本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种诺如病毒gi型和gii型检测引物探针组。
背景技术：
诺如病毒(noroviruses，nov)又称诺瓦克样病毒(norwalk-likevirus，nlvs)，属于杯状病毒科，是引起病毒性胃肠炎暴发的重要病原之一。诺如病毒直径约为26-35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离。诺如病毒基因组全长约7.7kb，包含3个开放阅读框(openreadingframes，orfs)。orf1编码非结构蛋白，包括rna聚合酶(rna-dependentrnapolymerase，rdrp)；orf2和orf3分别编码主要(vp1)和次要(vp2)衣壳蛋白。根据vp1序列的同源性，诺如病毒可分为gi-gv五个基因群，其中引起人类感染的主要是gi和gii群。
因此，针对疫情的快速暴发、传播范围广的特点，建立灵敏度高、特异性强、检测时间短、检测成本低、操作简单方便、器材要求不高的诺如病毒gi和gii检测技术，对病例的快速识别和疫情的传播控制具有非常重要的意义，对公共卫生和食品安全防控具有重要的价值。
技术实现要素：
本公开的目的是提供一种诺如病毒gi型和gii型的检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技术的诺如病毒gi型和gii型的快速、灵敏、特异，简便的检测方法。
为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测诺如病毒gi型和gii型用引物探针组，其中，包括具有seqidno.1-4所示核苷酸序列的引物，以及，含有seqidno.5-6所示核苷酸序列的探针；
其中，seqidno.5所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有fam发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团bhq1；seqidno.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有vic发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团bhq1。
可选的，还包括具有seqidno.7-8所示核苷酸序列的引物，以及，含有seqidno.9所示核苷酸序列的探针；其中，seqidno.9所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有cy5发光基团，第22位碱基后连接脱碱基位点，第25位碱基标记淬灭基团bhq3，3’末端标记有磷酸盐基团。
本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测诺如病毒gi型和gii型的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总rna；
(2)以所述总rna为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；
(3)收集fam和vic检测通道荧光信号，得到检测结果；
a)若fam荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有诺如病毒gi型；
b)若vic荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有诺如病毒gii型。
可选的，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5μm，每条探针的最终使用浓度各自为0.08-0.15μm。
可选的，重组酶聚合酶扩增反应的条件包括在37-42℃下恒温扩增15-25min。
可选的，扩增反应体系中还包括浓度为3-5u/μl的逆转录酶，2-6u/μl的重组酶，2-6u/μl的聚合酶，12-16mmol/l的醋酸镁，1-105拷贝/μl的rna模板
本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测诺如病毒gi型和gii型的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。
本发明的有益效果在于：
本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测诺如病毒gi型和gii型双重检测方法，能够实现形态学、免疫学、lamp以及单重实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：
(一)耗时短
逆转录重组酶聚合酶扩增技术(rt-rpa)不需将rna转化为cdna再进行扩增反应，只需要将rpa体系与逆转录酶混合，构建rt-rpa反应体系，就可直接以rna为模板，实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应20min即可完成，而rt-pcr、real-timepcr、lamp等技术仅逆转录过程就需要30min的时间，整个反应需要60-90min才可完成。
(二)对仪器平台要求低
rpa反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了诺如病毒gi型和gii型现场应急检测。
(三)特异性好
rpa可识别引物结合区的snp，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而lamp和普通real-timepcr则无法识别snp，这使得rpa检测的特异性明显优于lamp和real-timepcr。本发明所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性。所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的核酸，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。
(四)最低检出限
本发明所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。
(五)成本较低
本发明所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测诺如病毒gi型和gii型方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件仅为一步39度，无需复杂操作。
(六)预防假阴性结果
本发明反应体系中添加的内质控iac，可以有效的提示因为操作失误及反应抑制物等原因造成的假阴性检测结果。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的一种实施方式提供了重组酶聚合酶扩增检测诺如病毒gi型和gii型用引物探针组，其中，包括具有seqidno.1-4所示核苷酸序列的引物，以及，含有seqidno.5-6所示核苷酸序列的探针；
其中，seqidno.5所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有fam发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团bhq1；seqidno.6所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基标记有vic发光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点，第34位碱基标记淬灭基团bhq1。
本公开的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，需要保证引物探针区段分别能够全面覆盖诺如病毒gi型和gii型病毒。而且设计过程中要充分考虑不同目标基因的引物探针在一个反应体系内共扩增的问题，因此，引物探针设计时要综合的考虑到tm值一致性、gc含量均一化，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，而由于rpa对引物长度要求为30-38nt，探针最长45nt，这样的序列容易在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，因此也对引物的设计提出了更高的要求，以保证后期不同引物探针同时扩增的概率。最终获得本公开提供的一套特异的引物探针序列(详见表1)。
表1诺如病毒gi型和gii型rpa检测引物探针汇总表
检测诺如病毒gi型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.5所示。
检测诺如病毒和gii型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.6所示。
检测阳性内对照的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9所示。其中，seqidno.9所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有cy5发光基团，第22位碱基后连接脱碱基位点，第25位碱基标记淬灭基团bhq3，3’末端标记有磷酸盐基团。
在本公开的一种实施方式中，涉及一种重组酶聚合酶扩增(pra)检测诺如病毒gi型和gii型的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总rna；
(2)以所述总rna为模板，并使用本公开所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；
(3)收集fam和vic检测通道荧光信号，得到检测结果；
a)若fam荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有诺如病毒gi型；
b)若vic荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有诺如病毒和gii型。
c)若内质控样本探针的荧光通道无明显扩增曲线，则判定为非特异性扩增。
在本公开的一种实施方式中，用于进行内质控样本检测的引物探针为seqidno.7-8所示核苷酸序列的引物，以及，含有seqidno.9所示核苷酸序列的探针；并且，seqidno.9所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有cy5发光基团，第22位碱基后连接脱碱基位点，第25位碱基标记淬灭基团bhq3，3’末端标记有磷酸盐基团。依据cy5荧光通道有无扩增曲线，判断是否为非特异性扩增。
pra引物探针浓度及反应体系配置如下：
总体系50μl，缓冲液29.5μl，包括3-5u/μl的逆转录酶，2-6u/μl的重组酶，2-6u/μl的聚合酶，12-16mmol/l的醋酸镁，1-105拷贝/μl的rna模板，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5μm，每条探针的最终使用浓度各自为0.08-0.15μm。
在本公开的一种实施方式中，rpa反应的条件包括在37-42℃下恒温扩增15-25min。在本公开的一种特别优选的实施方式中，为了提高反应的灵敏度及特异性，rpa反应的条件包括在39℃下恒温扩增20min。
本公开的检测方法的直接目的不是获得诊断结果和健康状况，而只是对已经脱离人体或动物体的样品进行检测，所获得的仅仅是作为中间结果的信息。
本公开还提供了一种含有前述rpa检测引物探针组的试剂盒。
优选的，所述试剂盒中还含有内质控序列模板。
在本公开的一种实施方式中，所述试剂盒还包括5×反应体系缓冲液、冻干重组酶粉、冻干聚合酶粉、逆转录酶、10×引物探针混合物、阳性对照和超纯水。
以下，通过实施例进一步详细说明本公开。
实施例1
本实施例用于说明诺如病毒gi型和gii型特异性引物探针验证试验。
(1)引物及探针的合成
委托试剂公司合成表2所示的引物探针组1-3。
表2
实施例2特异性验证：
