一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法与流程

本发明属于兽用生物制品
技术领域：
，具体涉及一种应用生物反应器大规模自动化微载体悬浮培养高病毒含量的犬瘟热病毒的方法。
背景技术：
：犬瘟热病毒(caninedistempervirus，cdv)是副黏病毒科(paramyxoviridae)、麻疹病毒属(morbillivirus)，是一种单链rna病毒。该病毒是一种高度接触性传染病，传染性极强，犬感染后死亡率可高达80％以上。目前宠物市场对犬瘟热病毒疫苗的需求量极大。但是，对于培养高滴度的犬瘟热病毒制备疫苗，一直手段落后，常规的方法采用传统的转瓶工艺培养单层细胞感染病毒制备疫苗，但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的产量，病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，隐定污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应大规模生产的要求。应用大规模自动化微载体悬浮培养高病毒含量的犬瘟热病毒是重要的技术攻克和疫苗生产的重要途径。技术实现要素：本发明的目的是为了克服犬瘟热疫苗现有生产工艺的缺陷，提供了应用生物反应器大规模自动化微载体悬浮培养高病毒含量的犬瘟热病毒的方法。本发明通过以下技术方案实现：一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法，包括以下步骤：s1.微载体和生物反应器的清洗灭菌处理；s2.将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞营养液，并进行通气处理，接种vero细胞进行培养3-5天；所述的生物反应器参数设定为：ph值为7.0-7.5，温度为35-37℃，溶氧为30％-80％和搅拌速度为30-50rpm；s3.犬瘟热病毒感染：用步骤s2中生物反应器微载体悬浮培养细胞至细胞密度为6×106-10×106cells/ml，接种犬瘟热病毒进行病毒感染，并补加细胞生长液；待细胞出现80％以上病变时，停止培养，收获病毒液。优选地，所用生物反应器为无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器。优选地，所用微载体为球形载体，微载体的使用密度为3-10g/l。优选地，vero细胞为生长至对数期的细胞并经0.125％胰酶消化分散后，按2×105cells/ml接种量接种到生物反应器中。优选地，所述细胞营养液由92％dmem液、7.5％新生牛血清和0.5％l-岩藻糖组成，溶液ph值为7.2。优选地，犬瘟热病毒接种量为0.01-0.1moi。优选地，细胞培养过程中通入所需要的气体为氧气、空气和氮气。本发明所用生物反应器为广州齐志生物工程设备有限公司制造的bc-7l型动物细胞培养生物反应器，其自动化程度高，培养温度、酸碱度、溶氧、搅拌转速均有电脑程序控制，减少了人力的使用，并且各项生产工艺参数具体且确定，保证了每批产品品质的稳定性，从而有助于实现犬瘟热病毒及疫苗产品的大规模自动化生产。本发明用生物反应器微载体细胞悬浮培养工艺代替现有转瓶细胞培养工艺，以vero细胞为宿主细胞生产犬瘟热病毒。l-岩藻糖是六碳糖的一种，又称6-脱氧-l-半乳糖，岩藻糖作为糖蛋白中糖链的组成部分，广泛存在于各类细胞表面的质膜上。本发明将l-岩藻糖添加到细胞营养液中，可以显著提供所得病毒效价，l-岩藻糖的加入有助于病毒吸附在vero细胞，从而可以促进病毒的繁殖。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所用生物反应器设备占地面积小，自动化程度高，可以实现病毒及其相关疫苗产品的自动化、规模化生产；(2)本发明优化了各项工艺参数，生产所得病毒效价高且稳定；(3)本发明生产易于控制，不易污染，从而保证了培养所得病毒的品质。附图说明图1:微载体悬浮培养vero细胞图片；图2:微载体悬浮培养vero细胞感染病毒图片；图3：vero细胞微载体悬浮培养细胞生长代谢曲线。具体实施方式下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。实施例1一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法所述用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法，分为以下步骤：s1.微载体和无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器的清洗灭菌处理：称量21g球型微载体，使用1升ph值为7.2的pbs2缓冲液浸泡三小时后，用1升ph值为7.2的pbs缓冲液冲洗三遍，加入1升ph7.2pbs缓冲液浸泡微载体与自动化搅拌式生物反应器一起121℃高压蒸汽灭菌三十分钟；s2.将微载体和无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器经灭菌冷却后，连接管道，加入细胞营养液，采用无泡通气系统，通入空气，氧气，氮气三种气体；选择生长状态良好对数生长期vero细胞经0.125％胰酶消化分散细胞，按2×105cells/ml接种量接种到生物反应器中培养5天，待微载体上细胞形成致密单层；其中，所述的无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器参数设定为：ph值为7.0，温度为37℃，溶氧为50％和搅拌速度为20rpm；所述细胞营养液由92％dmem液、7.5％新生牛血清和0.5％l-岩藻糖组成，溶液ph值为7.2；s3.犬瘟热病毒感染：用步骤s2中无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器微载体悬浮培养细胞至细胞密度为10×106cells/ml，接种犬瘟热病毒进行病毒感染，病毒的接种量为0.1moi，并补加含97％dmem液，3％新生牛血清，ph为7.2的细胞生长液，进行病毒繁殖培养细胞生长液；待细胞出现80％以上病变时，停止培养，收获病毒液；所收获的病毒液的病毒滴度为6.5logtcid50/ml以上。