿瘤注射和静脉回输2×10⁶个car-t细胞。若有不良反应的发生，则局部肿瘤注射和静脉回输ap1903(0.01-100mg/kg)，即可终止。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

序列表

<110>山东兴瑞生物科技有限公司

<120>一种携带分子开关的抗her2嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用

<130>2017

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1472

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>1

atggccctgcctgtgacagccctgctgctgcctctggctctgctgctgcatgccgctaga60

cccgatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtc120

actatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaa180

cccggaaaggccccgaaactgctgatttactcggcatccttcctctactctggagtccct240

tctcgcttctctggttcccgctctgggacggatttcactctgaccatcagctccctgcag300

ccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacactatactactcctccgacgttcgga360

cagggtaccaaggtggagatcaaaggaggaggaggaagcggaggaggaggaagcggagga420

ggaggaagcgaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagcccgggggctct480

ctccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatccactgggtg540

cgtcaggctccgggtaagggcctggagtgggttgcaaggatttatcctacgaatggttat600

actcgttatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacttcgaaaaac660

acagcctacctccagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtagc720

agatggggtggggacggcttctatgctatggactactggggtcaaggtacactagtcacc780

gtcagcagcgctagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatc840

gcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtg900

cacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggact960

tgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaa1020

ctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagat1080

ggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttc1140

agcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctc1200

aatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgag1260

atggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaa1320

gataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaag1380

gggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgccctt1440

cacatgcaggccctgccccctcgcgcggccgc1472

<210>2

<211>330

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>2

atgctggagggagtgcaggtggagactattagccccggagatggcagaacattccccaaa60

agaggacagacttgcgtcgtgcattatactggaatgctggaagacggcaagaaggtggac120

agcagccgggaccgaaacaagcccttcaagttcatgctggggaagcaggaagtgatccgg180

ggctgggaggaaggagtcgcacagatgtcagtgggacagagggccaaactgactattagc240

ccagactacgcttatggagcaaccggccaccccgggatcattccccctcatgctacactg300

gtcttcgatgtggagctgctgaagctggaa330

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>3

agcggaggaggatccgga18

<210>4

<211>1137

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>4

gttcgttgcaacaaattgatgagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaag60

ttggcatgctgggcatctggaccctcctacctctggttcttacgtctgttgctagattat120

cgtccaaaagtgttaatgcccaagtgactgacatcaactccaagggattggaattgagga180

agactgttactacagttgagactcagaacttggaaggcctgcatcatgatggccaattct240

gccataagccctgtcctccaggtgaaaggaaagctagggactgcacagtcaatggggatg300

aaccagactgcgtgccctgccaagaagggaaggagtacacagacaaagcccatttttctt360

ccaaatgcagaagatgtagattgtgtgatgaaggacatggcttagaagtggaaataaact420

gcacccggacccagaataccaagtgcagatgtaaaccaaactttttttgtaactctactg480

tatgtgaacactgtgacccttgcaccaaatgtgaacatggaatcatcaaggaatgcacac540

tcaccagcaacaccaagtgcaaagaggaaggatccagatctaacttggggtggctttgtc600

ttcttcttttgccaattccactaattgtttgggtgaagagaaaggaagtacagaaaacat660

gcagaaagcacagaaaggaaaaccaaggttctcatgaatctccaaccttaaatcctgaaa720

cagtggcaataaatttatctgatgttgacttgagtaaatatatcaccactattgctggag780

tcatgacactaagtcaagttaaaggctttgttcgaaagaatggtgtcaatgaagccaaaa840

tagatgagatcaagaatgacaatgtccaagacacagcaggacagaaagttcaactgcttc900

gtaattggcatcaacttcatggaaagaaagaagcgtatgacacattgattaaagatctca960

aaaaagccaatctttgtactcttgcagagaaaattcagactatcatcctcaaggacatta1020

ctagtgactcagaaaattcaaacttcagaaatgaaatccaaagcttggtctacccaactt1080

tcttgtacaaagttggcattataagaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaac1137

<210>5

<211>54

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>5

gaaggccgagggagcctgctgacatgtggcgatgtggaggaaaacccaggacca54

<210>6

<211>63

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>6

atggccctgcctgtgacagccctgctgctgcctctggctctgctgctgcatgccgctaga60

ccc63

<210>7

<211>795

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>7

atggccctgcctgtgacagccctgctgctgcctctggctctgctgctgcatgccgctaga60

cccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagccagggcggtccctgaga120

ctctcctgtacagcttctggatctgacattaatgattatcctattagctggttccgccag180

gctccagggaaggggctggagtgggtaggtttcattaatagcggtgggtctacatggtac240

gcctcgtgggtgaaaggcagattcaccatctcaagagatgattccaaaagcatcgcctat300

ctgcaaatgaacagcctgaaaaccgatgacacagccacttatttctgtgctagaggatac360

tccacgtattatggtgattttaatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcgagc420

ggaggaggaggaagcggaggaggaggaagcggaggaggaggaagcgacgttgtgatgacc480

cagtctccttcctctctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaagcc540

agtcagagtattgatagcaatttggcctggtttcagcagaaaccagggaaagcccctaac600

ctcctgatctatagggcgtctaatttagctagtggggtcccgtcaaggttcagcggcagt660

ggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgggaagagaagatgctgcaact720

tattactgtcttggaggagttggaaatgtttcttacagaacttcgttcggccaagggacc780

aaggtggaaatcaaa795

<210>8

<211>135

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>8

accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctg60

tccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctg120

gacttcgcctgtgat135

<210>9

<211>79

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>9

ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgtctagtaacagt60

ggcctttattttcgtgagg79

<210>10

<211>126

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>10

aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaa60

actactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgt120

gaactg126

<210>11

<211>336

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>11

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctc60

tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc120

cgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat180

gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc240

cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc300

tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc336