一种腺病毒的纯化方法与流程

本发明涉及病毒纯化技术领域，具体而言，涉及一种腺病毒的纯化方法。

背景技术：

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的双链dna病毒，直径为70～90nm，基因组长约25-45kb，理论上可编码22-40个基因。由252个壳粒呈廿面体排列构成。衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，衣壳里是线状双链dna分子，腺病毒分两个属，共约100余血清型。一般会造成呼吸系统的不适，对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞，但对人体不出现致癌性。

腺病毒作为载体应用于疫苗的开发具有以下优点：感染的宿主范围广，能感染分裂和非分裂细胞，导入细胞的效率高；遗传背景清楚，致病性低，不整合到染色体中不会导致插入突变；外源基因表达水平高，可以容纳约8-10kb的外源基因，能同时表达多个基因；增殖速度快，易培养，可以产生较高的病毒滴度，适用多种途径免疫。基于上述优点，腺病毒是一种大有潜力值得试验和推广的疫苗载体，在新型疫苗研究中越来越显示出良好的应用前景。故对腺病毒的纯化显得尤为重要。

采用凝胶过滤层析、离子交换层析及二者结合的方法对腺病毒进行纯化。凝胶过滤耗时长，受上样体积限制。采用离子交换层析可进行大体积上样，但经离子交换不能对缺陷型及完整病毒进行分离，病毒收率较低。还有采用凝胶过滤层析、离子交换结合的方法，过程步骤繁琐，不易于开展。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种腺病毒的纯化方法，该纯化方法可以获得具有完整病毒颗粒的腺病毒，病毒回收率高。

本发明是这样实现的：

一种腺病毒的纯化方法，其包括：

预处理步骤：

对收集的腺病毒细胞培养液第一次离心，收集细胞沉淀，用缓冲液冲重悬所述细胞沉淀，得到重悬液，冻融处理破碎所述重悬液中的细胞，将所述重悬液进行第二次离心，收集上清液；

密度梯度离心步骤：

将所述上清液加入至密度梯度介质溶液中，进行密度梯度离心，吸取完整病毒颗粒带溶液；

浓缩换液步骤：

将所述完整病毒颗粒带溶液进行浓缩、换液以及过滤，得到含有腺病毒的溶液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述密度梯度介质溶液中的密度梯度介质为氯化铯、甘油或蔗糖。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述密度梯度介质溶液中的密度梯度介质为氯化铯，所述密度梯度介质溶液的密度梯度为1.2-1.4g/ml。

选择合适的密度梯度可以有效地将非完整病毒颗粒和完整病毒颗粒大部分地分离。在以氯化铯作为密度梯度介质的前提下，以1.2-1.4g/ml范围的密度梯度可以实现大部分地分离非完整腺病毒颗粒和完整腺病毒颗粒，提高病毒回收率。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，密度梯度离心的转速为15000-22000g，时间为1.5-2.5h。

需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，密度梯度离心的转速可以是15000g、16000g、17000g、18000g、19000g、20000g、21000g、22000g等中的任意一者或任意两者之间的范围(例如15000-16000g、16000-17000g、17000-18000g、18000-19000g、19000-20000g、20000-21000g等)；

密度梯度离心的时间可以是1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2.0h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h、2.5h等中的任意一者或任意两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一次离心的转速为1800-2200rpm，时间为5-10min。

需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，第一次离心的转速可以是1800rpm、1900rpm、2000rpm、2100rpm、2200rpm等中的任意一者或任意两者之间的范围(例如1800-1900rpm、1900-2000rpm、2000-2100rpm、2100-2200rpm等)；

第一次离心的时间可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等中的任意一者或任意两者的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第二次离心的转速为8000-12000rpm，时间为5-10min。

需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，第二次离心的转速可以是8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm、12000rpm等中的任意一者或任意两者之间的范围(例如8000-9000rpm、9000-10000rpm、10000-11000rpm、11000-12000rpm等)；

第二次离心的时间可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等中的任意一者或任意两者之间的范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为18-22mm。

需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液的浓度可以是18mm、19mm、20mm、21mm、22mm等中的任意一者或任意两者之间的范围(例如18-19mm、19-20mm、20-21mm、21-22mm等)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述冻融处理为：将所述重悬液置于-80～-78℃冻存28-32min后取出，再置于36-38℃水浴。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述冻融处理的次数为3-5次。

需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，所述冻融处理的次数可以是3次、4次或5次。具体的冻融次数可根据细胞数量和细胞类型选择合适的次数，以尽可能使宿主细胞的细胞壁完全破碎，释放出病毒颗粒。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的腺病毒的纯化方法，其包括：预处理步骤：对收集的腺病毒细胞培养液第一次离心，收集细胞沉淀，用缓冲液冲重悬所述细胞沉淀，得到重悬液，冻融处理破碎所述重悬液中的细胞，将所述重悬液进行第二次离心，收集上清液；密度梯度离心步骤：将所述上清液加入至密度梯度介质溶液中，进行密度梯度离心，吸取完整病毒颗粒带溶液；浓缩换液步骤：将所述完整病毒颗粒带溶液进行浓缩、换液以及过滤，得到含有腺病毒的溶液。

采用密度梯度离心法对细胞破碎后的上清液进行离心，可以较好地分离非完整病毒颗粒及完整病毒颗粒，提高腺病毒回收率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的经密度梯度离心后，上清液在氯化铯密度梯度溶液中分层结果的照片；

图2为本发明实施例1提供的不同样品的非还原和还原的sds-page电泳检测结果；

图3为本发明对比例1提供的不同样品的非还原和还原的sds-page电泳检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的腺病毒的纯化方法，其包括如下步骤：

1获取腺病毒细胞培养液

参考申请号201310362921.8、名称为一种新型狂犬病疫苗及其制备方法的中国专利申请，得到复制缺陷型重组腺病毒的细胞培养液。

2预处理

将上述细胞培养液以2000rpm离心，8min，收集离心细胞，并将细胞重悬于20mmpb(磷酸盐缓冲液)中，于-80℃冻存30min后取出，再置于37℃水浴，反复冻融三次，使细胞破碎，以10000rpm离心10min收集上清液。

3密度梯度离心

取1.4g/ml的氯化铯溶液6ml，缓慢加入管底，再沿液面加入1.2g/ml的氯化铯溶液6ml，形成密度梯度介质溶液，再取步骤2得到的上清液样品16ml，同样沿液面缓慢加入至密度梯度介质溶液，密封，离心，20000g、离心2h；

离心结束后，利用注射器缓慢吸出完整病毒颗粒带(完整病毒颗粒带所处的位置见图1)，取出的病毒带(5ml)立即稀释于20mm的pb(磷酸盐缓冲液，50ml)中。

需要注意的是，在离心前，按照要求超速离心机提前抽真空预冷，离心管两两对称放入转子，移动时注避免晃动及碰撞。

4浓缩换液

用0.1m氢氧化钠过夜浸泡超滤系统，使用时排空膜包内的碱液，以20mmpb进行冲洗及润洗，反复三次直至废液端ph与缓冲液一致。将稀释后的病毒液进行浓缩，浓缩后换液脱盐。将换液后的病毒进行无菌过滤，得到完整的复制缺陷型重组腺病毒溶液，并以10％的甘油保存。取样留样并送检，剩余样品注明标签，存于-80℃。

5检测

5.1sds-page电泳检测，

分别取步骤1中的细胞冻融沉淀，以及步骤2密度梯度离心后的脂质层、缓冲液层、不完整病毒颗粒层以及完整病毒颗粒层，进行非还原和还原sds-page电泳，结果见图2(图中：1-还原细胞冻融沉淀样品，2-还原脂质层样品，3-非还原脂质层样品，4-还原缓冲液层样品，5-非还原缓冲液层样品，6-还原不完整病毒颗粒层样品，7-非还原不完整病毒颗粒层样品，8-非还原完整病毒颗粒层样品，9-还原完整病毒颗粒层样品)。

从图2可看出通过分离后的完整病毒颗粒层中，杂蛋白较脂质层及不完整病毒颗粒层明显减少，样品得到分离。

5.2纯度检测

取步骤4的完整的复制缺陷型重组腺病毒溶液检测其od260和od280，结果如表1所示。

表1

合格样品纯度即od260/280应在1.2～1.3，从表1可看出，完整的复制缺陷型重组腺病毒溶液的od260/280为1.24，说明该样品纯度较好。

5.3活病毒回收率检测

取步骤4的完整的复制缺陷型重组腺病毒溶液及步骤2中的离心上清液，检测其tcid50并通过pfu计算活病毒回收率，结果如表2所示。

表2

从表2可看出，活病毒回收率达95％，回收率较高。

对比例1

本对比例提供的腺病毒的纯化方法，其包括如下步骤：

1获取腺病毒细胞培养液

同实施例1。

2预处理

将上述细胞培养液于-80℃冻存30min后取出，再置于37℃水浴，反复冻融三次，使细胞破碎，以10000rpm离心10min收集上清液，备用。

3阴离子交换层析法

以平衡缓冲液20mmpbph7.5对阴离子层析柱(cellufinemaxdeae)进行平衡，平衡完毕后进行上样并收集流穿样品，进行再次平衡，并以20mmpb-0.23mnaclph7.5对杂蛋白进行洗脱与分离，最终以20mmpb-0.4mnaclph7.5的缓冲液洗脱目的蛋白即腺病毒，收集蛋白样品并检测。