选择以下7个样本作为模拟干扰样本：轮状病毒(源自武汉病毒所,ivcas6.2077)、腺病毒(源自武汉病毒所，ivcas6.0174)、肠道病毒ev71(源自武汉病毒所，ivcas6.0113)、柯萨奇病毒(源自武汉病毒所，ivcas6.2007)、埃可病毒(源自武汉病毒所，ivcas6.2012)、霍乱弧菌(源自生研所，16001)、蜡样芽胞杆菌(源自生研所，63518)的核酸，用于特异性评估，将上述每个样本或者作为特异性检测模板，进行rt-rpa扩增。
rt-rpa反应体系配制：本试剂盒包括阳性内质控在内共有3个检测目标，包括诺如病毒gi、诺如病毒gii以及iac。总体系50μl，向含有rpa冻干酶粉的0.2mltwistampexo(货号：taexo02kit)反应管中加入再水化缓冲液29.5μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)，引物各2μl(10μmol/l)，探针0.5μl(10μmol/l)，逆转录酶1μl(200u/μl)，模板5μl，剩余用水补足。
rt-rpa反应程序如下：选择fam、vic和cy5作为报告基团，每个循环为3个39℃、10s，在循环结束时收集荧光，共进行40个循环。
rt-rpa反应结果判断：空白对照、iac成立，否则视实验结果无效；若fam通道有扩增曲线，则seqidno.1-2的引物对和seqidno.3的探针有非特异性扩增；若vic通道有扩增曲线，则seqidno.4-5的引物对和seqidno.6的探针有非特异性扩增；若cy5通道有扩增曲线，则seqidno.7-8的引物对和seqidno.9的探针有非特异性扩增。
结果显示均未出现非特异性扩增。
实施例3最低检出限验证：
使用浓度均为104拷贝/μl的诺如病毒g1和gii的核酸等比例混合作为模板i、同样方法配制浓度均为103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、2拷贝/μl、100拷贝/μl的2种诺如病毒等比例混合核酸作为模板ii、iii、iv、v、vi。体系配制和rpa反应条件同实施例2特异性评估。使得在反应体系中，病毒的浓度分别为5×104拷贝/体系、5×103拷贝/体系、5×102拷贝/体系、50拷贝/体系、10拷贝/μl和5拷贝/体系。
rt-rpa反应结果判断：空白对照、iac成立，否则视实验结果无效；若fam通道有扩增曲线，则seqidno.1-2的引物对和seqidno.3的探针可检测出该浓度的模板；若vic通道有扩增曲线，则seqidno.4-5的引物对和seqidno.6的探针可检测出该浓度的模板。
结果显示本试剂盒对于目标诺如病毒的最低检出限度均达到了5拷贝/体系。
实施例4样本耐受性检测
以乙醇沉淀法提取诺如病毒gi和gii各10株的rna，提取的rna作为模板，反应体系与反应程序同实施例2。
rt-rpa反应结果判断：空白对照、内质控iac成立，否则视实验结果无效；若fam通道有扩增曲线，则seqidno.1-2的引物对和seqidno.3的探针可检测出该模板；若vic通道有扩增曲线，则seqidno.4-5的引物对和seqidno.6的探针可检测出该模板。
结果显示本发明试剂盒对如上所述的以乙醇简单提取的rna为模板扩增均获得阳性结果，本发明试剂盒对样本的耐受性极好。
实施例5覆盖度分析
以诺如病毒gi和gii各5株毒株分别作为模板进行覆盖度检测，根据如上所述反应体系和反应程序进行扩增。
rt-rpa反应结果判断：空白对照、内质控iac成立，否则视实验结果无效；若fam通道有扩增曲线，则seqidno.1-2的引物对和seqidno.3的探针可检测出该模板；若vic通道有扩增曲线，则seqidno.4-5的引物对和seqidno.6的探针可检测出该模板。
结果显示本发明试剂盒对所有10株诺如病毒均可覆盖检测出。
对比例1
(1)根据表4所示的序列合成对比引物和探针序列。
表3
检测诺如病毒gi型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12所示。
检测诺如病毒和gii型的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15所示。
(2)特异性验证
选择以下7个样本作为模拟干扰样本：轮状病毒(源自武汉病毒所,ivcas6.2077)、腺病毒(源自武汉病毒所，ivcas6.0174)、肠道病毒ev71(源自武汉病毒所，ivcas6.0113)、柯萨奇病毒(源自武汉病毒所，ivcas6.2007)、埃可病毒(源自武汉病毒所，ivcas6.2012)、霍乱弧菌(源自生研所，16001)、蜡样芽胞杆菌(源自生研所，63518)的核酸，用于特异性评估，将上述每个样本作为特异性检测模板，进行rt-rpa扩增。
rt-rpa反应体系配制、rt-rpa反应程序、rt-rpa反应结果判断均与实施例2中的特异性验证相同。结果显示均未出现非特异性扩增。
(3)最低检出限验证：
使用浓度均为104拷贝/μl的诺如病毒g1和gii的核酸等比例混合作为模板i、同样方法配制浓度均为103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、2拷贝/μl、100拷贝/μl的2种诺如病毒等比例混合核酸作为模板ii、iii、iv、v、vi。按照以上所述反应体系分别加入模板i-vi，并按照以上所述的反应程序进行试验。
rt-rpa反应结果判断：较实施例(3)中的最低检出限验证稍差。
结果显示试剂盒对于目标诺如病毒的最低检出限度为10拷贝/体系(即为2拷贝/μl)。
(4)样本耐受性检测
以乙醇沉淀法提取诺如病毒gi和gii各10株的rna，提取的rna作为模板，根据以上所述的反应体系与反应程序进行扩增。
结果显示对比例有2株诺如病毒gi、1株诺如病毒gii漏检。
(5)覆盖度分析
以诺如病毒gi和gii各5株毒株分别作为模板进行覆盖度检测，根据如上所述反应体系和反应程序进行扩增。
结果显示有1株诺如病毒gi、1株诺如病毒gii漏检。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110>北京卓诚惠生生物科技股份有限公司
<120>诺如病毒gi型和gii型检测引物探针组
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