CD22三代嵌合抗原受体实时荧光定量PCR检测方法与流程

本发明涉及生物大分子检测领域，更具体地说，本发明涉及cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法和试剂盒。

背景技术：

嵌合抗原受体（car）是单链抗体的可变区和t细胞信号分子的融合蛋白，它使t细胞可以通过非mhc限制性的方式识别特异性抗原，发挥杀伤作用。目前，car的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含cd28、4-1bb等共刺激分子的多信号结构域（第二、三代），在体内的存在时间及杀伤能力明显增强。利用靶向cd19和cd20的car修饰的t细胞进行过继输注，治疗血液系统恶性肿瘤是目前临床研究的热点。由于car-t细胞是应用基因修饰病人自体的t细胞，利用抗原抗体结合的机制，能克服肿瘤细胞通过下调mhc分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸，让肿瘤细胞无所逃遁；多靶向更精准。car既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围，car-t细胞作用过程不受mhc的限制;杀瘤范围更广。car技术也正研究用于骨髓移植后的过继免疫治疗等领域。在治疗安全性方面，目前临床试验中大部分患者对car治疗耐受性良好。目前大部分的cra-t技术都处于研发状态，因为细胞毒性和脱靶问题的存在给治疗带来不确定性，所以实时监控检测治疗过程中人体内基因表达水平显得尤为重要。

实时定量pcr检测方法(real-timepcr)是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。实时定量pcr在常规pcr基础上把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，能提高灵敏度，且在整个实验中，所有反应物在同一溶液中进行，不需要任何后处理过程，被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关。

随着自体细胞回输技术的不断成熟与完善，对cd22三代嵌合抗原受体的含量检测要求更加精准，cd22三代嵌合抗原受体含量直接关系是否能够产生疗效。目前没有一种针对cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法和试剂盒。

技术实现要素：
所要解决的问题：本发明提供一种cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法和试剂盒，能够有效的追踪人体内或培养过程中cd22三代嵌合抗原受体含量，提示治疗情况并为治疗剂量提供参考，效果准确迅速。

本发明采用的技术方案是：

cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，所述方法包括：

第一步：提取待测样品dna；

第二步：pcr反应：取特异性扩增引物、pcr缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、dna染料和dna聚合酶，加入待测样品dna配成pcr反应液；

第三步：进行pcr扩增反应，于每个循环结束时测定吸光值；

第二步中所述特异性扩增引物如下：

上游引物为5′ａｇａｇｇｇｇａｇcgcａａａｃｔｇａ3′;下游引物为5′ｇｇａａｔｃｔａａｇａtｔｇａｃｔtaaｔｔ3′

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，第三步中所述的pcr扩增反应条件为:95℃变性2分钟后,93℃25秒,57℃30秒,72℃25秒,35个循环,最后72℃延伸11分钟。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，第三步结束后，取5μｌｐｃｒ产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,根据pcr扩增产物长度检验扩增准确率。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，所述脱氧三磷酸核苷混合物为datp、dttp、dctp、dgtp物质的量之比为1∶1∶1∶1的混合物。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，述dna染料为sybr染料。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，pcr反应液终浓度组成如下：10×扩增缓冲液10ul；datp、dttp、dctp、dgtp各200umol/l；特异引物上下游各20-30pmol；模板dna0.6～1.6ug；taqdna聚合酶2.0-2.5u；mg2+1.5mmol/l；溶剂为ddh2o加水至100ul。

cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、pcr缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、dna染料和taqdna聚合酶，所述特异性扩增引物如下：上游引物为5′ａｇａｇｇｇｇａｇcgcａａａｃｔｇａ3′;下游引物为5′ｇｇａａｔｃｔａａｇａtｔｇａｃｔtaaｔｔ3′。

所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括10×扩增缓冲液10ul脱氧三磷酸核苷混合物为datp、dttp、dctp、dgtp物质的量之比为各200umol/l；特异引物上下游各20-30pmol；模板dna0.6～1.6ug；taqdna聚合酶2.0-2.5u；mg2+1.5mmol/l；溶剂为ddh2o加水至100ul。

所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述dna染料为sybrgreeni。

有益效果：

发明提供一种cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法和试剂盒，能够有效的追踪人体内或培养过程中cd22三代嵌合抗原受体含量，提示治疗情况并为治疗剂量提供参考，效果准确迅速。

1人身毒害小，安全环保。减少了电泳、银染等步骤，避免聚丙烯酰胺、溴化乙锭等致癌试剂的使用，，避免了试验过程中对环境的污染。

2低污染，低误差。封闭体系内完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，也降低了结果偏差的几率。

附图说明

图1是实施例1cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测曲线图；

横坐标代表定量pcr扩增循环数，纵坐标代表荧光信号强度，a代表阈值线，c代表典型的扩增曲线，b代表阈值线a与扩增曲线c的交点（b所对应的定量pcr循环数，即为ct值），d代表阴性对照样品扩增曲线，e代表阴性对照样品扩增曲线的最高点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，所述方法包括：

第一步：提取待测样品dna；

第二步：pcr反应：取特异性扩增引物、pcr缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、dna染料和dna聚合酶，加入待测样品dna配成pcr反应液；