4检测

4.1sds-page电泳检测，结果如图3所示。

图3中：1-非还原离心上清样品，2-非还原流穿样品，3-非还原杂蛋白样品，4-非还原目的蛋白(腺病毒)样品，5-还原离心上清样品，6-还原流穿样品，7-还原杂蛋白样品，8-还原目的蛋白(腺病毒)样品。

从图3中分析，目的蛋白(腺病毒)样品中杂蛋白较多，且从纯化性质上分析，样品中包含非完整病毒颗粒及完整病毒颗粒。

4.2纯度检测

取步骤3中的目的蛋白(腺病毒)，检测其od260和od280，结果如下表3所示

表3

从表3中可看出，od260/280纯度偏大，说明溶液中有杂质残留。

4.3活病毒回收率检测

取步骤3中的目的蛋白(腺病毒)及离心上清样品，通过检测tcid50并计算活病毒回收率，结果见表4。

表4

根据表4中检测结果，采用阴离子交换层析法得到的样品的活病毒回收率仅为29.9％，回收率较低。

综上结果，说明本实施例提供的腺病毒的纯化方法可以提高腺病毒回收率。

实施例2

本实施例提供的腺病毒的纯化方法，其包括如下步骤：

1获取腺病毒细胞培养液

同实施例1。

2预处理

将上述细胞培养液以1800rpm离心，10min，收集离心细胞，并将细胞重悬于22mmpb(磷酸盐缓冲液)中，于-80℃冻存30min后取出，再置于37℃水浴，反复冻融三次，使细胞破碎，以11000rpm离心8min收集上清液。

3密度梯度离心

取1.4g/ml的氯化铯溶液，缓慢加入管底，再沿液面加入1.2g/ml的氯化铯溶液，形成密度梯度介质溶液，再取步骤2得到的上清液样品，同样沿液面缓慢加入至密度梯度介质溶液，密封，离心，18000g、离心2.2h；

离心结束后，利用注射器缓慢吸出完整病毒颗粒带(完整病毒颗粒带所处的位置见图1)，取出的病毒带立即稀释于22mm的pb中。

(其中，在离心前，按照要求超速离心机提前抽真空预冷，离心管两两对称放入转子，移动时注避免晃动及碰撞。)

4浓缩换液

用0.1m氢氧化钠过夜浸泡超滤系统，使用时排空膜包内的碱液，以22mmpb进行冲洗及润洗，反复三次直至废液端ph与缓冲液一致。将稀释后的病毒液进行浓缩，浓缩后换液脱盐。将换液后的病毒进行无菌过滤，得到完整的复制缺陷型重组腺病毒溶液，并以10％的甘油保存。

本实施例提供的腺病毒的纯化方法的效果同实施例1。

实施例3

本实施例提供的腺病毒的纯化方法，其包括如下步骤：

1获取腺病毒细胞培养液

同实施例1。

2预处理

将上述细胞培养液以2200rpm离心，8min，收集离心细胞，并将细胞重悬于18mmpb(磷酸盐缓冲液)中，于-80℃冻存30min后取出，再置于37℃水浴，反复冻融三次，使细胞破碎，以11000rpm离心8min收集上清液。

3密度梯度离心

取1.4g/ml的氯化铯溶液，缓慢加入管底，再沿液面加入1.2g/ml的氯化铯溶液，形成密度梯度介质溶液，再取步骤2得到的上清液样品，同样沿液面缓慢加入至密度梯度介质溶液，密封，离心，21000g、离心1.7h；

离心结束后，利用注射器缓慢吸出完整病毒颗粒带(完整病毒颗粒带所处的位置见图1)，取出的病毒带立即稀释于18mm的pb中。

(其中，在离心前，按照要求超速离心机提前抽真空预冷，离心管两两对称放入转子，移动时注避免晃动及碰撞。)

4浓缩换液

用0.1m氢氧化钠过夜浸泡超滤系统，使用时排空膜包内的碱液，以18mmpb进行冲洗及润洗，反复三次直至废液端ph与缓冲液一致。将稀释后的病毒液进行浓缩，浓缩后换液脱盐。将换液后的病毒进行无菌过滤，得到完整的复制缺陷型重组腺病毒溶液，并以10％的甘油保存。

本实施例提供的腺病毒的纯化方法的效果同实施例1。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。