本发明涉及一种γ-吡喃酮衍生物，尤其是涉及一种用海洋曲霉菌制备γ-吡喃酮衍生物的方法以及该类化合物在制备番茄灰霉病菌抑制剂的应用。
背景技术：
微生物一直是生物农药开发的重要资源，微生物来源的生物农药如井冈霉素(jinggongmycin)、春雷霉素(kasugamycin)、多抗霉素(polyoxin)、农抗120(agriculturalantibiotic120)、武夷菌素(wuyiencinm)、庆丰霉素(qingfengmycin)等已被广泛应用于防治植物病害。但近年来，相同的化学活性物质的被重复发现却长期困扰着该领域的研究人员。因此，不断扩大筛选对象，发现新的农用抗菌物质，研制出更多具有自主知识产权的农用抗生素，已成为当务之急，具有十分重要的社会意义。
海洋微生物生活在高盐、高压、低温、无光照、寡营养等特殊环境中，这种特殊的环境造就了海洋微生物具有多种途径的代谢方式，致使其能产生结构新颖独特、具有多种特殊活性的代谢产物，是开发新型农用抗菌物质的重要来源。本发明人研究得知，海洋曲霉菌aspergillusversicolordj013（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno:m2014089）的大米发酵的乙酸乙酯提取物有较好的抗番茄灰霉病菌活性，遂对其活性成分进行了研究。目前尚未见该化合物的化学结构及抗番茄灰霉病菌活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有抗番茄灰霉病菌活性的γ-吡喃酮衍生物及其制备方法和应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种γ-吡喃酮衍生物，该γ-吡喃酮衍生物的结构式如ⅰ所示：
上述γ-吡喃酮衍生物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为cctccno.m2014089的花斑曲霉（aspergillusversicolordj013）划线复活，转接到pdb培养基中，于28℃、180r/min培养4天，获得种子培养液；然后按体积比10%的接种量将种子液接种到大米培养基中，于28℃静置培养35天，获得发酵物；
（2）浸膏的获得
将上述发酵物用甲醇浸泡3次，而后对甲醇浸提液浓缩蒸干，用水复溶，再用与水等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，将萃取液减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；
（3）化合物的分离精制
将上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用石油醚/乙酸乙酯以体积比10:1梯度为洗脱剂进行洗脱，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分，再经过半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到γ-吡喃酮衍生物，其结构如式i所示：
所述的大米培养基的配制方法如下：将80g大米和1g酵母粉溶于120ml海水中，浸泡隔夜后，于121℃高压灭菌20min即可。
所述的二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1。
所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱液为甲醇与水按体积比70:30的比例混合。
上述γ-吡喃酮衍生物的应用，所述的γ-吡喃酮衍生物在制备番茄灰霉病菌抑制剂方面的用途。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种γ-吡喃酮衍生物及其制备方法和应用，通过海洋微生物发酵培养来获取含一种新的γ-吡喃酮衍生物的发酵物，然后将发酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该粗浸膏经减压硅胶柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该γ-吡喃酮衍生物具有抗番茄灰霉病作用，可以作为番茄灰霉病的抑制剂成分或其他抗农用病原菌的药物先导化合物。
上述花斑曲霉（aspergillusversicolor），该菌为dj013菌株，保藏编号为cctccno.m2014089，于2014年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种γ-吡喃酮衍生物结构式如ⅰ所示：
实施例2
如i式所示的γ-吡喃酮衍生物的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）发酵生产
将保藏号为cctccno.m2014089的花斑曲霉（aspergillusversicolordj013）划线复活，转接到装有100mlpdb培养基的250ml锥形瓶中，于28℃、180r/min培养4天，获得种子培养液；之后按照体积比10%的接种量将种子液接种到装有大米培养基(将80g大米和1g酵母粉溶于120ml海水中，浸泡隔夜后，于121℃高压灭菌20min即可)的1000ml锥形瓶中，28℃静置培养35天，获得发酵物；
（2）浸膏的获得
将上述发酵物用4l甲醇浸泡3次，而后对甲醇浸提液浓缩蒸干，用1l的水复溶，再用1l乙酸乙酯重复萃取3次，合并三次萃取所得萃取液，将萃取液减压浓缩除去乙酸乙酯，获得17克粗浸膏；
（3）化合物的分离精制
将上述粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用石油醚/乙酸乙酯以体积比10:1梯度为洗脱剂进行洗脱，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分，再经过半制备反相高效液相色谱进行分离纯化得到γ-吡喃酮衍生物，其结构如式i所示：
该化合物ⅰ，无色油状，分子式c14h23o2，阳离子hresimsm/z：223.1686[m+h]+，1h和13c-nmr数据见表1。
表1化合物ⅰ的1h和13cnmr数据（600和150mhz，incdcl3）
实施例3
体外抗番茄灰霉病菌测试（96孔板抑菌法）
（1）实验样品
被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例1中分离纯化的化合物ⅰ纯品，精密称取适量样品，用dmso配制成所需浓度的溶液，供测活性。
（2）实验方法
96孔板法：将待测化合物配制1mg/ml的dmso样品溶液，在96孔板中，用已经灭菌的pdb液体培养基采用二倍稀释法分别稀释成浓度为：200、100、50、25、12.5、6.25μg/ml的溶液(50μl)，加入等量1×106cfu的菌悬液，终浓度即为：200、100、50、25、12.5、6.25、3.13μg/ml，充分摇匀，以上所有操作均在无菌条件下。以dmso为空白对照，多菌灵为阳性对照，每处理重复3次。28℃培养48h后观察没有菌生长的最小浓度即为最小抑制浓度(mic)。
（3）实验结果
在96孔板抗植物病菌测试中，化合物ⅰ对番茄灰霉病菌的最小抑制浓度（mic）为50μg/ml，对番茄灰霉病菌抑制活性较强。因此，可作为番茄灰霉病菌抑制剂或其他抗农用病原菌的药物先导化合物研究。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。