第三步：进行pcr扩增反应，于每个循环结束时测定吸光值；

第二步中所述特异性扩增引物如下：

上游引物为5′ａｇａｇｇｇｇａｇcgcａａａｃｔｇａ3′;下游引物为5′ｇｇａａｔｃｔａａｇａtｔｇａｃｔtaaｔｔ3′

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，第三步中所述的pcr扩增反应条件为:95℃变性2分钟后,93℃25秒,57℃30秒,72℃25秒,35个循环,最后72℃延伸11分钟。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，第三步结束后，取5μｌｐｃｒ产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,根据pcr扩增产物长度检验扩增准确率。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，所述脱氧三磷酸核苷混合物为datp、dttp、dctp、dgtp物质的量之比为1∶1∶1∶1的混合物。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，述dna染料为sybr染料。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于,pcr反应液终浓度组成如下：10×扩增缓冲液10ul；datp、dttp、dctp、dgtp各200umol/l；特异引物上下游各20pmol；模板dna0.6ug；taqdna聚合酶2.0u；mg2+1.5mmol/l；溶剂为ddh2o加水至100ul。

cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、pcr缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、dna染料和taqdna聚合酶，所述特异性扩增引物如下：上游引物为5′ａｇａｇｇｇｇａｇcgcａａａｃｔｇａ3′;下游引物为5′ｇｇａａｔｃｔａａｇａtｔｇａｃｔtaaｔｔ3′。

所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，10×扩增缓冲液10ul；datp、dttp、dctp、dgtp各200umol/l；特异引物上下游各20pmol；模板dna0.6ug；taqdna聚合酶2.0u；mg2+1.5mmol/l；溶剂为ddh2o加水至100ul。

所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述dna染料为sybrgreeni。

实施例2

cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，所述方法包括：

第一步：提取待测样品dna；

第二步：pcr反应：取特异性扩增引物、pcr缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、dna染料和dna聚合酶，加入待测样品dna配成pcr反应液；

第三步：进行pcr扩增反应，于每个循环结束时测定吸光值；

第二步中所述特异性扩增引物如下：

上游引物为5′ａｇａｇｇｇｇａｇcgcａａａｃｔｇａ3′;下游引物为5′ｇｇａａｔｃｔａａｇａtｔｇａｃｔtaaｔｔ3′

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，第三步中所述的pcr扩增反应条件为:95℃变性2分钟后,93℃25秒,57℃30秒,72℃25秒,35个循环,最后72℃延伸11分钟。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，第三步结束后，取5μｌｐｃｒ产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,根据pcr扩增产物长度检验扩增准确率。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，所述脱氧三磷酸核苷混合物为datp、dttp、dctp、dgtp物质的量之比为1∶1∶1∶1的混合物。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，述dna染料为sybr染料。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，pcr反应液终浓度组成如下：10×扩增缓冲液10ul；datp、dttp、dctp、dgtp各200umol/l；特异引物上下游各25pmol；模板dna1.1ug；taqdna聚合酶2.3u；mg2+1.5mmol/l；溶剂为ddh2o加水至100ul。

cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、pcr缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、dna染料和taqdna聚合酶，所述特异性扩增引物如下：上游引物为5′ａｇａｇｇｇｇａｇcgcａａａｃｔｇａ3′;下游引物为5′ｇｇａａｔｃｔａａｇａtｔｇａｃｔtaaｔｔ3′。

所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，包括10×扩增缓冲液10ul脱氧三磷酸核苷混合物为datp、dttp、dctp、dgtp物质的量之比为各200umol/l；特异引物上下游各25pmol；模板dna1.1ug；taqdna聚合酶2.3u；mg2+1.5mmol/l；溶剂为ddh2o加水至100ul。

所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述dna染料为sybrgreeni。

实施例3

cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，所述方法包括：

第一步：提取待测样品dna；

第二步：pcr反应：取特异性扩增引物、pcr缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、dna染料和dna聚合酶，加入待测样品dna配成pcr反应液；

第三步：进行pcr扩增反应，于每个循环结束时测定吸光值；

第二步中所述特异性扩增引物如下：

上游引物为5′ａｇａｇｇｇｇａｇcgcａａａｃｔｇａ3′;下游引物为5′ｇｇａａｔｃｔａａｇａtｔｇａｃｔtaaｔｔ3′

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，第三步中所述的pcr扩增反应条件为:95℃变性2分钟后,93℃25秒,57℃30秒,72℃25秒,35个循环,最后72℃延伸11分钟。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，第三步结束后，取5μｌｐｃｒ产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,ｐｃｒ扩增产物长410-430ｂｐ。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，所述脱氧三磷酸核苷混合物为datp、dttp、dctp、dgtp物质的量之比为1∶1∶1∶1的混合物。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，述dna染料为sybr染料。

更进一步的，所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测方法，pcr反应液终浓度组成如下：10×扩增缓冲液10ul；datp、dttp、dctp、dgtp各200umol/l；特异引物上下游各30pmol；模板dna1.6ug；taqdna聚合酶2.5u；mg2+1.5mmol/l；溶剂为ddh2o加水至100ul。

cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、pcr缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、dna染料和taqdna聚合酶，所述特异性扩增引物如下：上游引物为5′ａｇａｇｇｇｇａｇcgcａａａｃｔｇａ3′;下游引物为5′ｇｇａａｔｃｔａａｇａtｔｇａｃｔtaaｔｔ3′。

所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括10×扩增缓冲液10ul脱氧三磷酸核苷混合物为datp、dttp、dctp、dgtp物质的量之比为各200umol/l；特异引物上下游各30pmol；模板dna1.6ug；taqdna聚合酶2.5u；mg2+1.5mmol/l；溶剂为ddh2o加水至100ul。

所述的cd22三代嵌合抗原受体实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述dna染料为sybrgreeni。