其中，所述的无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器参数设定为：ph值为7.0，温度为37℃，溶氧为50％和搅拌速度为40rpm。实施例2一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法所述用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法，分为以下步骤：s1.微载体和无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器的清洗灭菌处理：称量21g球型微载体，使用1升ph值为7.2的pbs缓冲液浸泡三小时后，用1升ph值为7.2的pbs缓冲液冲洗三遍，加入1升ph7.2pbs缓冲液浸泡微载体与自动化搅拌式生物反应器一起121℃高压蒸汽灭菌三十分钟；s2.将微载体和无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器经灭菌后，加入细胞营养液，采用无泡通气系统，通入空气，氧气，氮气三种气体；选择生长状态良好对数生长期vero细胞经0.125％胰酶消化分散细胞，按2×105cells/ml接种量接种到生物反应器中培养3天，待微载体上细胞形成致密单层；其中，所述的无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器参数设定为：ph值为7.2，温度为36℃，溶氧为30％和搅拌速度为40rpm；所述细胞营养液由92％dmem液、7.5％新生牛血清和0.5％l-岩藻糖组成，溶液ph值为7.2；s3.犬瘟热病毒感染：用步骤s2中无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器微载体悬浮培养细胞至细胞密度为6×106cells/ml，接种犬瘟热病毒进行病毒感染，病毒的接种量为0.1moi，并补加含97％dmem液，3％新生牛血清，ph为7.2的细胞生长液，进行病毒繁殖培养细胞生长液；待细胞出现80％以上病变时，停止培养，收获病毒液；所收获的病毒液的病毒滴度为6.5logtcid50/ml以上。其中，所述的无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器参数设定为：ph值为7.2，温度为36℃，溶氧为30％和搅拌速度为40rpm。实施例3一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法所述用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法，分为以下步骤：s1.微载体和无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器的清洗灭菌处理：称量21g球型微载体，使用1升ph值为7.2的pbs缓冲液浸泡三小时后，用1升ph值为7.2的pbs缓冲液冲洗三遍，加入1升ph7.2pbs缓冲液浸泡微载体与自动化搅拌式生物反应器一起121℃高压蒸汽灭菌三十分钟；s2.将微载体和无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器经灭菌后，加入细胞营养液，采用无泡通气系统，通入空气，氧气，氮气三种气体；选择生长状态良好对数生长期vero细胞经0.125％胰酶消化分散细胞，按2×105cells/ml接种量接种到生物反应器中培养4天，待微载体上细胞形成致密单层；其中，所述的无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器参数设定为：ph值为7.2，温度为37℃，溶氧为50％和搅拌速度为50rpm；所述细胞营养液由92％dmem液、7.5％新生牛血清和0.5％l-岩藻糖组成，溶液ph值为7.2；s3.犬瘟热病毒感染：用步骤s2中无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器微载体悬浮培养细胞至细胞密度为8×106cells/ml，接种犬瘟热病毒进行病毒感染，病毒的接种量为0.05moi，并补加含97％dmem液，3％新生牛血清，ph为7.2的细胞生长液，进行病毒繁殖培养细胞生长液；待细胞出现80％以上病变时，停止培养，收获病毒液；所收获的病毒液的病毒滴度为6.5logtcid50/ml以上。其中，所述的无泡通气系统自动化搅拌式生物反应器参数设定为：ph值为7.2，温度为37℃，溶氧为60％和搅拌速度为50rpm。20实施例4一种用微载体悬浮培养犬瘟热病毒的方法与实施例3的区别在于，所述细胞营养液中不含l-岩藻糖，其它均与实施例3类似。试验例病毒含量测定1、试验材料：实施例1、实施例2、实施例3和实施例4培养所得犬瘟热病毒含量测定。2、试验方法：实施例1、实施例2、实施例3培和实施例4培养所得犬瘟热病毒毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液分别用于超滤浓缩；将上述离心后的上清液分别用50k中空纤维柱将其浓缩后，取浓缩后的病毒液用dmem细胞培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-85个稀释度接种48孔铺满单层lmh细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞，每孔0.1ml，37℃吸附30min后，补加含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mm谷氨酰胺的dmem培养液0.3ml于37℃、5％co2培养120小时，观察细胞病变(cpe)，计算logtcid50；3、试验结果：如表1所示。表1各组犬瘟热病毒含量测定组别病毒含量(logtcid50)实施例16.9实施例26.7实施例37.5实施例47.6由表1可知，本发明实施例1-4各组培养所得病毒含量均大于6.5logtcid50，其中实施例4培养所得犬瘟热病毒含量高达7.6logtcid50，为最佳实施例。并且，实施例4组与实施例3组相比，病毒含量明显增高，说明本发明实施例细胞营养液能够促进病毒的增殖。综上所述，本发明应用自动化搅拌式生物反应器实现了犬瘟热病毒大规模自动化培养，且培养所得病毒滴度高。当前第1页12